Indagare interazioni proteina-proteina in cellule vive utilizzando il trasferimento bioluminescenza Resonance Energy

Sommario

Le interazioni tra le proteine ​​sono fondamentali per tutti i processi cellulari. Uso bioluminescenza Resonance Energy Transfer, l'interazione fra una coppia di proteine ​​può essere monitorata in cellule vive e in tempo reale. Inoltre, gli effetti delle mutazioni potenzialmente patogeni possono essere valutati.

Abstract

Le prove basate sul trasferimento bioluminescenza Resonance Energy (BRET) forniscono un mezzo sensibile e affidabile per monitorare le interazioni proteina-proteina in cellule vive. BRET è il trasferimento non radiativo di energia da un 'donatore' enzima luciferasi ad una proteina fluorescente 'accettore'. Nella configurazione più comune di questa analisi, il donatore è Renilla reniformis luciferasi e l'accettante è proteina fluorescente gialla (YFP). Poiché l'efficienza del trasferimento di energia è fortemente dipendente dalla distanza, osservazione del fenomeno BRET richiede che il donatore e accettore essere nelle immediate vicinanze. Per testare per una interazione tra due proteine ​​di interesse in cellule di mammifero in coltura, una proteina è espressa come una fusione con luciferasi e la seconda come una fusione con YFP. L'interazione tra le due proteine ​​di interesse può portare il donatore e accettore sufficientemente stretto per trasferimento di energia a verificarsi. Rispetto ad altre tecniche per indagare proteina-proteina ininterazioni, il saggio BRET è sensibile, richiede poca hands-on tempo e poche reagenti, ed è in grado di rilevare le interazioni che sono deboli, transitori, o dipendente per l'ambiente biochimico trovato all'interno di una cella dal vivo. E 'quindi un approccio ideale per la conferma interazioni putativi suggeriti da lievito two-hybrid o spettrometria di massa proteomica studi, e in aggiunta è particolarmente adatto per le regioni mappatura interagire, valutando l'effetto di modificazioni post-traduzionali sulle interazioni proteina-proteina, e valutare l'impatto delle mutazioni identificate nel DNA paziente.

Introduzione

Sia il collegamento classica e sequenziamento di prossima generazione analisi dei disturbi umani stanno rivelando la rilevanza clinica delle proteine ​​coinvolte in una serie di percorsi biologici. E 'spesso il caso che, prima della loro identificazione in tali studi, c'è stata poca o nessuna indagine del ruolo biologico di queste proteine. Una via ancora da cominciare ad esplorare la funzione biologica di una proteina di interesse è quello di identificare quali altre proteine ​​interagisce con nel suo contesto fisiologico. Caratterizzare reti molecolari in questo modo fornisce approfondimenti sui percorsi biologici alla base del fenotipo umano.

Lo screening su larga scala più frequentemente utilizzato approcci per l'identificazione di partner di interazione candidati per le proteine ​​di interesse sono il lievito di screening del doppio ibrido ¹ e massa proteomica basata ^{spettrometria-2.} Questi metodi possono essere molto efficace nel suggerire proteine ​​che interagiscono potenziali, ma arposta vulnerabile a risultati falsi positivi. Pertanto, la conferma di una interazione individuato da lievito doppio ibrido o lo screening spettrometria di massa richiede la convalida dell'interazione con una seconda tecnica. In genere si utilizza un co-immunoprecipitazione o dosaggio pull-down per questo scopo ^3. Uno svantaggio dell'utilizzo di tali tecniche per la validazione è il requisito per la lisi delle cellule, che distrugge le condizioni intracellulari che possono essere essenziali per mantenere certe interazioni proteina. Un secondo svantaggio è che le interazioni deboli o transitori proteine ​​potrebbero essere disturbati durante le fasi di lavaggio. Inoltre, questi saggi richiedono hands-on tempo significativo, sono limitate nel numero di campioni che possono essere elaborati simultaneamente, e spesso richiedono l'ottimizzazione in termini di tempo di reagenti e protocolli.

Per superare alcuni dei problemi associati con esperimenti di co-immunoprecipitazione, diverse analisi sono stati sviluppati sulla base fluorescente e bioluminescent proteine ​​che possono essere utilizzati in cellule vive. I primi tali saggi erano basati su fluorescenza (o Förster) Resonance Energy Transfer (FRET), il trasferimento non radiativo di energia tra due proteine ​​fluorescenti con sovrapposizione di emissione e spettri di eccitazione ^4. L'efficienza del trasferimento di energia è fortemente dipendente dalla distanza, quindi osservazione del fenomeno FRET richiede che i fluorofori donatore e accettore essere nelle immediate vicinanze. Per testare per una interazione tra due proteine ​​di interesse, una proteina è espressa come una fusione con il fluoroforo donatore (proteina fluorescente comunemente ciano; PCP) e la seconda come una fusione con il fluoroforo accettore (proteina fluorescente comunemente giallo; YFP). L'interazione tra le due proteine ​​di interesse può portare i fluorofori donatore e accettore sufficientemente vicini per il trasferimento di energia si verifichi, che si tradurrà in un aumento misurabile l'emissione di luce da accettore YFP relativa al donatore PCP. FRET è riuscita a individuare le interazioni proteina-proteina in cellule vive ^4. Lo svantaggio principale di utilizzare FRET per rilevare le interazioni proteina-proteina è il requisito per illuminazione esterna per l'eccitazione del fluoroforo donatore. Risultati illuminazione esterna in alta sfondo nel segnale di emissione, di eccitazione indesiderata della accettore, e photobleaching del donatore e del fluorofori accettore. Questi effetti riducono la sensibilità del saggio per rivelare le interazioni proteina-proteina.

Una modifica del dosaggio FRET che supera il problema di fondo elevato di illuminazione esterna è la bioluminescenza Resonance Energy Transfer (BRET) dosaggio ^5,6. Nel sistema di BRET il fluoroforo donatore viene sostituito da un enzima luciferasi. Così l'energia per l'eccitazione del fluoroforo accettore viene generato all'interno del sistema per ossidazione di un substrato di luciferasi, rendendo inutile illuminazione esterna. Nella piùconfigurazione comune di questo test, il donatore è Renilla reniformis luciferasi e l'accettore è YFP (per una discussione di donatore alternativo e proteine ​​accettore vedere Pfleger et al. ^5). Di conseguenza, in questo sistema, una proteina di interesse è fuso ad una proteina luciferasi e potenzialmente interagenti per YFP, o viceversa. La prova BRET richiede l'aggiunta di coelenterazina come substrato per la luciferasi. Poiché coelenterazina è cellula-permeabile, è possibile effettuare saggi BRET in cellule vive. Tuttavia, coelenterazina nativo è instabile in soluzione acquosa, e la ripartizione enzima-indipendente di coelenterazina sia riduce la concentrazione di substrato disponibile per il dosaggio e genera autoluminescence, che riduce la sensibilità di misurazione dell'attività di luciferasi. L'uso di BRET in cellule vive è stata facilitata dallo sviluppo di coelenterazines protette, che sono stabili in soluzione acquosa, ma vengono scisse da esterasi citosolicos dopo la diffusione attraverso la membrana cellulare per generare coelenterazina attiva all'interno della cella ^7.

Dopo l'aggiunta di substrato di cellule che esprimono proteine ​​YFP-fusione-luciferasi, e il trasferimento di energia derivante da interazioni proteina-proteina viene quantificata attraverso il monitoraggio delle emissioni di luciferasi e YFP. Poiché le interazioni proteina possono essere monitorati direttamente in cellule vive in piastre multi-pozzetto, il saggio BRET costituisce un metodo semplice e scalabile per la convalida interazioni putativi che costo e in tempi rapidi.

Oltre a convalidare putativi interattori identificati in studi di screening proteomica, il sistema di BRET può essere utilizzato anche per interattori prova candidati derivanti da precedenti studi biochimici e strutturali sulla proteina di interesse. Una volta stabilita l'esistenza di una interazione proteina-proteina (utilizzando la prova BRET o con altre tecniche), esiste il potenziale per la prova BRET sia empnon legato per caratterizzare ulteriormente l'interazione. Ad esempio, le regioni interagenti possono essere mappati generando versioni troncate di proteine, e il coinvolgimento di specifici residui nell'interazione possono essere dimostrati creando mutazioni puntiformi. Inoltre, l'effetto modulatorio di modifiche post-traduzionali o piccole molecole (ad esempio farmaci o ligandi) sulle interazioni proteina-proteina può essere indagata ^8-10.

Il test BRET ha anche un grande potenziale per lo studio mutazioni identificate nel DNA del paziente. Nei casi in cui è stato stabilito un ruolo causativo per una mutazione, studiando l'effetto della mutazione sulle interazioni proteina-proteina mediante BRET può rivelare più sulla eziologia molecolare del fenotipo ^11. Con l'avvento delle metodologie di sequenziamento di prossima generazione, è sempre più comune per le diverse mutazioni potenzialmente dannosi per l'identificazione all'interno di un individuo, nel qual caso non è chiaro quali sono relenenti al fenotipo ^12. In questa situazione la prova BRET può essere utile nel valutare l'impatto di mutazioni sulla funzione della proteina e quindi la loro rilevanza per il disturbo.

Protocollo

1. Creazione di plasmidi

1. Subclone i cDNA per ogni proteina di interesse in entrambi i vettori pluc e pYFP, ​​utilizzando tecniche di biologia molecolare standard (Figura 1). Per i protocolli dettagliati vedere Green et al ^13.
2. Sequenza tutti i costrutti per verificare che le proteine ​​di interesse in frame con la sequenza Luc / YFP senza intermedi codoni di stop.
3. Effettuare saggi funzionali come desiderato per confermare che le proteine ​​di fusione conservano attività biologica. Nel caso qui presentato localizzazione subcellulare delle proteine ​​di fusione YFP è stata accertata mediante microscopia a fluorescenza.
4. Fai plasmidi di espressione appropriata, proteine ​​di controllo Luc e YFP progettando i segnali di targeting rilevanti nei vettori di espressione pluc e pYFP. Nel caso qui presentato, generare Luc e YFP costrutti nucleari mirati inserendo un segnale di localizzazione nucleare nei vettori pluc e pYFP.
5. Rendereun costrutto controllo positivo in cui Luc e YFP si fondono in un singolo polipeptide. Nel caso qui presentato, generare un controllo positivo in cui la sequenza codificante YFP è inserito nel vettore pluc.
6. Selezionare un plasmide riempitivo neutro da utilizzare per equalizzare la massa di DNA in miscele di trasfezione. Utilizzare un plasmide che non ha promotore eucariotico e quindi sarà trascrizionalmente inattivo in cellule di mammifero, come un vettore di clonazione batterica.

2. Preparazione dei Mixes DNA

1. Valutare la concentrazione di tutti i plasmidi descritti nella Sezione 1 basato su assorbanza a 260 nm (1 unità di assorbanza è equivalente a 50 mg / ml di DNA). Determinare la massa molecolare di ciascun plasmide moltiplicando il numero di coppie di basi da 650 bis. Utilizzare la concentrazione e la massa molecolare per calcolare la concentrazione molare di ciascun preparato plasmide. Diluire le preparazioni di DNA plasmide ad una concentrazione di 36 nM. Questi saranno i titoli di lavoroche verranno utilizzati per preparare le miscele DNA per trasfezione.
2. Preparare una miscela di DNA di controllo contenente 1.800 ng di plasmide riempitivo in un volume finale di 20 ml di acqua.
3. Preparare una miscela di DNA di controllo contenente 5 ml di costrutto pluc-controllo. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri.
4. Preparare una miscela di DNA di controllo contenente 5 ml di pluc controllo costrutto e 5 ml di pYFP controllo costrutto. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri.
5. Preparare una miscela di DNA di controllo contenente 5 ml di costrutto di controllo positivo. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri.
6. Preparare la seguente miscela DNA per verificare omodimerizzazione di una proteina di interesse, X. Per ogni miscela di DNA combinare 5 microlitri del relativo pluc costruire e 5 microlitri del pYFP costruire. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri.
   A) pluc-controllo e pYFP-X
   B) pluc-X e pYFP controllo
   C) pluc-X e pYFP-X
7. Preparare la seguente miscela DNA per verificare un'interazione tra una coppia di proteine ​​di interesse, X e Y. Per ogni miscela di DNA combinano 5 microlitri del relativo pluc costruire e 5 ml di pYFP costruire. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri.
   A) pluc-controllo e pYFP-X
   B) pluc-X e pYFP controllo
   C) pluc-controllo e pYFP-Y
   D) pluc-Y e pYFP controllo
   E) pluc-X e pYFP-Y
   F) pluc-Y e pYFP-X

3. Transfezione

1. Harvest subconfluente cellule HEK293 da un pallone 75 centimetri ^2. Diluire il 10% delle cellule totali in 13 ml di terreno di coltura. Pipettare 130 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una biancachiaro a fondo piastra a 96 pozzetti di coltura tissutale. Cellule di coltura per 24 ore.
2. Calcolare il numero di pozzetti da trasfettate moltiplicando il numero di miscele di DNA da 3. Portare terreno privo di siero cultura a temperatura ambiente. Preparare una master mix contenente 6,3 ml di mezzo privo di siero e 0,18 ml di reagente di trasfezione per bene. Mescolare nel vortex e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
3. Preparare miscele di trasfezione con l'aggiunta di 2 ml di miscela di DNA a 20 microlitri di media / trasfezione reagente master mix privo di siero. Non vortex. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
4. Transfect tre pozzi con ciascuna miscela di trasfezione erogazione di 6,5 ml di miscela di trasfezione per pozzetto. Cultura le cellule di un ulteriore 36-48 ore.

4. Misurazione di segnale BRET

1. Sciogliere live-cell substrato luciferasi a 34 mg / ml in DMSO di vortex.
2. Diluire ricostituito live-cell substrato luciferasi a 1:1000 in substrato diluizione medio pri-riscaldato a 37 ° C. Lasciare 50 ml di substrato medio diluizione per pozzetto. Vortex per mescolare. Potrebbe formarsi un precipitato, ma non interferisce con il test.
3. Aspirare il terreno di coltura dalla piastra a 96 pozzetti. Dispensare 50 ml di diluito live-cell substrato di luciferasi in ciascun pozzetto. Cellule di coltura per almeno 2 ore (fino a 24 ore).
4. Rimuovere il coperchio dalla piastra a 96 pozzetti ed incubare la piastra per 10 min a temperatura ambiente all'interno luminometro.
5. Misurare le emissioni da Luc e YFP un bene alla volta. Misurare le emissioni da Luc usando un filtro di blocco lunghezze d'onda superiore a 470 nm. Misurare le emissioni di YFP usando un filtro passa-banda 500-600 nm. Integrare segnali di emissione oltre 10 sec.

5. Analisi dei dati

1. Calcolare la media dei valori di emissione Luc dai 3 pozzi che hanno ricevuto solo il plasmide di riempimento. Sottrarre questo valore da tutte le altre letture di emissione Luc per produrre i valori di emissione Luc fondo-sottratto.
2. Calcolare la media dei valori di emissione YFP dai 3 pozzi che hanno ricevuto solo il plasmide di riempimento. Sottrarre questo valore da tutte le altre letture di emissione YFP per produrre i valori di emissione YFP fondo-sottratto.
3. Per ogni bene, dividere il valore delle emissioni YFP background-sottratto dal valore delle emissioni Luc background-sottratto per dare il rapporto BRET corretta.
4. Calcolare la media dei rapporti BRET corretti dai tre pozzi che sono state trasfettate con il solo plasmide pluc-controllo. Sottrarre questo valore da tutti gli altri rapporti BRET corretti per dare i rapporti BRET corretti.
5. Per ciascuno dei rimanenti gruppi di rapporti BRET corretti, la media dei valori delle tre pozzi trasfettate avere un rapporto BRET finale.

Risultati

Il principio della prova BRET è illustrato nella Figura 2. Il setup dosaggio utilizzato nel corso degli esperimenti presentati qui è mostrata in Figura 3. L'individuazione di un forte segnale BRET da cellule trasfettate con una proteina di fusione luciferasi-YFP confermato che il trasferimento di energia era osservabile in questa configurazione sperimentale (Figura 4).

La nostra ricerca si concentra sul ruolo della famiglia FOXP di repressor...

Discussione

Il design dei costrutti di espressione della proteina di fusione è un passo fondamentale nella creazione del test BRET. Negli esperimenti presentati qui, le proteine ​​di interesse sono stati fusi al C-terminale della luciferasi o YFP. E 'anche possibile, e può essere necessario, per fondere le proteine ​​al N-terminale della luciferasi / YFP. Per alcune proteine, le fusioni possono essere accettate solo sia la N-o C-terminale al fine di evitare interruzioni della struttura e funzione delle proteine. Inoltre, per le...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nanodrop 8000	Nanodrop		Sarà adatto qualsiasi spettrofotometro in grado di leggere assorbanze a 260 nm. La determinazione della massa molecolare del plasmide è fondamentale per calcolare le quantità di DNA da utilizzare nelle miscele di trasfezione.
Piastre da 96 micropozzetti, fondo piatto, bianche	Greiner Bio One	655098	Le piastre bianche riducono la diafonia tra i pozzetti e massimizzano la sensibilità del rilevamento della luminescenza. I pozzetti a fondo chiaro consentono il monitoraggio della densità cellulare. Le piastre devono essere adatte alla coltura cellulare. Se si utilizza un luminometro a lettura dall'alto, il coperchio della piastra deve essere rimosso.
Lettore di piastre Infinite F200Pro con software di controllo	TECAN		Utilizzate i filtri "Blu 1" e "Verde 1" per la misurazione della luminescenza e i set di filtri e lo specchio dicoico per GFP per la misurazione della fluorescenza. È adatto qualsiasi lettore di piastre a lettura dall'alto con la capacità di misurare la luminescenza e la fluorescenza a due colori.
pLuc, pYFP, plasmidi di controllo positivo	N/A	N/A	Plasmidi disponibili presso gli autori su richiesta.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Plasmide filler per l'equilizzazione della massa di DNA in miscele di trasfezione. Qualsiasi plasmide privo di un promotore eucariotico sarebbe adatto.
Celle HEK293	ECACC	85120602	Possono essere adatte altre linee cellulari che trasfettano con ragionevole efficienza.
DMEM, ad alto contenuto di glucosio, con rosso fenolo	Gibco	41966	Questo è il terreno utilizzato per la coltura delle cellule HEK293. Caldo a 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso. Se si utilizza una linea cellulare diversa, sostituire il terreno di coltura qui descritto con un terreno specifico per linea cellulare.
DMEM, alto glucosio, senza rosso fenolo (terreno di diluizione del substrato)	Gibco	21063	Questo è il mezzo di diluizione del substrato utilizzato per la diluizione del substrato della luciferasi (EnduRen) in quanto non contiene rosso fenolo, il che riduce la sensibilità del test. Contiene HEPES per mantenere il pH corretto durante le misure di luminescenza quando le celle sono fuori dall'incubatore CO2. Caldo a 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM viene utilizzato per la diluizione del reagente di trasfezione GeneJuice. Sarebbero adatti anche altri terreni privi di siero. Riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.
Siero fetale bovino	Gibco	10270	Per l'integrazione di terreni di coltura cellulare ad una concentrazione del 10% v/v.
Reagente di trasfezione GeneJuice	Novagen	70967	Se si utilizza una linea cellulare diversa da HEK293, potrebbe essere necessario regolare il rapporto tra il reagente di trasfezione Genejuice e il DNA nelle miscele di trasfezione. Possono essere utilizzati altri reagenti di trasfezione. Se si utilizza un reagente di trasfezione alternativo, potrebbe essere necessario ottimizzare la quantità di DNA utilizzata nelle miscele di trasfezione in base alle istruzioni del produttore.
DMSO	Sigma	D2650	Utilizzare DMSO sterile adatto per la coltura dei tessuti.
Substrato di cellule vive EnduRen	Promega	E6481	Ricostituire EnduRen a 34 mg/ml in DMSO. Dopo la diluizione di EnduRen nel terreno di coltura può formarsi un precipitato. Ciò non interferirà con il test. Conservare EnduRen ricostituito a -20 ° C ed evitare più cicli di gelo-disgelo. Assicurarsi che EnduRen ricostituito sia completamente scongelato prima di diluirlo in terreno di coltura.