Indagare interazioni proteina-proteina in cellule vive utilizzando il trasferimento bioluminescenza Resonance Energy

Sommario

Le interazioni tra le proteine ​​sono fondamentali per tutti i processi cellulari. Uso bioluminescenza Resonance Energy Transfer, l'interazione fra una coppia di proteine ​​può essere monitorata in cellule vive e in tempo reale. Inoltre, gli effetti delle mutazioni potenzialmente patogeni possono essere valutati.

Abstract

Le prove basate sul trasferimento bioluminescenza Resonance Energy (BRET) forniscono un mezzo sensibile e affidabile per monitorare le interazioni proteina-proteina in cellule vive. BRET è il trasferimento non radiativo di energia da un 'donatore' enzima luciferasi ad una proteina fluorescente 'accettore'. Nella configurazione più comune di questa analisi, il donatore è Renilla reniformis luciferasi e l'accettante è proteina fluorescente gialla (YFP). Poiché l'efficienza del trasferimento di energia è fortemente dipendente dalla distanza, osservazione del fenomeno BRET richiede che il donatore e accettore essere nelle immediate vicinanze. Per testare per una interazione tra due proteine ​​di interesse in cellule di mammifero in coltura, una proteina è espressa come una fusione con luciferasi e la seconda come una fusione con YFP. L'interazione tra le due proteine ​​di interesse può portare il donatore e accettore sufficientemente stretto per trasferimento di energia a verificarsi. Rispetto ad altre tecniche per indagare proteina-proteina ininterazioni, il saggio BRET è sensibile, richiede poca hands-on tempo e poche reagenti, ed è in grado di rilevare le interazioni che sono deboli, transitori, o dipendente per l'ambiente biochimico trovato all'interno di una cella dal vivo. E 'quindi un approccio ideale per la conferma interazioni putativi suggeriti da lievito two-hybrid o spettrometria di massa proteomica studi, e in aggiunta è particolarmente adatto per le regioni mappatura interagire, valutando l'effetto di modificazioni post-traduzionali sulle interazioni proteina-proteina, e valutare l'impatto delle mutazioni identificate nel DNA paziente.

Introduzione

Sia il collegamento classica e sequenziamento di prossima generazione analisi dei disturbi umani stanno rivelando la rilevanza clinica delle proteine ​​coinvolte in una serie di percorsi biologici. E 'spesso il caso che, prima della loro identificazione in tali studi, c'è stata poca o nessuna indagine del ruolo biologico di queste proteine. Una via ancora da cominciare ad esplorare la funzione biologica di una proteina di interesse è quello di identificare quali altre proteine ​​interagisce con nel suo contesto fisiologico. Caratterizzare reti molecolari in questo modo fornisce approfondimenti sui percorsi biologici alla base del fenotipo umano.

Protocollo

1. Creazione di plasmidi

1. Subclone i cDNA per ogni proteina di interesse in entrambi i vettori pluc e pYFP, ​​utilizzando tecniche di biologia molecolare standard (Figura 1). Per i protocolli dettagliati vedere Green et al ^13.
2. Sequenza tutti i costrutti per verificare che le proteine ​​di interesse in frame con la sequenza Luc / YFP senza intermedi codoni di stop.
3. Effettuare saggi funzionali come desiderato per confermare che le proteine ​​di fusione conservano attività biologica. Nel caso qui presentato localizzazione subcellulare delle proteine ​​di fusione YFP è stata accertata mediante microscopia....

Risultati

Il principio della prova BRET è illustrato nella Figura 2. Il setup dosaggio utilizzato nel corso degli esperimenti presentati qui è mostrata in Figura 3. L'individuazione di un forte segnale BRET da cellule trasfettate con una proteina di fusione luciferasi-YFP confermato che il trasferimento di energia era osservabile in questa configurazione sperimentale (Figura 4).

La nostra ricerca si concentra sul ruolo della famiglia FOXP di repre.......

Discussione

Il design dei costrutti di espressione della proteina di fusione è un passo fondamentale nella creazione del test BRET. Negli esperimenti presentati qui, le proteine ​​di interesse sono stati fusi al C-terminale della luciferasi o YFP. E 'anche possibile, e può essere necessario, per fondere le proteine ​​al N-terminale della luciferasi / YFP. Per alcune proteine, le fusioni possono essere accettate solo sia la N-o C-terminale al fine di evitare interruzioni della struttura e funzione delle proteine. Inoltre, per le.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nanodrop 8000	Nanodrop		Sarà adatto qualsiasi spettrofotometro in grado di leggere assorbanze a 260 nm. La determinazione della massa molecolare del plasmide è fondamentale per calcolare le quantità di DNA da utilizzare nelle miscele di trasfezione.
Piastre da 96 micropozzetti, fondo piatto, bianche	Greiner Bio One	655098	Le piastre bianche riducono la diafonia tra i pozzetti e massimizzano la sensibilità del rilevamento della luminescenza. I pozzetti a fondo chiaro consentono il monitoraggio della densità cellulare. Le piastre devono essere adatte alla coltura cellulare. Se si utilizza un luminometro a lettura dall'alto, il coperchio della piastra deve essere rimosso.
Lettore di piastre Infinite F200Pro con software di controllo	TECAN		Utilizzate i filtri "Blu 1" e "Verde 1" per la misurazione della luminescenza e i set di filtri e lo specchio dicoico per GFP per la misurazione della fluorescenza. È adatto qualsiasi lettore di piastre a lettura dall'alto con la capacità di misurare la luminescenza e la fluorescenza a due colori.
pLuc, pYFP, plasmidi di controllo positivo	N/A	N/A	Plasmidi disponibili presso gli autori su richiesta.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Plasmide filler per l'equilizzazione della massa di DNA in miscele di trasfezione. Qualsiasi plasmide privo di un promotore eucariotico sarebbe adatto.
Celle HEK293	ECACC	85120602	Possono essere adatte altre linee cellulari che trasfettano con ragionevole efficienza.
DMEM, ad alto contenuto di glucosio, con rosso fenolo	Gibco	41966	Questo è il terreno utilizzato per la coltura delle cellule HEK293. Caldo a 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso. Se si utilizza una linea cellulare diversa, sostituire il terreno di coltura qui descritto con un terreno specifico per linea cellulare.
DMEM, alto glucosio, senza rosso fenolo (terreno di diluizione del substrato)	Gibco	21063	Questo è il mezzo di diluizione del substrato utilizzato per la diluizione del substrato della luciferasi (EnduRen) in quanto non contiene rosso fenolo, il che riduce la sensibilità del test. Contiene HEPES per mantenere il pH corretto durante le misure di luminescenza quando le celle sono fuori dall'incubatore CO2. Caldo a 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM viene utilizzato per la diluizione del reagente di trasfezione GeneJuice. Sarebbero adatti anche altri terreni privi di siero. Riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.
Siero fetale bovino	Gibco	10270	Per l'integrazione di terreni di coltura cellulare ad una concentrazione del 10% v/v.
Reagente di trasfezione GeneJuice	Novagen	70967	Se si utilizza una linea cellulare diversa da HEK293, potrebbe essere necessario regolare il rapporto tra il reagente di trasfezione Genejuice e il DNA nelle miscele di trasfezione. Possono essere utilizzati altri reagenti di trasfezione. Se si utilizza un reagente di trasfezione alternativo, potrebbe essere necessario ottimizzare la quantità di DNA utilizzata nelle miscele di trasfezione in base alle istruzioni del produttore.
DMSO	Sigma	D2650	Utilizzare DMSO sterile adatto per la coltura dei tessuti.
Substrato di cellule vive EnduRen	Promega	E6481	Ricostituire EnduRen a 34 mg/ml in DMSO. Dopo la diluizione di EnduRen nel terreno di coltura può formarsi un precipitato. Ciò non interferirà con il test. Conservare EnduRen ricostituito a -20 ° C ed evitare più cicli di gelo-disgelo. Assicurarsi che EnduRen ricostituito sia completamente scongelato prima di diluirlo in terreno di coltura.