Isolamento dei Piccoli RNA non codificanti dal siero umano

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per l'estrazione di piccoli RNA da siero umano. Abbiamo usato questo metodo per isolare microRNA da siero cancro per uso in matrici di DNA e anche singleplex PCR quantitativa. Il protocollo utilizza fenolo e guanidina tiocianato reagenti con modifiche a produrre RNA di alta qualità.

Abstract

L'analisi di RNA e la sua espressione è una caratteristica comune in molti laboratori. Di rilievo è la nascita di piccoli RNA come microRNA, che si trovano nelle cellule di mammifero. Questi piccoli RNA sono geni regolatori potenti che controllano le vie vitali come la crescita, lo sviluppo e la morte e molto interesse è stato rivolto al loro espressione nei fluidi corporei. Ciò è dovuto alla loro disregolazione in malattie umane come il cancro e il loro potenziale applicazione come biomarker sierici. Tuttavia, l'analisi di espressione miRNA nel siero può essere problematico. Nella maggior parte dei casi la quantità di siero è limitante e siero contiene basse quantità di RNA totale, di cui piccoli RNA costituiscono solo 0,4-0,5% ^1. Così l'isolamento di una quantità sufficiente di RNA qualità dal siero è una sfida importante per i ricercatori di oggi. In questo documento tecnico, si dimostra un metodo che utilizza solo 400 ml di siero umano per ottenere RNA sufficiente sia per matrici di DNA o analisi qPCR. L'unadvantages di questo metodo sono la sua semplicità e la capacità di produrre RNA di alta qualità. Non richiede colonne specializzati per la purificazione dei piccoli RNA e utilizza reagenti generali e hardware presenti nei laboratori comuni. Il nostro metodo si usa un blocco Gel Fase per eliminare la contaminazione fenolo mentre allo stesso tempo cedevole RNA di alta qualità. Abbiamo anche introdurre un ulteriore passo per rimuovere ulteriormente tutti gli agenti inquinanti durante la fase di isolamento. Questo protocollo è molto efficace per isolare rese di RNA totale fino a 100 ng / ml di siero ma può anche essere adattato per altri tessuti biologici.

Introduzione

Negli ultimi anni, c'è stata una spinta crescente a scoprire nuovi biomarcatori per la diagnosi precoce delle malattie umane. Molta attenzione è stata focalizzata sull'uso di piccoli RNA come microRNA ² (miRNA o miR) come potenziali marcatori. Questi piccoli RNA sono presenti nei fluidi corporei come siero e studi hanno dimostrato che sono resistenti alla degradazione e sono stabili in un intervallo di variazione delle condizioni ambientali ^3. Poiché questi miRNA caratteristiche, siero o circolanti sono il biomarcatore ideale ^{4, 5.} Attualmente ci sono due approcci principali per l'isolamento di piccoli RNA da fluidi biolog....

Protocollo

Nota: campioni di siero umano da pazienti sani o pazienti con cancro sono stati ottenuti con il consenso informato ai sensi approvati i protocolli etici umani del Royal Prince Alfred Hospital di Sydney (numero di protocollo X10-0016 e HREC/10/RPAH/24) e l'University of Technology, Sydney. I campioni di siero sono stati raccolti da pazienti prima dell'intervento chirurgico da vari ospedali di Sydney e posti in stoccaggio a -80 ° C.

1. Small RNA Isolation da siero

L'RNA totale è stato preparato da siero umano utilizzando una versione modificata del protocollo LS Tri-Reagent RT.

1. Scongelare ....

Risultati

Figura 1 rappresenta un tipico spettro UV / Vis di RNA isolato dal siero. Da questo profilo abbiamo notato contaminazione proteina a 280 nm con fenolo e contaminanti organici sia a 270 nm e 230 nm, rispettivamente. Residue guanidina tiocianato stato inoltre osservato a 260 nm. Per ridurre i contaminanti, una serie di passaggi di ottimizzazione hanno fatto la procedura RT-LS Tri-reagente standard. Abbiamo aggiunto 5 mg / ml di glicogeno di aumentare sia il rendimento totale RNA e ridurre la contaminazion.......

Discussione

La popolazione dei microRNA costituisce circa il 0,4-0,5% del RNA totale ritrovate nel siero. Inoltre vi è anche un alto contenuto proteico trovato nel siero umano. Per migliorare RNA e ridurre proteine ​​e fenolo contamina abbiamo modificato il tradizionale approccio Chomczynski ⁹ con l'aggiunta di diversi passaggi.

L'RNA totale è stato isolato dal siero utilizzando lo standard Tri-Reagent RT-LS (Centro di Ricerca Molecolare) tuttavia quando eseguite nel nostro laboratori.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tri-Reagente RT LS	Molecular Research Center, USA	TR 118
Senza RNasi H2O	GIBCO Invitrogen	10977-023
Proteinasi K	Finnzymes, Finlandia	EO0491
Provetta ad aggancio di fase pesante	5PRIME	2302830	capacità 2 ml
Provetta DNA Lobind	Eppendorf	0030 108.078	1,5 ml capacità
Glycogen	Invitrogen, USA	10814-010	5 mg/ml
Isopropanolo di grado RNA	Sigma Aldrich, USA	I9516	Centrifuga refrigerata al 100%
	Spettrofotometro UV Vis John Morris
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, USA
Etanolo di grado RNA	Sigma Aldrich, USA	E7023	70%
Bioanalizzatore Agilent 2100	Agilent, Stati Uniti