Articolo metodologico

Un metodo a basso costo per l'analisi sequestro-come attività e il movimento in Drosophila

DOI:

10.3791/51460

⸱

19 febbraio 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Franciscan University of Steubenville, 2Department of Computer Science, Franciscan University of Steubenville

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utilizzando una webcam e una combinazione di programmi di software libero e poco costosi, i modelli di locomotive in Drosophila melanogaster possono essere analizzati per rilevare le differenze nella velocità, la distanza e il tempo delle diverse attività motorie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sistemi di monitoraggio video sono stati ampiamente utilizzati per analizzare Drosophila melanogaster movimento e rilevare diverse anomalie nel comportamento locomotiva. Mentre questi sistemi sono in grado di fornire una serie di informazioni comportamentali, il costo e la complessità di questi sistemi possono essere proibitivo per molti laboratori. Abbiamo sviluppato un saggio a basso costo per misurare il comportamento locomotiva e il movimento sequestro in D. melanogaster. Il sistema utilizza una webcam per catturare immagini che possono essere elaborati utilizzando una combinazione di software poco costoso e libero di seguire la distanza percorsa, la velocità media di movimento e la durata del movimento durante un arco di tempo specificato. Per dimostrare l'utilità di questo sistema, abbiamo esaminato un gruppo di D. melanogaster mutanti, i (BS) paralitici Bang-sensibili, che sono 3-10 volte più suscettibili di attività convulsiva-like (SLA) di tipo mosche selvatici. Usando questo nuovo sistema, siamo stati in grado di rilevare che il BS Mutant insensata botto (BSS) presenta livelli più bassi di locomozione esplorativo in un nuovo ambiente di tipo selvaggio mosche. Inoltre, il sistema è stato utilizzato per identificare il farmaco metformina, che è comunemente usato per trattare il diabete di tipo II, riduce l'intensità della SLA nei mutanti BS.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Data la sua breve durata e gli strumenti genetici robusti disponibili, Drosophila melanogaster è un ottimo sistema modello per studiare l'eziologia di varie malattie e la fisiologia alla base dei vari processi biologici. In molti casi, è vantaggioso misurare gli effetti che le manipolazioni comportamentali, genetici o farmacologici hanno sulla locomozione in questi organismi modello 1,2.

Ci sono una varietà di metodi che sono comunemente usati per misurare il movimento mosca in due dimensioni 3-7. Questi sistemi possono supportare il tracciamento di più mosche contemporaneamente e in grado di misurare velocità, record di lunghezza di percorso e registrare la percentuale di tempo una mosca ha trascorso in movimento. Essi sono stati utilizzati per studiare il movimento in una varietà di contesti inclusi gli effetti dei farmaci sulla locomozione e la natura dimorfismo sessuale della mosca movimento 6-9. Il principale svantaggio di questi sistemi è il costo dei sistemi di rilevamentotem o il relativo software e la fotocamera. In alcuni casi, questo può essere eseguito in migliaia di dollari. Il costo è una preoccupazione particolare per un laboratorio che avrebbe bisogno solo di un uso limitato di tale sistema, per esempio, quantificare i modelli locomotiva di un mutante di recente isolato.

Un metodo più semplice ma meno robusto è quello di utilizzare sistemi che registrare il movimento in base a quante volte una mosca attraversa un percorso fascio di luce infrarossa che viene inserito nel mezzo di un tubo chiuso 10,11. Mentre tali sistemi possono dare informazioni preziose su cicli di movimento e di sonno-veglia, possono sopra o sotto il movimento stima perché non riescono a catturare il percorso effettivo della mosca. Ad esempio, le mosche che presentano un notevole movimento alle estremità del tubo registreranno a partire circolazione vola anche ulteriori metodi ad alta risoluzione sono stati utilizzati per cercare di aggirare queste limitazioni 12.

Più semplice e più economico ancora sono arrampicata dispositivi che misurano geotaxis, il movimento verso l'alto della linea, attraverso un unico tubo o una serie di tubi 2,13. Mentre questi sistemi sono economici e possono facilmente identificare i difetti geotassi, non riescono a catturare molti altri aspetti del movimento che sarebbero di interesse per gli investigatori.

Per molti laboratori, a basso costo robusto sistema di analisi che è semplice da configurare e gestire sarebbe uno strumento vantaggioso per caratterizzare le differenze comportamentali in D. melanogaster ceppi. Qui si descrive un metodo che può essere impostato-up per meno di duecento dollari ed è in grado di dare informazioni sul percorso, la velocità e la durata del movimento della mosca. Per dimostrare l'efficacia del saggio, presentiamo dati che mostrano che esso può essere utilizzato per identificare: 1) un difetto in un locomotore Bang sensibile (BS) mutante che è suscettibile di convulsioni e 2) la capacità del farmaco metformina, che è comunemente usato per trattare il diabete di tipo II, per ridurre l'intensità di attività di sequestro-like (SLA) in due mutanti BS.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Di singoli Mosche per Locomotion Assay

  1. Trasferimento vola toccando delicatamente in singoli flaconi vuoti e tappare le fiale con un tampone di cotone. Consentire mosche di sedersi indisturbati 20-30 minuti prima osservazione. È importante non anestetizzare linea entro le ore prima osservazione del comportamento come studi precedenti hanno trovato esposizione anestesia può alterare il comportamento rispetto alla linea non anestetizzati 14.
  2. Battere delicatamente la mosca dal flaconcino e posizionare singoli mosche sotto un coperchio piatto di Petri diametro 5 centimetri (altezza 5 mm) con piccole feritoie per consentire il passaggio dell'aria. Illuminate da sotto e osservare in linea utilizzando una webcam montata sopra la piastra di Petri.

2. Di singoli Mosche per il sequestro Assay

  1. Concime due giorni vecchi mosche sensibili sequestro sia i media lievito / farina di mais / agar standard o supporti standard, miscelati direttamente con la droga. Per i dati qui presentati, le mosche sono stati alimentati sia 1 gof supporti standard o 1 g di supporti standard, mescolato con 25 mg di metformina.
  2. Dopo le mosche hanno alimentato per due giorni sul supporto o, più droga, trasferirli picchiettando leggermente in singoli flaconi vuoti e tappare le fiale con un tampone di cotone. Lasciare le mosche a sedere indisturbato per 20 minuti prima osservazione. È importante non anestetizzare linea entro le ore prima osservazione del comportamento come studi precedenti hanno trovato esposizione anestesia può alterare il comportamento rispetto alla linea non anestetizzati 14.
  3. Vortex fiale individuali contenenti una mosca su un vortex laboratorio utilizzando il valore massimo per 10 sec. Posizionare la mosca immobilizzato su un foglio bianco di carta bianco direttamente sotto una webcam montato sopra la carta.

3. Video Recording

  1. Registrare il movimento o SLA utilizzando il programma software HandyAvi http://www.azcendant.com/download.htm . Questo programma utilizza la webcamcatturare le immagini basate sulle impostazioni utente.
  2. Selezionare l'opzione di immagini Time-Lapse nella scheda Capture, Quando si apre la finestra, selezionare la webcam come dispositivo di acquisizione. Per la maggior parte degli esperimenti la dimensione del frame video 640 x 480 è sufficiente.
  3. Selezionare Intel IYUV codec per la compressione e scegli 0,1 sec / cornice per il saggio sequestro o scegliere 0,1-0,5 sec / cornice per l'analisi del movimento. Sotto la scheda Avanzate, selezionare creare un file immagine. Bmp per ogni cattura e selezionare una cartella per il programma per memorizzare le immagini che ci vuole (la pila di immagini).
  4. Posizionare una mosca morta sul foglio di carta. Fare clic sulla casella Impostazioni video e regolare le impostazioni nella scheda Impostazioni periferica in modo che ci sia uno sfondo bianco brillante e un chiaro contrasto con la mosca più scura.
  5. Fare clic sul pulsante Start per avviare la registrazione. Una volta che il periodo di registrazione è terminata, fare clic sul pulsante di arresto. Lo stack immagine dovrebbe essere nella cartella selezionata. Nota: Prima della registrazione, verificare che il folder selezionato per la pila di immagini è vuota.

4. Analisi dei dati utilizzando ImageJ

  1. Immagine software di elaborazione ImageJ Open NIH, che può essere scaricato a http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html . Nota: Oltre al download del programma, il plug-in Multitracker deve essere scaricato e installato come indicato al http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html .
  2. Importare la serie di immagini in ImageJ facendo clic sulla scheda File e quindi selezionare Importa → sequenza di immagine.
    1. Selezionare la cartella che contiene la pila di immagini, evidenziare una delle immagini e selezionare Apri. Una finestra di dialogo Sequence Options si aprirà. Fare clic sui nomi ordine numerico e poi selezionare OK e lo stack immagine verrà caricata in ImageJ.
  3. Soglia tutte le immagini in modo che ciascuno costituito da uno sfondo bianco con la mosca essereconvertito in un punto nero. Per iniziare questo processo, convertire l'immagine in un formato a 8 bit selezionando Tipo → 8 bit nella scheda Immagine.
    1. Fare clic sulla scheda Immagine nuovo e selezionare Regola → Soglia. Si aprirà la finestra di dialogo Soglia in cui la soglia tagliato punto può essere regolato.
    2. Scansione attraverso le immagini per vedere se ci sono punti neri in più o se una fetta manca un punto nero. Se questo è il caso, regolare la soglia per alleviare il problema. Di solito la soglia non deve essere regolata come le impostazioni predefinite del programma per un valore adeguato.
      Nota: Ogni diapositiva della catasta deve avere solo un puntino nero che rappresenta la posizione della mosca.
    3. Selezionare Applica nella finestra di dialogo Soglia e Converti in maschera finestra di dialogo si aprirà. Non fare clic su una delle opzioni, ma è sufficiente fare clic su OK per soglia serie di immagini.
  4. Dopo sogliatura la pila di immagini, selezionare la Multitracker plug-in sotto la linguetta Plugins permisurare il movimento della mosca in pixel. Viene visualizzata la finestra di dialogo Tracker oggetto.
    1. Fare clic su tutte le quattro opzioni fornite nella finestra di dialogo e quindi selezionare OK. Il plug-in Multitracker sarà quindi fissare le coordinate per il punto nero in ogni fetta ed elencare questi nella finestra dei risultati, nonché la lunghezza del percorso totale in pixel. La finestra Percorsi fornisce una visualizzazione grafica del percorso fly ha preso.
    2. Copiare il x e y-coordinata list dalla finestra Risultati e incollare i dati in un foglio Excel. Se qualsiasi diapositiva della pila non ha un punto nero, il programma Multitracker arresterà a tale diapositiva. In questo caso, è necessario tornare al passo 4.2 e ri-soglia stack per garantire che i registri volare come un punto nero nella diapositiva in questione.
  5. Per convertire il tracciato lunghezze da pixel a cm, prendere un'immagine separata di due punti a distanza di un cm separatamente su un pezzo di carta bianca.
    1. Seguire le indicazioni soprapassi (3.1-4.4.2), per determinare le coordinate x, y del pixel per i due punti e utilizzare queste informazioni per determinare il numero di pixel corrispondenti a un cm. Questo fattore di conversione viene utilizzata nel passaggio cinque per generare dati di movimento in cm. Nota: Una volta fatto questo, è importante mantenere la telecamera fissa per tutte le registrazioni future. Ogni volta che la fotocamera viene spostata o regolata, si ha la necessità di ripetere questo passo per convertire i pixel per cm.
    2. La lunghezza del percorso che viene generato dal plug-in Multitracker sopravvaluta movimento perché lievi fluttuazioni nella posizione del corpo e intensità luminosa / riflessione influenzeranno le dimensioni e il centro del punto nero che viene generato quando sogliatura le immagini. Questo rumore deve essere rimosso al fine di ottenere una stima accurata del movimento mosca.

5. Analisi dei dati con Excel

  1. Rimuovere il rumore dai dati registrati importando la serie di coordinate x, y generato dal pr MultitrackerOgram in Analisi Fly, un programma Visual Basic di Excel creato dagli autori. (Il programma è disponibile contattando gli autori.)
  2. Fare clic sul Click Me pulsante e selezionare un valore di soglia di cut-off. Selezionare un valore di soglia di 0,5 cm / sec per l'analisi SLA o selezionare un valore compreso tra 0,1-0,3 cm / s per l'analisi del movimento. Fare clic su OK e il programma calcolerà la velocità, il tempo e la distanza di movimento. Nota: Il programma utilizza un'analisi finestra scorrevole per valutare i dati sequenziali 0,5-1,0 sec bidoni e calcola la velocità durante quella finestra. Tutto ciò al di sopra del valore soglia definito dall'utente viene trattato come movimento mosca.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La tecnica qui descritta è stata utilizzata in precedenza per analizzare differenze di SLA nei mutanti BS Drosophila 1. I risultati qui presentati riguardano i ceppi BS facilmente scioccato (EAS), Bang insensata (BSS), e ko tecnico (TKO). Il locus EAS codifica una chinasi etanolammina coinvolto nella sintesi fosfatidil etanolammina 15 e il locus tko codifica una riboprotein mitocondriale 16. La mutazione bss è un allele del (para)...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nell'esame locomotore o schemi di movimento in Drosophila, è utile essere in grado di estrarre informazioni riguardanti la distanza percorsa, la velocità di movimento e il percorso di taglio. Per estrarre queste informazioni, costose attrezzature è stato tradizionalmente impiegato che spesso proibitivo per i laboratori più piccoli o laboratori che intendono utilizzare tali dosaggi parsimonia 4,8,9.

Il test qui descritto può essere usato per determinare la distanza per...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori desiderano inoltre esprimere grazie a Kris Burner, Stephen McKinney, Laura Tobin, Jenny Gilbreath, Ashley Olley, Megan Hoffer, e Megan Hyde per il loro lavoro di messa a punto questo test.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
WebCamLogitechPro900Qualsiasi webcam di qualità sarà sufficiente.
Software time-lapse HandiAVISoftware Azcendant L'ultimaversione è disponibile all'indirizzo http://www.azcendant.com/
ImageJNIHL'ultima versione è disponibile all'indirizzo
http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html Multiracker Plug-InNIHL'ultima versione è disponibile all'indirizzo
http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html VortexerVWRVortex Genie 2La maggior parte dei vortici di dimensioni standard come il Vortex Genie 2 sono sufficienti.
Coperchio per piastre di Petri da 5 cmLabM LimitedD011I coperchi per piastre di Petri più piccoli o più grandi possono essere utilizzati per un saggio in arena in movimento.
Scatola luminosasuCostruita con materiale di scarto. L'illuminazione viene utilizzata per il saggio di locomozione. A seconda dell'illuminazione della stanza, è possibile eseguire il test senza la scatola luminosa.
misura

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stone, B., Evans, L., Coleman, J., Kuebler, D. Genetic and pharmacological manipulations that alter metabolism suppress seizure-like activity in. 1496, 94-103 (2013).
  2. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 58, 1112-1119 (1967).
  3. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (24), (2009).
  4. Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. The EthoVision video tracking systema tool for behavioral phenotyping of transgenic mice. Physiol. Behav. 73, 731-744 (2001).
  5. Kohlhoff, K. J., Jahn, T. R., Lomas, D. A., Dobson, C. M., Crowther, D. C., Vendruscolo, M. The iFly tracking system for an automated locomotor and behavioural analysis of Drosophila melanogaster. Integr. Biol. 3, 755-760 (2011).
  6. Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors. PLoS ONE. 7, (2002).
  7. Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. High-Resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
  8. Martin, J. R. A portrait of locomotor behaviour in Drosophila determined by a video-tracking paradigm. Behav. Processes. 67, 207-219 (2004).
  9. Meunier, N., Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Regulation of feeding behaviour and locomotor activity by takeout in Drosophila. J. Exp. Biol. 210, 1424-1434 (2007).
  10. Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13, 489-499 (2012).
  11. Catterson, J. H., Knowles-Barley, S., James, K., Heck, M. M., Harmar, A. J., Hartley, P. S. Dietary modulation of Drosophila sleep-wake behaviour. PLoS One. 5, (2010).
  12. Donelson, N., Kim, E. Z., Slawson, J. B., Vecsey, C. G., Huber, R., Griffith, L. C. High-Resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the ''Tracker'' program. PLos ONE. 7, (2012).
  13. Duboff, B., Fridovich-Keil, J. L. Mediators of a long-term movement abnormality in a Drosophila melanogaster model of classic galactosemia. Dis. Model Mech. 5, 796-803 (2012).
  14. Seiger, M. B., Kink, J. F. The effect of anesthesia on the photoresponses of four sympatric species of Drosophila. Behav. Genet. 23, 99-104 (1993).
  15. Pavlidis, P., Ramaswami, M., Tanouye, M. A. The Drosophila easily shocked gene: a mutation in a phospholipid synthetic pathway causes seizure, neuronal failure, and paralysis. Cell. 79, 2333 (1994).
  16. Royden, C. S., Pirrotta, V., Jan, L. Y. The tko locus, site of a behavioral mutation in D. melanogaster, codes for a protein homologous to prokaryotic ribosomal protein S12. Cell. 51, 165-173 (1987).
  17. Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genetics. , 187-534 (2011).
  18. Hardie, D. G. Role of AMP-activated protein kinase in the metabolic syndrome and in heart disease. FEBS Lett. 582, 81-89 (2008).
  19. Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochem. Pharma. 62, 439-446 (2001).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Analisi del movimento di Drosophilatracciamento tramite webcamelaborazione con Image Jsoftware di analisi delle moschecomportamento locomotoremutanti bang sensitivetrattamento con metforminaregistrazione videoanalisi dei dati

Articoli correlati