Articolo metodologico

Valutazione della funzione vascolare nei pazienti con malattia renale cronica

DOI:

10.3791/51478

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16 giugno 2014

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1Division of Renal Diseases and Hypertension, University of Colorado, Denver, 2Department of Integrative Physiology, University of Colorado, Boulder

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il grado di disfunzione vascolare e contribuendo meccanismi fisiologici può essere valutata in pazienti con malattia renale cronica, misurando brachiale dilatazione dell'arteria flusso-mediata, velocità di propagazione dell'onda aortica e vascolare espressione della proteina delle cellule endoteliali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I pazienti con malattia renale cronica (CKD) hanno aumentato significativamente il rischio di malattia cardiovascolare (CVD) rispetto alla popolazione generale, e questo è solo parzialmente spiegata da fattori di rischio cardiovascolare tradizionali. Disfunzione vascolare è un importante fattore di rischio non tradizionale, caratterizzato da disfunzione endoteliale vascolare (più comunemente valutata come deteriorato endotelio-dipendente dilatazione [EDD]) e irrigidimento delle grandi arterie elastiche. Mentre esistono varie tecniche per valutare EDD e rigidità delle grandi arterie elastiche, il più comunemente utilizzati sono la dilatazione dell'arteria brachiale flusso-mediata (FMD BA) e la velocità di propagazione dell'onda aortica (aPWV), rispettivamente. Entrambe queste misure non invasive della disfunzione vascolare sono predittori indipendenti di eventi cardiovascolari futuri in pazienti con e senza malattia renale. I pazienti con insufficienza renale cronica dimostrano sia compromessa l'afta epizootica BA, e aumento aPWV. Mentre gli esatti meccanismi mediante i quali disfunzione vascolare sviLops in CKD sono completamente compresi, aumento dello stress ossidativo e una conseguente riduzione di ossido nitrico (NO) biodisponibilità contribuiscono in modo rilevante. Cambiamenti cellulari a stress ossidativo possono essere valutate attraverso la raccolta di cellule endoteliali vascolari dalla vena antecubitale e misurando l'espressione di proteine ​​marker di stress ossidativo mediante immunofluorescenza. Forniamo qui una discussione di questi metodi per misurare l'afta epizootica BA, aPWV e vascolari espressione della proteina delle cellule endoteliali.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malattia renale cronica (CKD) è un importante problema di salute pubblica che ha raggiunto proporzioni epidemiche, che colpisce ~ 11,5% della popolazione nel solo 1 negli Stati Uniti. Il rischio di morte cardiovascolare o di un evento cardiovascolare nei pazienti con insufficienza renale cronica è significativamente aumentata rispetto alla popolazione generale 2-4. Anche se i pazienti con insufficienza renale cronica presentano un'alta prevalenza di fattori tradizionali di rischio cardiovascolare, questo spiega solo una parte del loro maggiore incidenza di malattie cardiovascolari (CVD) 5. Disfunzione vascolare è un importante fattore di rischio cardiovascolare non tradizionale guadagnando maggiore riconoscimento nel campo della nefrologia 6-9.

Mentre molte modifiche che contribuiscono allo sviluppo di disfunzione arteriosa, tra quelli di maggiore interesse sono lo sviluppo di disfunzione endoteliale vascolare, più comunemente valutata come deteriorato dilatazione endotelio-dipendente (EDD), e irrigidimento del laRGE arterie elastiche 10. Esistono varie tecniche per valutare EDD e rigidità delle grandi arterie elastiche, ma il più comunemente usato sono brachiale dilatazione flusso-mediata FMD BA e la velocità di propagazione dell'onda aortica (aPWV), rispettivamente. Un'altra tecnica comunemente usata per valutare EDD sta misurando avambraccio risposta il flusso di sangue ad agenti farmacologici come l'acetilcolina mediante occlusione venosa pletismografia 11,12. Tuttavia, questa metodologia richiede il cateterismo dell'arteria brachiale, che è più invasiva rispetto FMD BA e può essere controindicato nei pazienti con insufficienza renale cronica. Una tecnica alternativa per valutare la rigidità arteriosa è misurare la compliance arteriosa locale (l'inverso della rigidezza) della carotide, anche se questo non è così ampiamente usato o convalidato con endpoint clinici come aPWV 13.

I pazienti con insufficienza renale cronica dimostrano sia compromessa l'afta epizootica BA 14-16 e una maggiore velocità di propagazione dell'onda aortica aPWV 13,17,18, anche prima che necessitano di dialisi. Soprattutto dal punto di vista clinico, entrambe queste misure non invasive della disfunzione vascolare sono predittori indipendenti di futuri eventi cardiovascolari e mortalità sia in pazienti con CKD 19-21, così come in altre popolazioni 22-26. Queste tecniche possono essere applicate allo studio di diverse popolazioni a rischio di CVD, inclusi i pazienti con insufficienza renale cronica.

I meccanismi esatti con cui la disfunzione arteriosa si sviluppa in CKD non sono completamente comprese; Tuttavia, l'ossido di azoto ridotto (NO) biodisponibilità è un contributo critico 27-30 e un meccanismo comune di entrambi EDD compromessa e una maggiore rigidità arteriosa 10,31. In CKD, stress ossidativo è aumentato e contribuisce alla riduzione NO biodisponibilità 32-34. Lo stress ossidativo è definito come eccessivo biodisponibilità delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) relativi alle difese antiossidanti. Stimoli fisiologici, incLuding segnalazione infiammatoria, promuovere sistemi enzimatici ossidanti per la produzione di ROS, tra cui anione superossido (O 2 ● -) (ad esempio, l'ossidante dell'enzima NADPH ossidasi.) 35. Produzione di superossido conduce infine alla riduce biodisponibilità di ossido nitrico (NO).

Alterata NO biodisponibilità può a sua volta contribuire allo sviluppo di CKD, come disfunzione endoteliale è un predittore indipendente di incidente CKD 36. Questo è coerente con i dati nell'animale indicano che eNOS inibizione induce ipertensione (sistemica e glomerulare), ischemia glomerulare, glomerulosclerosi, e tubulo-interstiziale pregiudizio 37. Infatti, ridotto appare necessario NO biodisponibilità per lo sviluppo e la progressione della malattia renale sperimentale che imita la malattia umana, suggerendo un ruolo chiave per la disfunzione endoteliale in CKD umana 38,39.

Marker di stress ossidativo vascolare possono essere valutati in vascular cellule endoteliali raccolti da soggetti umani di ricerca, utilizzando una tecnica originariamente sviluppata da Colombo et al. 40 e modificato Guarnizioni et al 41-43. Usando 2 sterili J-fili, le cellule sono raccolti dalla vena antecubitale, recuperate, fisso, e successivamente identificati come cellule endoteliali e analizzati per l'espressione di proteine ​​di interesse mediante immunofluorescenza.

Forniamo qui una discussione di questa metodologia che può essere utilizzata per a) misura FMD BA; b) misurare aPWV; c) misurare vascolare espressione proteica delle cellule endoteliali dei marcatori di stress ossidativo. L'attenzione si concentra su pazienti con CKD, che non richiedono dialisi cronica.

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Protocollo

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Questo protocollo segue le linee guida del Colorado multipla Institutional Review Board (COMIRB).

1. Preparazione per il test Session

  1. I partecipanti dovrebbero seguire queste restrizioni per misure più accurate: 12 hr veloce dal cibo e caffeina, 12 ore moderazione da esercizio fisico, 12 ore moderazione dal fumo, se del caso,> 4 moderazione emivita dai farmaci, se possibile (potrebbe non essere fattibile in un popolazione come i pazienti con insufficienza renale cronica), e le donne in pre-menopausa dovrebbero essere testati in 1-7 giorni del ciclo mestruale per ridurre al minimo le influenze ormonali.
  2. Preparare 500 ml di tampone di dissociazione aggiungendo 2 ml di 0,5 M di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,05 g di eparina (180 unità USP / mg) e 2,5 g di albumina di siero bovino a 476,8 ml di tampone fosfato salino (PBS) a pH di 7,4. Questo può essere conservato a 4 ° C per diversi mesi.
  3. Accendere ultrasuoni, computer e il emodinamico non invasivoWorkstation (NIHem; attrezzature rigidità arteriosa). Collegare i cavi in ​​uscita dalla ecografia alla scatola grilletto onda R computer.

2. Raccolta ed elaborazione di cellule vascolari endoteliali

  1. Un infermiere o un medico esperto esegue la raccolta (passi 2,2-2,5, 2.7) e un ricercatore raccoglie e tratta i fili (passi 2,6, 2,8-2,19)
  2. Preparate il sito antecubitale con un antisettico topico, applicare un laccio emostatico, individuare vena, e cannulate con un catetere G 18. Posizionare un adattatore heplock sull'estremità del IV.
  3. Indossare guanti sterili e mettere teli sterili fenestrated sul sito.
  4. Mettere 2 J-fili delle tende. Tirare l'arco della "J" Srotolare la forma "J" di entrambi i fili.
  5. Stappare la heplock e mangimi J-wire in vena di circa 8 centimetri. Spingere avanti e indietro diverse volte prima di rimuovere il filo. Evitare di sangue lordo sul filo.
  6. Utilizzare tronchesi per tagliare i fili in modo da adattarsi in unProvetta conica da 50 ml contenente ~ 30 ml di tampone di dissociazione
  7. Ripetere passo 2.5 per secondo filo.
  8. Ripetere passo 2.6 per il secondo filo. Tubo di ritorno al laboratorio bagnato.
  9. Stringere i fili con un paio di pinze e tenere i fili all'interno del tubo, ma soprattutto la soluzione. Per 10 min, utilizzare un pipetter motorizzato per raccogliere ripetutamente il buffer dissociazione dalla provetta conica da 50 ml e rilasciarlo in modo che corre per tutta la lunghezza dei fili per risciacquare e vibrare i fili, quindi agitare il fluido in eccesso da fili nel tubo.
  10. Centrifugare per 7 minuti a 400 xg e 4 ° C.
  11. Preparare la soluzione di formaldeide in un foglio coperto tubo unendo 100 ml di soluzione di formaldeide + 900 ml di PBS.
  12. Rimuovere lentamente il tubo da centrifuga, accendere la pompa del vuoto, mettere un puntale sulla estremità del tubo di aspirazione e lasciare ~ 400 ml nella provetta, passare l'aspirapolvere fuori il resto senza disturbare il pellet.
  13. Coprire con un foglio e una pipetta 1 ml di soluzione di formaldeide inil tubo per fissare il campione. Non risospendere. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
  14. Preparare 8 scivoli, mediante l'etichettatura con oggetto e informazioni visita di studio e disegnare un ovale su ogni vetrino con una penna pap.
  15. Aggiungere 15 ml di PBS, risospendere e centrifugare per 5 minuti a 400 xg e 4 ° C.
  16. Ripetere il passaggio 2.15, aggiungere 12 ml di PBS, risospendere, e centrifugare per 6 min a 400 xg e 4 ° C.
  17. Rimuovere lentamente il tubo da centrifuga, accendere la pompa del vuoto, mettere un puntale sulla estremità del tubo di aspirazione e lasciare ~ 2 ml nella provetta, passare l'aspirapolvere fuori il resto senza disturbare il pellet.
  18. Risospendere e pipetta in modo uniforme le 8 diapositive nelle aree ovali.
  19. Posto in incubatore a 37 ° C per 5 ore e poi conservare a -80 ° C fino al momento dell'analisi (campioni andrà bene per molti anni).

3. Valutazione della FMD BA e aPWV

  1. Avere ricerca sul cambiamento soggetto in bicchierini usa e getta e hanno him / lei supina si trovano in una zona tranquilla, dim, camera climatizzata.
  2. Collocare il numero appropriato di ECG per l'ecografia specifico e il dispositivo rigidità arteriosa (questa procedura utilizza la non invasiva emodinamico Workstation [NIHem] per misurare la rigidità arteriosa, che richiede 4 elettrodi), e la pressione sanguigna bracciale in materia.
  3. Dopo 20 minuti, iniziare a valori di pressione sanguigna. Effettuare almeno 3, e ripetere fino a misure sono all'interno di 5 mmHg, riposo 2 minuti tra ogni lettura.
  4. Inizia tonometria palpando per il polso brachiale e mettendo il tonometro a registrare forme d'onda brachiale utilizzando il programma software.
  5. Ripetere l'operazione per le arterie radiali, femorali e carotidee.
  6. Misurare la distanza da ognuno di questi luoghi dalla tacca supersternal utilizzando un metro a nastro (brachiale, radiale e carotideo) e righello custom / pinza (femorale).
  7. Calcola carotide-brachiale, carotideo-radiale e carotidea-femorale (aPWV) utilizzando il programma software.
  8. Luogosangue dell'avambraccio polsino di pressione appena distale al processo olecranico e registrare almeno 10 cicli cardiaci di immagini ecografiche brachiale base e misurazioni della velocità del flusso sanguigno, con un software vascolare impostare la modalità per attivare. Un braccio meccanico può essere usato per stabilizzare la sonda ecografica se desiderato.
  9. Gonfiare avambraccio bracciale della pressione arteriosa a 250 mmHg e cominciare timer. Istruire partecipante a rimanere molto ancora.
  10. Inizia velocità di registrazione con una serie di software vascolare modalità per attivare quando il timer si legge 04:45. Rilasciare il grilletto il bracciale alle 5:00 e cambiare gli ultrasuoni per registrare B-mode (diametro) immagini quando l'orologio segna 5:10.
  11. Si effettua la registrazione fino a quando l'orologio segna 7:00.
  12. Record almeno 10 cicli cardiaci di base di immagini dell'arteria brachiale ultrasuoni con software vascolare impostare la modalità di innescare.
  13. Prendere la pressione del sangue del soggetto. Se la pressione arteriosa sistolica> 100 mmHg, collocare 0,4 mg di nitroglicerina sublinguale sotto il soggetto &# 39; s lingua e cominciare timer, a meno che il paziente ha un'altra controindicazione.
  14. Iniziare a registrare B-mode (immagini di diametro) quando l'orologio segna 3:00 con il software vascolare impostare la modalità per attivare.
  15. Interrompere la registrazione quando l'orologio segna 8:00.
  16. Monitorare la pressione sanguigna fino a tornare al valore iniziale

Preparazione umano Vena ombelicale cellule endoteliali (HUVEC) vetrini di controllo 4.

  1. Crescere HUVECs al passaggio 5-6 e ~ 80% di confluenza.
  2. Trypsinize con 3 ml di tripsina o tutto ciò che è necessario per il piatto / boccetta.
  3. Neutralizzare tripsina usando un volume uguale di soluzione di tripsina neutralizzante.
  4. Centrifugare a 200 xg per 5 min ~ e rimuovere tripsina e soluzione neutralizzante da vuoto.
  5. Risospendere in ~ 10 ml di PBS per lavare.
  6. Centrifugare a 200 xg ~ 5 min. Rimuovere PBS.
  7. Rimuovere PBS e fissare nel 1800 microlitri di PBS + 200 ml di formaldeide.
  8. Risospendere in PBS (~ 10 ml).
  9. Centrifugare a 200 xg ~5 min. Rimuovere PBS, risospendere in un volume adeguato di aggiungere ~ 200 microlitri per vetrino.
  10. Conservare i vetrini a -80 ° C fino al momento dell'analisi (campioni andrà bene per molti anni).

5. Colorazione di cellule vascolari endoteliali

  1. Prendete le diapositive di -80 ° C freezer ed attendere 5 minuti a temperatura ambiente (questa procedura è per un lotto di 10 diapositive, tra cui uno scivolo di controllo HUVEC).
  2. Eliminare l'acqua in eccesso con un compito delicato wipe (non toccare il centro della slitta).
  3. Re-idratare i vetrini aggiungendo alterata PBS a ogni diapositiva e lasciare per 10 min.
  4. Mentre le diapositive sono in piedi, preparare del siero di asino 5% e altre soluzioni.
    1. Preparare siero asino 5% con l'aggiunta di 300 ml di siero asino per 5.700 ml di PBS alterato (ad un pH di 7,4) per un massimo di 10 diapositive (aumentare questo importo per di più).
    2. Diluire l'anticorpo primario di interesse in 1,000 ml di siero 5%. Ad esempio, nitrotirosina e NADPHossidasi (1:300 e 1:1,500) potrebbero essere utilizzati come marcatori di stress ossidativo.
    3. Preparare AF568 secondario diluendo 5 ml di AF568 a 1.500 μll di siero 5%.
    4. Preparare VE caderina diluendo 2 ml di VE caderina a 1.000 ml di siero 5%.
    5. Preparare AF488 diluendo 5 ml di VE caderina a 1.000 ml di siero 5%.
    6. Tenere AF568, VE caderina e AF488 sotto un foglio attraverso l'intero processo e quindi inserire il rocker a 4 ° C frigorifero durante la preparazione di vetrini.
  5. Dopo 10 min di reidratazione, scivoli asciutti con un compito delicato pulire.
  6. Aggiungi siero asino 5% per 60 minuti e mettere un pezzo di pellicola di paraffina plastica sopra la zona cerchiata per garantire una copertura completa della sostanza chimica.
  7. Eliminare la pellicola di paraffina plastica e scivoli asciutti con un compito delicato pulire. Non lavare. Aggiungere l'anticorpo primario per 60 min e posizionare un pezzo di pellicola plastica paraffina sull'area cerchiata garantirecopertura completa della chimica.
  8. Eliminare il film di paraffina plastica, sciacquare con alterata PBS dalla bottiglia spruzzo e immergersi in colonne di scorrimento per 5 min. Mentre le diapositive sono ammollo, spostarli in una stanza buia. Lavorare al buio per tutti i passaggi rimanenti.
  9. Diapositive a secco con Kimwipes, aggiungi AF568 (anticorpo secondario) per 45 minuti e mettere un pezzo di pellicola di paraffina plastica sopra la zona cerchiata per garantire una copertura completa della sostanza chimica. Coprire dalla luce.
  10. Eliminare la pellicola di paraffina plastica nel contenitore per rifiuti biologici. Risciacquare con PBS alterato dalla bottiglia schizzo, e poi immergere in colonne per 5 min.
  11. Diapositive a secco con Kimwipes, quindi aggiungere VE caderina per 60 minuti e mettere un pezzo di pellicola di paraffina plastica sopra la zona cerchiata per garantire una copertura completa della sostanza chimica. Coprire dalla luce.
  12. Eliminare la pellicola di paraffina plastica nel contenitore per rifiuti biologici. Risciacquare con PBS alterato dalla bottiglia schizzo, e poi immergere in colonne per 5 min.
  13. Diapositive a secco conun compito delicato wipe, aggiungi AF488 per 30 minuti e mettere un pezzo di pellicola di paraffina plastica sopra la zona cerchiata per garantire una copertura completa della sostanza chimica. Coprire dalla luce.
  14. Eliminare la pellicola di paraffina plastica nel contenitore per rifiuti biologici. Risciacquare con PBS alterato dalla bottiglia schizzo, e poi immergere in colonne per 5 min.
  15. Diapositive a secco con un compito delicato pulire e lasciare i vetrini ad asciugare per 20 min. Coprire dalla luce.
  16. Aggiungere una goccia solo fluoroshield mezzo di montaggio con 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole cloridrato (DAPI) per ogni diapositiva e coprire ciascuna con una scivolata di copertura.
  17. Porre i vetrini in 4 ° C frigorifero coperto con un foglio. Imaging deve essere completata entro 48 ore.

6. Imaging e analisi delle cellule vascolari endoteliali

  1. Preparare microscopio per l'imaging cellule endoteliali colorate secondo le specifiche del microscopio specifico. Un unico tecnico cieco dovrebbe analizzare qualsiasi proteina particolare per un pipistrelloch di cellule.
  2. Scansione di diapositive in modo sistematico. Identificare le cellule endoteliali dalla colorazione positiva per VE caderina e confermare l'integrità nucleare colorazione positiva per DAPI.
  3. Immagine 30 cellule per vetrino per la successiva analisi. Ripetere l'operazione per ogni diapositiva nel batch macchiato, compreso il HUVEC.
  4. Analizzare l'intensità della colorazione per l'anticorpo primario di interesse utilizzando un software qualitativa.
  5. Per minimizzare il possibile effetto confondente di differenze di colorazione intensità tra diverse sessioni di colorazione, i valori del rapporto come rapporto di espressione proteica nelle cellule endoteliali raccolti alla stessa espressione proteica in HUVEC.

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Risultati

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FMD BA è quantificato come la variazione di picco di diametro dell'arteria brachiale seguente iperemia reattiva. Così, il diametro a riposo viene confrontato al diametro successivo alla fine di un periodo di 5 min sfigmomanometro occlusione (Figura 1). Pannello A mostra un'immagine rappresentativa ecografia dell'arteria brachiale, quindi su Pannello B mostra un grafico del onda R cambiamento gated di diametro dalla versione bracciale a 2 minuti dopo, come ottenuto utilizzando il software disp...

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Discussione

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Ottenere risultati accurati per l'afta epizootica BA e aPWV richiede l'acquisizione di immagini ecografiche di alta qualità e le forme d'onda di pressione, rispettivamente. Al centro di questo è la formazione appropriate e continue e utilizzo di ogni tecnica dall'operatore 44. Inoltre, è fondamentale per controllare a molte variabili esterne che possono influenzare i risultati possibili standardizzando la sessione di test (ad esempio, prima 12 hr veloce, camera climatizzata...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano Nina Bispham per la sua assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Heart Association (12POST11920023), e il NIH (K23DK088833, K23DK087859).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
J-wireSt. Jude4045842 per collezione
Pantaloncini monouso (MediShorts)Quick Medical4507
Postazione di lavoro emodinamica non invasiva (NIHem)Cardiovascualr EngineeringN/AInclude righello personalizzato.  Un sistema alternativo è lo Sphygmocor
UltrasoundG.E.Modello: Vivid7 DimensionUsiamo un G.E., ma ci sono molte aziende e modelli
di software vascolare (Vascular Imager) Applicazioni di imaging medicoN/A
Scatola di innesco R-waveApplicazioni di imaging medicoN/A
Sistema di gonfiaggio rapido del braccialeHokansonsu misura Modello: Hokanson E20
Bracciale per la pressione sanguigna dell'avambraccioHokansonN/Apersonalizzato con vescica da 6,5 x 34 cm...
HUVECsInvitrogrenC-015-5C
Siero d'asinoJackson017-000-121
Pap penResearch Products International195505
VE CadherinAbcamab33168
AF568Life TechnologiesA11011dipende dalle specifiche di microscpe 
AF488Life TechnologiesA11034dipende dalle specifiche di microscpe 
Anticorpo nitrotirosinaAbcamab7048
NADPH ossidasi anticorpoUpstate07-001
DAPI VectorH-1200
Salvietta delicata (Kimwipe) Fisher Scientific06-666-A
Film plastico di paraffina (parafilm) Fisher Scientific13-374-10
Microscopio confocale Modello Olympus: FV1000 FCS / RICSesistono molte opzioni
bracciale

Riferimenti

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