A Modified<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion test per determinare il ruolo potenziale di ormoni, citochine e / o fattori di crescita nella mediazione Cancer Invasion cellulare

Sommario

Questo articolo video descrive un metodo in vitro modificato per esaminare il ruolo di ormoni, citochine e/o fattori di crescita nel guidare l'invasione delle cellule tumorali.

Abstract

Siero del sangue funge da chemoattractant verso il quale le cellule tumorali migrano e invadono, facilitando il loro intravasation in microvasi. Tuttavia, le molecole reali verso cui le cellule migrano rimangono sfuggente. Questo test invasione modificato è stato sviluppato per identificare gli obiettivi che guidano la migrazione delle cellule e l'invasione. Questa tecnica confronta l'indice invasione in tre condizioni per determinare se un ormone specifico, fattore di crescita, citochine o gioca un ruolo nel mediare il potenziale invasivo di una cellula tumorale. Queste condizioni includono i) normale siero fetale bovino (FBS), ii), carbone-spogliato FBS (CS-FBS), che rimuove gli ormoni, fattori di crescita e citochine e iii) CS-FBS + molecola (denotato "X"). Un cambiamento significativo nella invasione delle cellule con CS-FBS rispetto al FBS, indica il coinvolgimento di ormoni, citochine e fattori di crescita nel mediare il cambiamento. Molecole individuali possono essere aggiunti nuovamente al CS-FBS per saggiare la capacità di riversetto o salvare il fenotipo invasione. Inoltre, due o più fattori possono essere combinati per valutare la effetti additivi o sinergici di più molecole in guida o inibire l'invasione. In generale, questo metodo consente al ricercatore di determinare se ormoni, citochine e / o fattori di crescita svolgono un ruolo nella invasione delle cellule servendo come fattori chemiotattici o inibitori di invasione per un particolare tipo di cellula tumorale o un mutante specifica. Identificando chemioattrattanti e inibitori specifici, questo test invasione modificato può aiutare a chiarire vie di segnalazione che dirigono l'invasione delle cellule tumorali.

Introduzione

Un test invasione romanzo è stato sviluppato con l'obiettivo di individuare il coinvolgimento di specifici ormoni, citochine e / o fattori di crescita come fattori chemiotattici di invasione delle cellule del cancro. La capacità delle cellule tumorali di invadere attraverso la matrice extracellulare (ECM) è una caratteristica del fenotipo metastatico ^1-3. Camere Invasion sono stati ampiamente utilizzati come strumenti in vitro per studiare l'invasione delle cellule tumorali e la migrazione e possono fornire conoscenze ai meccanismi di in vivo invasione tumorale e metastasi. Le camere sono costituiti da inserti di coltura cellulare cilindrici annidati all'interno dei pozzetti di piastre di coltura cellulare. Le parti inferiori degli inserti sono policarbonato o polistirolo membrane semi-permeabili di dimensioni dei pori definiti.

Nel saggio di invasione di serie, le cellule vengono seminate su membrana inserto con siero media liberi e collocati in pozzetti di coltura cellulare che sono pieni di siero o siero-come fattori chemiotattici per set una forza chemoattractive. Questa unità forza cellule di muoversi attraverso la membrana (migrazione) semipermeabile o in alternativa, attraverso un rivestimento di matrice extracellulare (invasione), che possono poi essere colorato con coloranti convenzionali per rilevare e quantificare il numero di cellule. Il numero di cellule viene quindi normalizzato secondo l'entità della migrazione e l'invasione in una linea cellulare non invasivo. Questo metodo consente un investigatore di valutare il potenziale invasivo di tipi cellulari diversi sotto una varietà di condizioni, tra manipolazioni genetiche.

Ormoni, citochine e fattori di crescita sono componenti critici di siero e sono sempre più dimostrato di essere associato con la guida del fenotipo invasivo ^4. Tuttavia, la natura, il ruolo e la specificità di queste molecole siero chemoattractive a mediare invasione rimangono ancora sfuggente. La sfida rimane per determinare quali fattori specifici nel siero o siero-like chemioattrattanti sono responsabili per la guidal'invasione delle cellule del cancro così come quello che le molecole possono inibire il processo di invasione. In questo rapporto, si descrive un metodo per valutare il potenziale coinvolgimento di ormoni, citochine e / o fattori di crescita presenti nel siero, come molecole guida la chemiotassi e l'invasione delle cellule tumorali.

In questo protocollo modificato proposto, carbone strippaggio viene utilizzato per rimuovere ormoni, citochine e fattori di crescita da siero bovino fetale 2% (FBS) per generare 2% carbone spogliato FBS (CS-FBS). Entrambi 2% FBS e 2% CS-FBS sono usati come agenti per impostare la forza chemoattractive di guidare l'invasione delle cellule di cancro. Utilizzando 2% CS-FBS come agente chemoattractive rispetto al normale 2% FBS offre diversi vantaggi tra cui in primo luogo e più prominente, la capacità di studiare il fenotipo cancro invasione nel ridotto / relativa assenza di ormoni, citochine e fattori di crescita. Consente inoltre il ricercatore di valutare se la rimozione collettiva di ormoni, fattori di crescita, e cytokines provoca un aumento o una diminuzione nell'indice invasiva. Il saggio viene quindi progettato per determinare se l'aggiunta di un singolo componente, designato come "X" può inibire, riduzione o aumento o ripristinare l'indice invasivo al suo valore originale (vedi figure 2 e 3). Anche se questo metodo è specifico per raggiungere i livelli fisiologici del componente che viene rimosso dal siero durante carbone strippaggio, va anche notato che il carbone strippaggio può anche compromettere le vie di trasduzione del segnale. Ad esempio, è stato riportato che il carbone strippaggio può diminuire l'attività della fosfatasi alcalina di cellule osteoprogenitrici e indurre adipogenesi attraverso la riduzione di attivatori MAPK ^5. Carbone supporti spogliato sono disponibili in commercio e sono basate sul protocollo delineato che combina con carbone destrano e incubate con siero fetale bovino O / N ^6.

Questo test è stato sviluppato in RESPONSE ad un risultato riportato da Zucker et al. ⁷ Gli autori hanno dimostrato che un fenotipo mutante colpisce comunicazione gap junction dimostrato un aumento dell'indice di invasione durante la migrazione verso media con normale 2% FBS. Tale aumento è stato eliminato con la sostituzione di siero carbone-spogliato. Da questo risultato, gli autori hanno concluso che la migrazione interessato mutante verso una molecola lipofila (più specificamente, un ormone, fattore di crescita o citochine) ^7. È ben noto che gli ormoni, fattori di crescita e citochine mediano vie di segnalazione coinvolte nella promozione del tumore e l'invasione ^4. Pertanto, è importante per gli investigatori scientifici per determinare quale fattore (s) stanno guidando l'invasione tumorale dei loro particolari cellule tumorali o mutanti sotto studio. Il saggio è progettato per affrontare il ruolo dei singoli componenti al loro concentrazioni fisiologiche come determinato in base alla differenza tra la concentrazione del componente &# 8220; X "in normale FBS e il CS-FBS. Attraverso lo sviluppo di questo test, i ricercatori possono ottenere un quadro più chiaro il percorso invasivo specifica che disciplina il loro sistema.

Ormoni, fattori di crescita e citochine sono stati spesso classificati come promotori tumorali ^8. Alcuni di questi fattori come EGF sono utilizzati come fonti dirette per chemioattrattanti in camere invasione ^9. Così, sembra probabile che questi rappresentano i principali componenti del siero che invasione tumorale diretta. Questo protocollo propone una semplice, ma significativa, modifica convenzionale vitro invasione test in cui consente un investigatore di valutare il coinvolgimento di ormoni, fattori di crescita e citochine nel mediare il potenziale invasivo delle cellule tumorali. Tuttavia, il saggio è progettato per fornire il ricercatore una risposta se il procedimento sarà efficace per il loro studio in un primo passo nell'analisi, per non usare tempo prezioso e risorse se ritenute inutili. Questo metodo utilizza CS-FBS e si basa sulla discrezionalità investigatori su quale molecole di perseguire come candidati di piombo che potenzialmente mediano invasione delle cellule di cancro. I risultati di queste analisi dovrebbero rivelarsi utili per individuare quali componenti del siero servono come fattori chemiotattici o inibitori per la particolare linea cellulare o mutante in fase di studio. Inoltre, questo approccio può aiutare il ricercatore a identificare vie di segnalazione chiave o che promuovono o inibiscono l'invasione delle cellule di cancro; indirizzando in tal modo il futuro sviluppo di farmaci.

Protocollo

1. Preparare i supporti differenti e componenti aggiuntivi

1. Prima di sperimentare, preparare supporti costituito da DMEM o altri supporti specificati con l'aggiunta di una normale FBS, carbone spogliato FBS, o carbone spogliato FBS più il componente da testare. Si noti che più componenti possono essere testati in ogni esperimento.
2. Pesare e diluire gli ormoni, fattori di crescita, citochine o opportunamente essere disciolti nel siero carbone spogliato alla concentrazione fisiologica.

2. Preparare il collagene Matrix on Ice

1. Preparare 2 ml di collagene I matrice a 2,2 mg / ml aggiungendo i seguenti componenti filtrati sterili su ghiaccio: 200 ml 10x PBS (pH 7.4), 5,4 ml 1 N NaOH, 600 ml di doppia H ₂ O distillata e 1,2 ml di collagene I (a 3,63 mg / ml).
2. Tenere soluzione collagene I in ghiaccio fino alla piastra.

3. Preparare piatti Migration / Invasion per test

1. Per ciascuna linea cellulare da testare, utilizzare una piastra camera 24 pozzetti in cui 12-pozzetti contengono inserti. Utilizzare aggiuntivi 12 pozzetti che non contengono inserti per aggiungere i media chemiotattico e trasferire gli inserti per il set up sperimentale.
   NOTA: una matrice di collagene su piastre con un polietilene teraphthalate (PET) di membrana e 8 micron dimensione dei pori è ottimale per le linee di cellule usano qui. Tuttavia, una matrice matrigel in lastre pretrattata può anche essere sostituito con la dimensione dei pori diminuita secondo la linea cellulare indagato.
2. Chiaramente etichettare il piatto, con 3 pozzi per condizione di essere analizzati (migrazione FBS, migrazione CS-FBS, FBS invasione, e CS-FBS invasione e FBS-migrazione per un controllo, linea cellulare non invasiva). Migrazione Assay dal movimento attraverso i pori in una membrana PET, e dosaggio invasione di movimento attraverso una matrice di collagene o matrigel e poi attraverso i pori nella membrana. Utilizzare diversi marcatori di colore per ogni condizione cella a unaid nel processo di placcatura.

4. Distribuire l'invasione Matrix

1. Pipettare attentamente 75 microlitri della soluzione di matrice di collagene negli inserti da utilizzare per saggi di invasione. Usare cautela per evitare le bolle. Disperse bolle applicando una punta della pipetta invertita alla superficie.
2. Trasferire la piastra con inserti collagene rivestite a CO ₂ incubatore 37 ° C e 5% per 30 minuti per consentire il gel a solidificare.

5. Piatto celle sulla membrana o Invasion Matrix

1. Nel frattempo, trypsinize cellule e aggiungono media con il 10% FBS. Celle Spin a 200 xg per 5 minuti in una centrifuga da tavolo e risciacquo 3x in media liberi di siero.
2. Risospendere in media liberi siero. Contare le cellule con un emocitometro o contatore presentazione automatica. Aggiungi mezzi di comunicazione liberi di siero a una concentrazione finale di 5 x 10 ⁴ cellule / ml.
3. Quando la matrice di collagene è solidificato (dopo 30 min), aggiungere 700 ml di media con entrambi2% FBS o definiti carbone-spogliati FBS a ciascun bene. Dei 12 inserti per piastra:
   • 3 inserti hanno collagene e pozzi con i media + 2% FBS
   • 3 inserti hanno collagene e pozzi con i media + 2% CS-FBS
   • 3 inserti non hanno collagene e pozzi con i media + 2% FBS
   • 3 inserti non hanno collagene e pozzi con i media + 2% CS-FBS
   1. Utilizzare piastre aggiuntive a seconda del numero di fattori da testare e con un controllo senza collagene corrispondente a ciascuna condizione.
4. Aggiungi sospensione cellulare agli inserti a 5 x 10 ⁴ cellule / ml, placcatura 500 cellule microlitri per inserto in tutti gli inserti di migrazione e invasione.
5. Incubare le cellule per 22 ore a 37 ° C.

6. quantificare il numero di Migrazione e cellule invasori

1. Impostare colorazione dei pozzetti con metanolo fissante, eosina, e hemotoxylin, in pozzetti separati.
2. Usare tamponi di cotone per rimuovere le cellule e la matrice di ogni bene.Rrepeat con seconda domanda tampone per ogni bene.
3. Con pinze, immergere ogni inserto 5 volte per 1 sec in ciascuna delle 3 soluzioni in successione.
4. Lasciare asciugare inserti O / N.
5. Entrambi i) rimuovere i filtri con un bisturi, tagliare con cura intorno ai bordi e montare su un vetrino con coprioggetto e immersione in olio, o ii) consentire gli inserti asciugare O / N invertita e utilizzare gli inserti direttamente per la microscopia.
6. Il giorno successivo, visualizzare diapositive o inserti al microscopio con un obiettivo 20X e prendere 5 immagini provenienti da diverse regioni del filtro. Per migliorare la coerenza, prendere 4 campi esterni e uno centrale.
7. Contare le cellule per tutte le condizioni utilizzando il software ImageJ e applicare le formule seguenti.
8. Determinare la percentuale invasione come segue:
   Media # di cellule che invadono attraverso collagene inserisco = a
   Media # di cellule che migrano attraverso inserti di controllo = b
   Invasion% = (a / b) * 100
9. Determinare l'Indice Invasion in 2% FBS come segue:
   % Invasione delle cellule essere analizzato (in 2% FBS) = c
   % Invasione delle cellule non invasivi di controllo in (2% FBS) = d
   Invasion Index (FBS) = (c / d)
10. Determinare l'indice Invasion in 2% CS-FBS come segue:
    % Invasione delle cellule essere analizzato (in 2% CS-FBS) = e
    % Invasione delle cellule di controllo non invasivi in ​​(2% CS-FBS) = f
    Invasion Index (CS-FBS) = (E / F)

7. Ripetere protocollo sperimentale Paragonando Charcoal-spogliato FBS a FBS Charcoal-stripped + X _n con più fattori combinati

1. Ripetere la procedura più volte necessario utilizzando diversi componenti per "X" o una combinazione di componenti.
2. Applicare i calcoli per determinare il contributo di ciascun fattore "X" per gli effetti di migrazione e invasione.

Risultati

L'indice di invasione viene calcolato per ogni condizione secondo la normalizzazione di una linea cellulare non invasivo. Per i nostri esperimenti, utilizziamo la linea cellulare di melanoma 1205Lu e linee cellulari stabili varianti affermata come nostre linee invasive nonché la variante non invasivo premaligne, WM793 da cui le cellule sono state derivate 1205Lu ¹⁰ che serve da controllo logica. Utilizziamo anche il collagene I come la matrice invasione perché è la componente primaria del derma. Ciò è in ...

Discussione

Metastasi tumorali è un processo a più fasi. Le cellule devono attraversare la membrana basale, intravasate in nessuna delle due il sistema linfatico o di sangue microvasi, in cui sono trasportati in siti distanti. Le cellule tumorali quindi stravaso e colonizzano in un macrometastasis ^12. La progressione attraverso l'epitelio di transizione mesenchimale (EMT), invasione tumorale, e metastasi è stato migliorato dagli ormoni steroidei ^13,14, fattori di crescita ^15-18, e ^19-21

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Inserti di controllo BioCoat con 8.0 µ m Membrana in PET	Corning	354578	12 in ciascuna delle due piastre da 24 pozzetti. PET = polietilene teraftalato
Collagene I, coda di ratto	Corning	354236	Fonte = tendine della coda di topo, purezza = 90%
Fissativo; Diff-Quick	Thermo Fisher Scientific	NC9844047	Fissativo a base di metanolo, ematossilina/eosina
Siero fetale bovino	Life Technologies	16000	Designato come FBS
Siero fetale bovino spogliato al carbone	Life Technologies	12676	Designato come CS-FBS
Siero fetale bovino	Thermo Scientific Hyclone	SH30070	Designato come FBS
Siero fetale bovino spogliato al carbone	Thermo Scientific Hyclone	SH30068	designato come CS-FBS