Formazione di microarray di membrana con un metodo di assemblaggio con sede a seccatoio

Summary

Bistrati lipidici supportati e particelle di membrana naturali sono sistemi convenienti che può approssimare le proprietà delle membrane cellulari e di essere incorporati in una varietà di strategie analitiche. Qui mostriamo un metodo per preparare microarray composto da supportati doppio strato lipidico rivestite SiO ₂ perline, vescicole di fosfolipidi di membrana o particelle naturali.

Abstract

Doppio strato lipidico delle membrane formano le membrane plasmatiche delle cellule e definiscono i confini di organelli subcellulari. In natura, queste membrane sono miscele eterogenee di molti tipi di lipidi, contengono proteine ​​di membrana e sono decorate con i carboidrati. In alcuni esperimenti, è opportuno disaccoppiare le proprietà biofisiche o biochimiche del doppio strato lipidico da quelle della membrana naturale. Tali casi richiedono l'uso di sistemi modello come vescicole giganti, liposomi o doppi strati lipidici supportati (SLB). Matrici di SLB sono particolarmente interessanti per le applicazioni di rilevamento e mimando interazioni cellula-cellula. Qui si descrive un nuovo metodo per la formazione di matrici SLB. Inferiori al micron di diametro SiO ₂ perle sono in primo luogo rivestiti con doppi strati lipidici per formare SLB sferici (SSLBs). Le perle sono poi depositati in una matrice di pozzetti inferiori al micron di diametro micro-fabbricato. La tecnica di preparazione utilizza un "seccatoio" per pulire la superficie del substrato, mentre leaving dietro SSLBs che si sono insediati nei pozzetti. Questo metodo non richiede alcuna modificazione chimica del substrato micropozzetti, né alcun particolare ligandi di targeting sul SSLB. I micropozzetti sono occupate da singole perline perché il diametro bene sia sintonizzato essere appena superiore al diametro del branello. Tipicamente, più il 75% dei pozzi sono occupati, mentre il resto rimane vuoto. In tampone array SSLB mostrano stabilità a lungo termine maggiore di una settimana. Diversi tipi di SSLBs possono essere collocati in una singola matrice mediante deposizione seriale, e le matrici possono essere usate per il rilevamento, che dimostriamo caratterizzando l'interazione di tossina colerica con ganglioside GM1. Mostriamo anche che vescicole fosfolipidiche che non supporti cerchietti e biomembrane da fonti cellulari possono essere disposte con lo stesso metodo e lipidi di membrana cellula-specifici possono essere identificati.

Introduction

Le membrane doppio strato lipidico sono strutture essenziali in natura. Membrane plasmatiche cellulare e membrane degli organelli sono composti di bistrati lipidici che incorporano un numero di molecole che sono necessarie per la vita. Molti processi di sostegno vitale verificano sulla superficie delle cellule o sono mediati da molecole associate con membrane a doppio strato lipidico. Infatti, molti prodotti farmaceutici processi o molecole bersaglio si trovano su o nelle membrane ^1,2. È pertanto necessario indagare analiticamente processi, come reazioni chimiche o eventi di legame covalenti che si verificano sulla superficie della membrana. Poiché le membrane naturali possono essere difficili da isolare e / o interfaccia con i sensori, molti ricercatori utilizzano membrane modello semplificato di effettuare studi analitici. Un certo numero di sistemi a membrana modello sono descritti in letteratura, che vanno da vescicole giganti che possono essere decine a centinaia di micron di diametro a liposomi con dimensioni nanometriche ^3,4. Alterntivamente, bistrati lipidici planari depositati su supporti solidi, cioè, supportati bistrati lipidici (SLB), possono essere formati su un numero di superfici diverse e sono stati ampiamente utilizzati in biofisici, biochimici e applicazioni analitiche ^5. Accoppiamento SLB con materiali elettrici o ottici permette lo studio di membrana biochimica e biofisica attraverso l'uso di diverse tecniche analitiche. Microscopia a fluorescenza ^6, elettrochimica ^{7, 8} spettroscopia ottica, microscopia a scansione di sonda ^9, risonanza plasmonica di superficie ^{10, 11} e spettrometria di massa sono stati tutti impiegati per studiare la struttura e le proprietà di SLB.

Array SLB offrono maggiore versatilità nella progettazione di sensori per il test multiplex ^12,13. Altre applicazioni utilizzano matrici SLB di imitare il bivio che si forma tra le cellule immunitarie ^14. Metodi di preparazione per gli array SLB hanno variato dal microfluIDIC avvicina ¹⁵ a quelli che impiegano le barriere fisiche tra patch SLB adiacenti. ^sedici Altri gruppi hanno utilizzato metodi di stampa ^17, patterning fotochimico ¹⁸ e vari approcci nanoingegneria ¹⁹ per creare array SLB.

In questo lavoro e video allegato si dimostra un metodo per formare matrici SLB depositando SLB-SiO ₂ perle rivestite in array ordinati di micropozzetti ^20. Ci riferiamo alle SLB-rivestite SiO ₂ perle come sferici doppi strati lipidici supportati (SSLBs). Questa tecnica è un'estensione del precedente lavoro che ha creato schiere di vescicole fosfolipidiche e biomembrane derivati ​​da fonti naturali ^21, da cui mostriamo anche Esempio risultati. Altri metodi per arraying particelle biomembrane o vescicole hanno fatto affidamento su modelli di specifici ligandi di targeting su superfici che si associano con ligandi complementari presenti sulla superficie delle vescicole. Gli esempi includono biotina-avidina associazione ^22,23 e schemi di ibridazione DNA ^24. Il nostro approccio richiede solo un array di micropozzetti senza di targeting o di riconoscimento porzioni necessarie. La dimensione di SSLBs è definita dal diametro delle SiO ₂ supporti tallone, che hanno un basso poli-dispersity. Sintonizzando il diametro micropozzetti a poco più grande del diametro SSLB, un solo SSLB deposita in ciascun pozzetto. A poli (dimetilsiloxano) (PDMS) spatola rimuove poi dalla superficie tutti i SSLBs che non sono immobilizzati in pozzetti. I pozzetti e array SSLB risultanti hanno alta densità (~ 10 ⁵ SSLBs / mm ²⁾ con 3 micron spaziatura da centro a centro e la periodicità esagonale. Seriale i depositando SSLBs con differenti composizioni lipidiche, è possibile creare array multicomponenti con SSLBs posizionati in modo casuale. Per dimostrare la capacità di rilevamento di array SSLB, abbiamo usato l'interazione della tossina colerica (CTx) con un ganglioside (GM1) incorporato nei SSLBs. Conparticelle di membrana naturali, siamo stati in grado di rilevare lipidi cellula-specifici in matrici multicomponente contenenti materiale di membrana da due tipi di cellule differenti.

Protocol

1. Microfabrication di Microwell Array substrato

1. Iniziare con un wafer di silicio da 4 pollici con 100 nm di ossido cresciuto termicamente.
2. Spin SPR-955 0,7 photoresist sul wafer a 4.000 rpm per 30 sec.
3. Cuocere su una piastra riscaldante a 115 ° C per 90 sec.
4. Esporre photoresist.
   1. Utilizzare una maschera che creerà 1 micron fori disposti in una matrice esagonale con un periodo di 3 micron in cui l'array copre un'area mm x 2 2 mm.
   2. Esporre wafer in un passo-passo i-line utilizzando un passo di 6 mm e una esposizione di 200 mJ / cm ^2.
5. Cuocere su una piastra riscaldante a 115 ° C per 90 sec.
6. Sviluppare con uno sviluppatore di selezione per depositare 2 pozze d'CD-26 sul wafer per un tempo di sviluppo totale di 90 sec.
7. Sciacquare abbondantemente con acqua ultrapura DI e asciugare con N _2.
8. Etch l'ossido in un incisore reattiva ioni di litio per 6 min con 50 sccm di Ar, 25 sccm di CF ₄ e 50 sccm di CHF ₃ floala ad una pressione di 75 mTorr.
9. Etch silicio in una profonda ICP-trincea incisore reattiva di litio per 2 min con 63 sccm di C ₄ F _8, 27 sccm di SF _6, 40 sccm di Ar, e 10 sccm di O ₂ che scorre ad una pressione di 14 mTorr.
10. Sciacquare in acetone, metanolo e isopropanolo per rimuovere resistere.
11. Posto in un bagno di H ₂ SO _4: H ₂ O ₂ 1:1 10 min per pulire la superficie.
12. Sciacquare abbondantemente con acqua ultrapura DI e asciugare con N _2.
13. Deposita 1.080 Å di Al ₂ O ₃ da deposizione di strati atomici a 250 ° C.

2. Preparazione di Poli (dimetilsiloxano) seccatoio

1. Se possibile, lavorare in una camera sterile. In caso contrario, lavorare in un ambiente più pulito possibile.
2. Ottenere un piatto di plastica Petri (o altro contenitore monouso pulito) con ≥ 13 millimetri lati.
3. In quel piatto, versare il 5 g agente indurente PDMS, seguita da 50 g di PDMS base l'agente (o qualsiasi cosa con un rapporto 1:10 che per lo più riempire il piatto di Petri). Mescolare accuratamente con una pipetta di plastica usa e getta o asta.
4. Rimuovere le bolle posizionando il PDMS misti in una camera con una linea di vuoto, applicando vuoto fino bolle fuoriescono miscela (circa 30 min).
5. Se non è già nel piatto di Petri, versare PDMS in piatto di Petri, evitando la creazione di bolle d'aria.
6. Curare durante la notte su una piastra riscaldante a> 50 ° C (maggiore calore per meno tempo funziona anche).
7. Con la nuova / lama di rasoio pulito, accuratamente tagliato un pezzo rettangolare di circa 2,5 x 2,5 centimetri, mantenendo superficie superiore più pulito possibile. Sbucciare fuori con una pinza pulita. Tagliare un bordo (fino a 1,5 cm) premendo sulla lama di rasoio in un unico movimento, per rendere bordo superiore più nitido possibile (questo sarà il bordo utilizzato nel processo tergipavimento).
8. Pulire con acetone, metanolo, alcol isopropilico e acqua deionizzata ultrapura, e poi asciugare con azoto pulito. Conservare in un piatto pulito Petri.

3. Preparazione di vescicole

1. Raccogliere soluzioni stock lipidici di fosfatidilcolina 25 mg / ml uovo (PC) e 1 mg / ml di 1,2-dipalmitoil-sn-glycero-3-fosfoetanolamina-N - (lissamina rodamina B sulfonyl) sale di ammonio (Rho-PDPE) in cloroformio e / soluzione madre ml 0,5 mg di monosialoganglioside GM1 in cloroformio / metanolo (2:1 v / v).
2. In un flaconcino piccolo bicchiere fare una miscela che si traduce nel 97% molare PC, 2 mol% GM1 e 1 mole% Rho-PDPE aggiungendo 18,9 ml di 25 mg / ml PC, 39,6 ml di 0,5 mg / ml GM1 e 7,9 ml di 1 mg / ml Rho-PDPE usando siringhe di vetro.
3. Nota:. Il materiale supplementare per Nair et al ²⁵ contiene un ottimo foglio di calcolo Excel personalizzabile per il calcolo degli importi di lipidi necessari per creare vescicole di qualsiasi composizione desiderata.
4. Posizionare flaconcino in un essiccatore sotto vuoto e rimuovere il solvente lasciando il flaconcino sotto vuoto per 6 ore.
5. Preparare una soluzione acquosa di 0,1M NaCl. Aggiungere 0,5 ml di soluzione 0,1 M di NaCl al flaconcino contenente il film lipidico essiccato.
6. Lasciare la miscela lipidica acquosa per riposare durante la notte.
7. Brevemente mix vortice per creare una sospensione vescicola, poi con ultrasuoni per 20 minuti in un bagno sonicatore a temperatura ambiente.
8. Prelevare la sospensione vescicola attraverso una membrana di policarbonato con 100 nm dimensione dei pori. Passare la sospensione vescicola attraverso il filtro di 17x.
9. Conservare le vescicole estrusi in un flacone di vetro a 4 ° C.

4. Formazione di sferici supportati doppi strati lipidici

1. Raccogliere 700 nm di diametro SiO ₂ perline. Le perle sono forniti in acqua distillata con una concentrazione scorta di 1,4 x 10 ¹¹ perline / ml.
2. In una provetta Eppendorf da 1,5 ml preparare una sospensione di sferette 1 ml con una concentrazione di 1,5 x 10 ¹⁰ perline / ml aggiungendo 107 ml di soluzione tallone stock a 893 ml di 0,1 M NaCl.
3. Agitare la sospensione per assicurarsi che sia ben missa.
4. Centrifugare la sospensione a 1.700 xg per 20 minuti poi scartare il surnatante. Risospendere le sfere in 1 ml di 0,1 M di NaCl. Ripetere questa operazione altre due volte di lavare accuratamente le perline.
5. Per formare i SSLBs, in una provetta Eppendorf da 1,5 ml aggiungere 25 microlitri della sospensione di sferette SiO ₂ a 200 ml di 1 mg / ml di sospensione di vescicole. Vortex il composto e lasciate riposare per 1 ora a temperatura ambiente. In questa fase la concentrazione SSLB dovrebbe essere 1,7 x 10 ⁹ SSLBs / ml.
6. Centrifugare a 1.700 xg per 20 min a pellet i SSLBs. Il pellet dovrebbe apparire rosa a causa della rottura di vescicole con Rho-PDPE sulle perline.
7. Eliminare il surnatante e risospendere in 225 microlitri tampone fosfato salino (PBS), pH = 7.4. Ripetere i passaggi 4,6-4,7 altre due volte per rimuovere eventuali vescicole unruptured dalla sospensione SSLB.

5. Assemblea dei SSLB Array

1. Wafer Cleave di matrici micropozzetti con conseguente pezzi rettangolari con 4-6 micRowell array per pezzo.
2. Vortex mescolare la sospensione SSLB, quindi versare 10 ml di sospensione SSLB su ogni matrice microwell. Per timore di riposo per 1 ora per consentire SSLBs di depositarsi sulla superficie.
3. Lavare delicatamente il chip matrice pozzetto con PBS da una bottiglia di lavaggio, poi immergere in un bagno PBS preparato in un piatto fondo.
4. Mentre sommerso, inserire delicatamente il PDMS filo seccatoio sul chip matrice microwell e farlo scorrere delicatamente lungo la superficie 5x per rimuovere SSLBs che non sono immobilizzati in pozzetti.
5. Afferrare il chip matrice pozzetto con una pinzetta e delicatamente agitare nel bagno PBS per rimuovere eventuali SSLBs eccesso.
6. Rimuovere rapidamente il chip dal bagno spatola e mettere in un bagno PBS fresco fino a nuovo uso. Assicurarsi che la superficie superiore del chip rimane bagnato per preservare le SSLBs.

Nota: Il metodo di assemblaggio sopra descritto può essere usato per creare matrici di particelle di membrana naturali, come particelle mielina isolato da cervello di topo, o phovescicole spholipid che non SiO ₂ supporti tallone. Questo lavoro è descritto in dettaglio in Wittenberg et al. ²¹ e risultati rappresentativi sono mostrati di seguito.

6. Tossina colerica Binding Assay

1. Preparare una soluzione di 2 mg / ml di sieroalbumina bovina (BSA) in PBS.
2. Preparare una soluzione con concentrazione desiderata di Alexa 488 coniugato tossina colerica B-subunità in PBS con 2 mg / ml di BSA.
3. Rimuovere il chip matrice SSLB dal bagno PBS ed evacuare la maggior parte della soluzione PBS usando un laboratorio pulire. Lasciare basta PBS sul chip per mantenere la matrice SSLB idratata.
4. Per prevenire il legame non specifico, aggiungere 200 ml di 2 mg / ml BSA al chip matrice SSLB. Lasciare riposare per 1 ora in una scatola umidificata.
5. Con una micropipetta, rimuovere 200 ml di soluzione dalla parte superiore del chip matrice SSLB.
6. Aggiungere 200 ml di soluzione di tossina del colera al chip matrice SSLB e lasciare riposare per 1 ora in una scatola umidificata.
7. Lavare delicatamente il chip matrice SSLB con PBS da una bottiglia di lavaggio per eliminare ogni tossina del colera non legato.
8. Wick via l'eccesso di PBS utilizzando un laboratorio wipe. Prima di imaging chip di copertura con una scivolata 24 millimetri di copertura x 40 mm.
9. Array di immagine con un microscopio verticale con filtro imposta appropriato per i fluorofori di interesse.
10. Analizzare l'intensità di fluorescenza dei singoli SSLBs di un array utilizzando la funzione di analisi delle particelle automatizzata del software ImageJ.
11. Compilare intensità di fluorescenza medi dei singoli SSLBs in istogrammi che riassumono le intensità di SSLBs trovate su un dato array.

Results

Quando SiO ₂ perle sono mescolati con una soluzione di vescicole composte da fosfolipidi, lipidi fluorescenti e altri lipidi come gangliosidi, le vescicole si rompono sulle superfici SiO ₂ cerchietti per formare SSLBs, come mostrato schematicamente in figura 1a. Dopo aver lavato i SSLBs, una goccia di soluzione SSLB è posto su una matrice microwell, e le perle sono autorizzati a stabilirsi in superficie. (Figura 1b1) Questo può essere fatto anche con una sospension...

Discussion

In questo lavoro mostriamo che monodisperse SiO ₂ perle rivestite con doppi strati lipidici supportati possono essere disposte in array micropozzetti senza la necessità per il targeting ligandi sulle membrane lipidiche o la superficie del substrato, e le matrici possono essere utilizzati per caratterizzare le interazioni tossina-lipidico. La costante di dissociazione abbiamo calcolato per CTx/GM1 vincolante confronta favorevolmente, data l'ampia disparità di valori in letteratura, con una precedente relaz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 pollici wafer di silicio	University Wafer	425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 fotoresist	MicroChem	SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 sviluppatore	MicroChem	CD-26
i-line stepper	Canon	2500 i3 stepper
Vision 320 incisore ionico reattivo	Advanced Vacuum	Vision 320 RIE
Incisore ionico reattivo a trincea profonda	Plasma Therm	SLR-770
Sistema di deposizione dello strato atomico	Cambridge NanoTech	Savannah
Dow Corning Sylgard 184 kit poli(dimetilsilossano)	Ellsworth Adesivi	184 SIL ELAST KIT 0,5 KG
Uovo fosfatidilcolina	Avanti Polar Lipids	840051C
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-(lissamina rodamina B sulfonil) sale di ammonio	Avanti Polar Lipids	810158C
Monosialoganglioside GM1	Avanti Polar Lipids	860065P
Perline di silice	Bangs Laboratories	SS03N/4666	La confezione del contenitore delle perline indica che le perle hanno un diametro di 900 nm. Tuttavia, dopo la diffusione della luce e la microscopia elettronica, abbiamo determinato che le perle hanno un diametro di circa 700 nm.
Subunità B della tossina del colera, Alexa 488-coniugato	Sonde molecolari	C-34775
Anticorpo anti-oligodentrociti IgM O4, NorthernLights 557 coniugato	R & D Systems	NL1326R
Sonde molecolari	FM1-43	T-3136
Eppendorf MiniSpin centrifuga	Fisher Scientific	05-401-09