Articolo metodologico

Un enzima di restrizione metodo basato clonazione per valutare l' In vitro Replica Capacità di HIV-1 Sottotipo C Gag-MJ4 chimerici virus

DOI:

10.3791/51506

⸱

31 agosto 2014

 ,  , 
1Emory Vaccine Center at Yerkes National Primate Research Center, Emory University, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La patogenesi dell'HIV-1 è definita sia dalle caratteristiche virali che dai fattori genetici dell'ospite. Qui descriviamo un metodo robusto che consente misurazioni riproducibili per valutare l'impatto della variazione della sequenza genica gag sulla capacità di replicazione in vitro del virus.

Abstract

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L'effetto protettivo di molti alleli HLA di classe I sulla patogenesi dell'HIV-1 e sulla progressione della malattia è, in parte, attribuito alla loro capacità di colpire porzioni conservate del genoma dell'HIV-1 che sfuggono con difficoltà. I cambiamenti di sequenza attribuiti alla pressione immunitaria cellulare si verificano in tutto il genoma durante l'infezione e, se trovati all'interno di regioni conservate del genoma come il Gag, possono influenzare la capacità del virus di replicarsi in vitro. La trasmissione di polimorfismi legati all'HLA in Gag a riceventi HLA-mismatched è stata associata a una riduzione delle cariche virali del set point. Abbiamo ipotizzato che ciò possa essere dovuto a una ridotta capacità di replicazione del virus. Qui presentiamo un nuovo metodo per valutare la replicazione in vitro di HIV-1 come influenzato dal gene gag isolato da punti temporali acuti da zambiani infetti da sottotipo C. Questo metodo utilizza il clonaggio basato su enzimi di restrizione per inserire il gene gag in una spina dorsale provirale comune dell'HIV-1 di sottotipo C, MJ4. Ciò lo rende più appropriato per lo studio delle sequenze del sottotipo C rispetto ai precedenti metodi basati sulla ricombinazione che hanno valutato la replicazione in vitro di sequenze gag-pro di derivazione cronica. Tuttavia, il protocollo potrebbe essere facilmente modificato per studi di virus di altri sottotipi. Inoltre, questo protocollo descrive un metodo robusto e riproducibile per valutare la capacità di replicazione dei virus chimerici Gag-MJ4 su una linea cellulare T basata su CEM. Questo metodo è stato utilizzato per lo studio dei virus chimerici Gag-MJ4 derivati da 149 zambiani infettati in modo acuto dal sottotipo C e ha permesso l'identificazione di residui in Gag che influenzano la replicazione. Ancora più importante, l'implementazione di questa tecnica ha facilitato una comprensione più profonda di come la replicazione virale definisca i parametri della patogenesi precoce dell'HIV-1, come la carica virale e il declino longitudinale delle cellule T CD4+.

Introduzione

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Determinare l'host e le caratteristiche virali che influenzano HIV-1 patogenesi e nella progressione della malattia è fondamentale per la progettazione razionale di vaccini. La risposta immunitaria cellulare è un componente chiave della risposta immunitaria umana HIV-1. Linfociti T citotossici (CTL) sono necessari per il controllo iniziale della viremia acuta, e permettono l'host di stabilire uno stato di equilibrio (set point) carica virale 1,2. Deplezione sperimentale di queste cellule effettrici si traduce in perdita di controllo virale 3,4. Nonostante questo, sfuggono le mutazioni sorgono all'interno del genoma virale che sovvertire CTL riconoscimento delle cellule infettate da virus 5-9.

Alcuni alleli HLA sono stati associati con una carica virale inferiore e la progressione della malattia più lenta tra cui B * 57, B * 27 e B * 81 10-15. Parte del beneficio protettivo di alleli HLA di classe I può essere attribuito al fatto che esse mirano regioni funzionalmente vincolati del genoma come Gage selezionare per le mutazioni di fuga che riducono la capacità del virus di replicarsi in vitro 16-21. Sebbene fuga dal sistema immunitario cellulare è vantaggioso per il virus nel contesto della classe I allele HLA selezione, l'effetto di queste mutazioni può avere conseguenze differenziali per l'host dopo la trasmissione a un HLA-non corrispondenti individuale 22,23. Pertanto, la comprensione degli effetti delle mutazioni trasmesse fuga HLA-associato sulla capacità di replicazione virale sarà importante per migliorare la nostra comprensione dei primi HIV-1 patogenesi.

Sebbene siano stati compiuti molti progressi per identificare e caratterizzare i difetti di fitness di mutazioni di fuga individuali associati con particolare HLA di classe I alleli 24-29, naturalmente HIV-1 isolati sono impronte uniche e complesse di polimorfismi HLA-associato, probabilmente derivanti dalla HLA pressione immunitaria mediata di diversa provenienza immunogenetici 30. In apanalisi revious, Goepfert et al. ha dimostrato che un accumulo di mutazioni HLA-associati nelle sequenze Gag trasmessi derivate da 88 Zambians infezione acuta era associato ad una riduzione della carica virale set point 31. Questo suggerisce che la trasmissione di mutazioni deleterie di fuga, in particolare in Gag, ai destinatari HLA-non corrispondenti fornisce un beneficio clinico, e può essere dovuto ad attenuare la replicazione virale. Andando avanti, è imperativo studiare come complesso combinazioni di polimorfismi Gag all'interno isolati naturali lavorano in concerto per definire le caratteristiche del virus trasmesso come la capacità di replicazione, e come la replicazione precoce potrebbe a sua volta influenzare HIV-1 parametri clinici e di fase tardo- patogenesi.

Brockman et al. Prima dimostrato un legame tra la capacità di replicazione di sequenze gag-pro isolato durante l'infezione fase cronica e la carica virale sia nel sottotipo C e le infezioni B32-35. L'approccio sperimentale presentato in questi studi, anche se adeguato per esaminare la capacità di replicazione in vitro di sequenze derivate da individui cronicamente infetti, ha diversi avvertimenti tecnici e limitazioni che rendere lo studio di HIV-1 capacità replicativa nel sottotipo C individui con infezione acuta difficile. Questo metodo si basa sulla ricombinazione di base di popolazione sequenze PCR-amplificate nel sottotipo B NL4-3 provirus, che è stato derivato in parte da LAV, un laboratorio adattato virus magazzino 36. Generazione di virus è stato realizzato da co-trasfezione di una base-CEM linea di cellule T 37 con ampliconi della PCR e digerito delta- NL4-3 DNA gag-pro. Questo metodo richiede l'escrescenza di virus in un periodo di settimane o mesi, potenzialmente alterando la natura del virus magazzino recuperati rispetto ai quasispecie virale in vivo, e quindi alterare la misurazione della capacità di replicazione in vitro. Questo metodo is più appropriato per studiare gli individui cronicamente infette, dove seleziona efficacemente per virus con la più alta capacità replicativa, e dove clonazione numerose varianti virali differenti da un gran numero di individui cronicamente infette è piuttosto intenso lavoro e quindi non fattibile. Tuttavia, all'interno di un individuo infetto acutamente, ci sono generalmente 01:59 varianti presenti, ed eliminando così il rischio di inclinazione della natura del virus magazzino recuperato, attraverso pressioni della selezione in vitro, consente una valutazione più accurata della capacità di replicazione in vitro. In secondo luogo, questo metodo richiede ricombinazione sottotipo C sequenze gag-pro in un sottotipo B dorsale derivato, e potrebbe introdurre distorsioni backbone incompatibilità nell'analisi. A causa di queste limitazioni, un gran numero di sequenze devono essere analizzati al fine di superare eventuali distorsioni introdotte potenziali.

Qui si descrive un appro sperimentale alternativaach appropriata per studiare le sequenze derivate dal sottotipo C individui con infezione acuta. Usiamo una strategia di clonazione basata enzima di restrizione per introdurre il gene gag derivato dal acuti momenti di infezione da HIV-1 sottotipo C individui infetti nella spina dorsale provirale sottotipo C, MJ4. L'uso di MJ4 come una spina dorsale comune in cui clonare i geni gag è cruciale per l'analisi di sottotipo C sequenze derivate. MJ4 è derivato da un isolato primario 38, e quindi sarebbe meno probabilità di introdurre bias dovuto al sottotipo incompatibilità tra la spina dorsale e il gene gag. Inoltre, l'approccio di clonazione mediante restrizione basata enzima permette la provirale costruisce essere trasfettate direttamente nelle cellule 293T, e per il recupero di un virus magazzino clonale identica alla sequenza di gag clonata.

Il metodo presentato qui di seguito è un metodo ad alta produttività per la valutazione della capacità di replicazione del sottotipo C derivato Gag-MJ4virus chimerici. Trasfezione in cellule 293T è semplice e il recupero di virus richiede solo tre giorni. In vitro la capacità di replica viene analizzato sulla stessa base linea di T-cellule CEM-CCR5 creato da Brockman et al. 37, ma con importanti modifiche di protocollo necessario per la replica di successo di sottotipo C MJ4 virus chimerici. L'utilizzo di una linea di T-cella appropriata piuttosto che PBMC permette un gran numero di sottotipo C virus MJ4-chimerico per essere testati con alto dosaggio riproducibilità. Infine, utilizzando un radiomarcato test trascrittasi inversa per la quantificazione del virus nel surnatante è più conveniente rispetto all'utilizzo di kit ELISA disponibile in commercio P24. Inoltre, dà una gamma dinamica superiore, che era importante per rilevare i virus male e altamente replicare all'interno dello stesso test e per la rilevazione di sottili differenze nella replica tra gli isolati.

In conclusione, il metodo qui presentato ha permessolo studio approfondito della capacità di replicazione di sequenze gag derivati ​​da HIV-1 sottotipo C acutamente infettato individui dallo Zambia, e come scritto, potrebbe anche essere esteso a studiare altri sottotipo C popolazioni infettato. È stato osservato un alto grado di variazione capacità di replica tra i diversi isolati Gag. Inoltre, siamo stati in grado di dimostrare un'associazione statistica tra la capacità di replicazione del Gag trasmessi e set point carica virale così come con CD4 + declino nel corso di un periodo di tre anni 39. Tali risultati sottolineano l'importanza di studiare le caratteristiche virali come trasmesso, come la capacità di replica, interagiscono con il sistema immunitario ospite di influenzare patogenesi durante l'infezione precoce e saranno parte integrante per lo sviluppo di interventi di vaccini efficaci e trattamento.

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Protocollo

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1 Amplificazione del virus HIV-1 gag Gene da infetti, Frozen Plasma

  1. Estrarre l'RNA virale da 140 microlitri scongelati HIV-1 nel plasma infetto utilizzando un kit di estrazione.
    1. Quando possibile, procedere immediatamente alla sintesi del DNA dopo estrazione dell'RNA come RNA virale scongelato produce i migliori risultati di amplificazione. Se possibile, impostare PCR master mix per il primo turno di amplificazione del DNA e conservare a 4 ° C prima dell'estrazione dell'RNA virale.
  2. Reverse-trascrivere cDNA da RNA e amplificare al primo round prodotti DNA utilizzando trascrittasi inversa e una DNA polimerasi termostabile in un one-step RT-PCR.
    1. Prendere RNA di -80 ° C congelatore (se il congelamento fosse necessario) e brevemente scongelare a temperatura ambiente, poi posto nel blocco freddo. Trasferire 5 ml di RNA per ogni tubo di PCR contenente 45 ml di master mix per dare un volume finale di 50 ml. Porre immediatamente restanti campioni di RNA in -80 ° C freezer.
    2. Dopo enzima è unadded al primo turno PCR Master Mix (Tabella 1A), aliquota 45 microlitri in ciascun tubo di amplificazione PCR a parete sottile per il numero di reazioni desiderate. Assicurarsi di utilizzare provette PCR con i singoli tappi e non togliere i tappi per garantire il minimo la contaminazione incrociata tra i campioni. Mettere provette PCR in un blocco freddo per proteggere la RT enzima e RNA template sensibile alla temperatura. Nota: I campioni devono essere eseguiti in triplice copia, al fine di adeguatamente assaggiare le quasispecie virali. E 'anche importante utilizzare un prodotto con una elevata fedeltà enzima DNA polimerasi per minimizzare misincorporation PCR-introdotta. Si prega di fare riferimento alla lista reagenti per il prodotto consigliato.
    3. Dopo il modello di RNA è stato aggiunto a tutte le provette di reazione, trasferimento provette per PCR a un termociclatore per l'amplificazione utilizzando il programma cycler descritto nella Tabella 1B. Nota: Il prodotto di questa amplificazione sarà utilizzato in un secondo turno nested PCR.
  3. Eseguire un nidificato second tutto l'amplificazione PCR, utilizzando 1 ml del primo turno di amplificazione PCR (1.2) come modello di DNA.
    1. Aliquota 49 ml di secondo turno master mix di PCR (Tabella 2A) a ciascuna provetta PCR a parete sottile per il numero di reazioni desiderate. Trasferire 1 ml del primo turno amplificazione PCR per ciascun tubo di reazione per dare un volume finale di 50 ml. Nota: Questo servirà DNA come modello per l'amplificazione secondo turno. E 'anche importante utilizzare una DNA polimerasi con capacità molto alta fedeltà e revisione al fine di minimizzare misincorporation PCR-introdotta. Si prega di fare riferimento alla lista reagenti per il prodotto consigliato.
    2. Trasferimento secondo turno Miscela di reazione PCR per termociclatore ed eseguire il programma descritto nella Tabella 2B. Nota: Dopo il completamento del programma, i prodotti di questa reazione vengono eseguiti su un gel di agarosio per confermare la produzione del prodotto.
  4. Aggiungere 3 ml di 5x loading dye a 5 & #181, l del 50 microlitri volume di reazione secondo turno e correre a 120 V su un gel di agarosio-TAE 1% contenente una macchia di DNA fluorescente agli UV fino a quando le bande sono risolti. Visualizza 1.6 kb bande su un illuminatore luce blu (vedi Figura 1A).
  5. Eseguire il restante volume di reazione di 45 microlitri su un gel di agarosio-TAE 1% contenente una macchia di DNA, e asportare le bande appropriate con una lama di rasoio pulito.
    1. Estrarre DNA dalla fetta gel utilizzando un kit di purificazione gel, eluire in acqua priva di nucleasi, unire tre reazioni positive per ogni individuo, e congelare prodotto a -20 ° C per un uso successivo.

2. Preparazione ampliconi gag per la clonazione di Introduzione dei siti di restrizione necessari

  1. Amplificano la Ripetizione lungo Terminal (LTR) / 5 'UTR parte del plasmide MJ4 (vedi Tabella 3).
  2. Visualizza 1.3 kb PCR prodotti illuminatore, accise ampliconi positivi, gel purificare e congelare come precedentementedescritto (1.4,1.5; vedi Figura 1B).
  3. Crea fuso MJ4 LTR- ampliconi gag via "splice-overlap-estensione" PCR (vedi tabella 4).
  4. Visualizzare, accise, purificare, e congelare gli ampliconi 3.2 kb come in 1.4,1.5 (vedi Figura 1C).

3. Clonazione Amplified gag geni nel MJ4, sottotipo C, infettiva Clone molecolare

  1. Digest 1.5 mg di MJ4 plasmide e 1,5 mg di prodotto purificato LTR- gag PCR con il BclI (metilazione sensibili) endonucleasi di restrizione per 1,5 ore a 50 ° C (vedi Tabella 5A).
  2. Aggiungere 1 ml di NgoMIV alla reazione di digestione e incubare a 37 ° C per 1 ora.
  3. Aggiungere carico 5x dye a restrizioni digerire reazioni e lentamente il volume totale elettroforesi su gel di agarosio-TAE 1% contenente una macchia gel DNA per 1-2 ore a 100 V. Visualize, accise, e purificare bande indicate per la clonazione come precedentemente discribed (vedi Figura 2).
  4. Preparare le reazioni legatura usando purificata LTR- inserto gag e MJ4 vettore DNA a 3: 1 inserto rapporto vettore. Incubare le reazioni legatura notte a 4 ° C (vedi Tabella 5B).
  5. Trasforma JM109 batteri chimicamente competenti con prodotti legatura e la diffusione su piastre di agar LB con 100 mg / ml di ampicillina e crescere a 30 ° C per 22 + ore.
    1. Scongelare JM109 cellule competenti in ghiaccio per 15 min. Etichettare provette da 1,5 ml microcentrifuga e freddo su ghiaccio.
    2. Aliquota 50-100 ml di cellule JM109 di pre-refrigerata 1,5 ml provette da microcentrifuga. Aggiungi 2,5-5 ml di reazione legatura a JM109 cellule, sfogliando il tubo leggermente per mescolare e subito tornare in ghiaccio. Incubare le cellule competenti prodotto legatura in ghiaccio per 30 min.
    3. Shock termico 1,5 ml provette da microcentrifuga contenenti cellule competenti JM109 e reazione legatura in un blocco di calore 42 ° C per 45 secondi e riprendere il ghiaccio per almeno 3 min.
    4. Aggiungere 50 ml di mezzi SOC a ciascuna provetta e piastra tutta reazione di trasformazione sulla temperatura ambiente LB-agar piastre integrate con 100 mg / ml di ampicillina.
    5. Piastre di trasferimento ad un 30 ° C incubatore e lasciare per 20 ore, o fino a quando le colonie sono chiaramente formate.
  6. Scegli colonie isolate e crescere in 4 ml di LB con 100 mg / ml di ampicillina a 30 ° C per 22 + ore.
  7. Spin down culture a 3.200 xg per 15 minuti, versare il brodo fuori, ed estrarre DNA plasmidico.
  8. Per confermare la clonazione fedeltà, tagliare il DNA miniprep con NgoMIV e HPAI enzimi di restrizione in un doppio digerire a 37 ° C per 2 ore. Analizzare il 1% gel-TAE (vedi Tabella 5C).
  9. Sequenza regione inserto LTR-gag di ogni plasmide utilizzando i seguenti primers: GagInnerF1, GagF2, Rev1, Rev3, e GagR6 (Tabella 6) per confermare l'identità di sequenza.
  10. Confronta le sequenze clonate ottenuti con la popolazione di sequenze derived dal amplicone purificato iniziale 1.5.1. Nota: E 'importante valutare in ultima analisi, la capacità di replica di due cloni indipendenti al fine di garantire che qualsiasi fenotipi di replica in vitro non sono dovuti a errori di backbone introdotti durante il processo di clonazione.

4 Generazione e titolazione di replica competenti Gag-MJ4 chimerici virus

  1. Generare la replicazione del virus competente trasfettando 1.5 mg del chimerico MJ4 plasmide miniprep DNA in cellule 293T con un rapporto 4: 1 di Fugene HD come descritto dal Principe et al 39.
  2. Titolo raccolte le riserve di virus sulle cellule TZM-bl come descritto di seguito e in Prince et al 39.
    1. Piatto TZM-bl cellule 24 ore prima dell'infezione con il virus in modo da avere un monostrato di cellule confluenti 30-40% il giorno successivo. In genere, può essere ottenuto aggiungendo 5 x 10 4 cellule in un volume totale di 800 microlitri per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti.
    2. Dopo aver aggiunto le cellule al pozzo, spostare delicatamente la piastra di 24 pozzetti in avanti e indietro, poi un lato all'altro in modo da distribuire in modo efficiente le cellule. Mai turbinio - questo si tradurrà in cellule accumulano nel centro della piastra.
    3. Il giorno seguente, preparare 1% FBS in DMEM; questo verrà utilizzato per diluire DEAE-Destrano e per diluire le scorte di virus. Archivio DEAE-Destrano è di 10 mg / ml o 125x, e una concentrazione finale di è desiderato 80 mcg / ml o 1x.
    4. Togliere virus magazzino da testare da -80 ° C freezer e posto su agitatore per scongelare a temperatura ambiente.
    5. Usando una pipetta multicanale, in serie diluire le riserve di virus in una cultura a fondo tondo tessuto trattato piastra da 96 pozzetti con coperchio. Si tratta di un protocollo di diluizione 3 volte. Vedere la Tabella 7 per il sistema di diluizione.
    6. Rimuovere i supporti da piastre da 24 pozzetti TZM-bl seminate utilizzando un aspiratore a vuoto facendo attenzione a non disturbare monostrato cellulare. Rimuovere il supporto solo da una piastra a 24 pozzetti alla volta in modo che le cellule fannoNon asciugare.
    7. Aggiungere 150 ml di 1x DEAE-Destrano + 1% FBS in DMEM miscela in ogni pozzetto usando una pipetta di 1.000 ml. Non utilizzare ripetere pipetta come questo sconvolge il monostrato.
    8. Aggiungere 150 ml di ogni diluizione virus per il bene appropriato. Aggiungi virus al centro del pozzo e miscelare delicatamente per distribuire uniformemente il virus attraverso il monostrato cellulare. Incubare le cellule infette per 2 ore in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C e 5% di CO 2.
    9. Dopo l'incubazione 2 ore, aggiungere 0,5 ml di 10% FBS in DMEM a ciascun bene e tornare piastre ad incubatore per un supplemento di 48 ore.
    10. Dopo 48 ore, le cellule dovrebbero essere al 100% confluenti. Perché MJ4 è un virus competente replica, ci sarà qualche morte cellulare, ma questo è da aspettarselo.
    11. Rimuovere i supporti di ogni bene e aggiungere 400 ml / pozzetto di soluzione di fissaggio (vedi Tabella 8A per ricetta). Fissare un solo piatto per volta. Aggiungi il fissaggio soluzione con una pipetta 1000 ml, e lasciate riposare per 5 minuti atemperatura ambiente.
    12. Rimuovere la soluzione di fissaggio e lavare 3 volte con PBS con Ca 2 + / Mg 2 +. Utilizzare uno spruzzatore per aggiungere delicatamente PBS al lato del bene per evitare di interrompere il monostrato. Dopo il terzo lavaggio, asciugare piatto asciugare su carta assorbente.
    13. Aggiungere 400 ml / pozzetto di soluzione colorante (vedi Tabella 8B per la ricetta) in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti e incubare a 37 ° C per almeno 2 ore. Tempi di incubazione più lunghi sono accettabili, ma i tempi di incubazione dovrebbero essere mantenuti coerenti tra esperimenti titolazione.
    14. Lavare 2x con PBS con Ca 2 + / Mg 2 + e il punteggio per l'infezione, o aggiungere PBS e conservare a 4 ° C per il punteggio più tardi. Le piastre possono essere conservati a 4 ° C fino a quattro giorni, finché il monostrato viene mantenuta idratata.
    15. A segnare per l'infezione, utilizzare un pennarello indelebile per dividere pozzetti della piastra da 24 pozzetti in quadranti. Contare tutte le cellule blu all'interno di un campo di vista, utilizzando un ingrandimento totale di 200X, una volta inciascuno dei quattro quadranti di un pozzo.
    16. Calcola unità infettive per ml come segue: [(# cellule blu / 4) x 67] / (ml virus aggiunto) = IU / ml. Fare riferimento alla Tabella 8C per il volume in ml di virus aggiunto a ciascun pozzetto. Media diversi pozzi insieme; i numeri dovrebbero essere relativamente simile per una titolazione accurata.

5 Preparazione di cultura media e propagazione di cellule in vitro per GXR25 replica Assay

  1. Preparare completo RPMI (cRPMI) per la propagazione delle cellule GXR25. NOTA: E 'estremamente importante per le cellule cultura GXR25 almeno 4 mesi prima esperimenti di replica previste (vedi Tabella 9).
  2. Cellule Split 01:10 due volte a settimana e mantenere la densità delle cellule fra 1 x 10 5 a 2 x 10 6 cellule / ml.

6. In replica vitro di Gag-MJ4 Chimere in GXR25 (CEM-CCR5-GFP) Celle

  1. Il giorno prima l'infection, dividere cellule ad una concentrazione tra 2-3 x 10 5 cellule / ml in modo che siano in crescita logaritmica del giorno dell'infezione.
  2. Il giorno di infezione, rimuovere le riserve di virus da -80 ° C freezer e scongelare. Calcolare il volume di virus necessaria ciascuno stock sulla base della UI / ml titolo di dosaggio cella TZM-bl per infettare 5 x 10 5 cellule GXR25 ad una molteplicità di infezione di 0,05, con la formula:
    Volume di virus per l'infezione (ml) = 1 ml / X UI x 0.05 x 500.000
    NOTA: Abbiamo scelto una MOI di 0,05 come questo si traduce in una fase di crescita logaritmica per tutti i virus che abbiamo testato. È importante condurre esperimenti iniziali per determinare l'ottimale MOI per catturare la crescita logaritmica per il virus da testare.
  3. Diluire virus in cRPMI ad un volume di 100 microlitri (per ottenere un MOI 0,05) e inserirlo in un pozzetto di una coltura tissutale V-Fine trattati piastra da 96 pozzetti. Nota: Includere sia positive (MJ4 WT infetto) e negativo (cellule infettate finto) controllo in ogni serie di esperimenti di replica. Impostare la piastra tale che ogni altra colonna è vuota per limitare la contaminazione incrociata tra i pozzetti. Il controllo positivo è indispensabile, come sarà utilizzato in seguito come standard per normalizzare le piste di replica, che sono una misura del tasso di replicazione di repliche sperimentali.
  4. Contare le celle GXR25 utilizzando un contatore automatico di cellule. Calcolare il numero di cellule necessarie in totale per tutte le infezioni (5 x 10 5 x # infezioni). Aliquota il volume richiesto in un tubo da 50 ml e centrifugare a pellet di cellule. Calcolare Sempre per il 25% le infezioni più del necessario.
  5. Supporti Aspirare accuratamente e risospendere in cRPMI una concentrazione di 5 x 10 5 cellule / 100 microlitri.
  6. Cellule Pipettare in un trogolo sterile e mescolare accuratamente. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml di cellule in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti contenenti il ​​virus diluito. Mix accuratamente.
  7. Aggiungere 2 ml di soluzione 5 mg / ml (100x) di polibrene in ogni pozzetto e mescolare accuratamente cellule.
  8. Incubare a 37 ° C nel tessuto cultura incubatore con il 5% di CO 2 per 3 ore.
  9. Per lavare le cellule infette, centrifuga 96 pozzetti piastra V-bottom a pellet di cellule. Quindi rimuovere con cautela 150 ml di medium e sostituirlo con fresche 150 ml di cRPMI senza disturbare il pellet di cellule. Ripetere altre 2 volte (compresa la centrifugazione) per lavare sufficientemente cellule.
  10. Dopo l'ultima centrifugazione e l'aggiunta di 150 ml cRPMI, risospendere il pellet cellulare con una pipetta multicanale e aggiungere la miscela di cellule / virus (circa 200 ml) da ciascun pozzetto indipendente a 800 ml di cRPMI in un pozzo di un tessuto 24 pozzetti piastra di coltura.
  11. Posizionare la piastra in 5% di CO 2 tessuto cultura incubatore a 37 ° C.
  12. Ogni due giorni, togliere 100 ml di surnatante dalla superficie della cultura bene e trasferire ad un ben-96 Upiastra -bottom e conservare congelati a -80 ° C fino al corretto funzionamento virus test quantificazione. NOTA: Disposizione accurata dei surnatanti in piastre a 96 pozzetti consentirà per il multi-canale di trasferimento pipetta di surnatanti di coltura durante virione quantificazione tramite un test radioattivo trascrittasi inversa (RT). Ogni piastra deve contenere campioni provenienti da uno standard di infezione al fine di normalizzare la variazione inter-piastra nel test di lettura RT.
  13. Dopo aver rimosso ogni campione 100 microlitri, celle divise 1: 2 da cellule accuratamente risospendere e rimuovendo la metà del volume residuo (450 microlitri). Ripristina volume originale (1 ml) con l'aggiunta di 550 ml di fresca cRPMI in ciascun pozzetto.

7 Analisi della trascrittasi inversa (RT) in coltura cellulare surnatanti

Protocollo adattato da Ostrowski et al 40.

  1. Impostare cappa di sicurezza biologica in una struttura BSL-3 per l'uso con materiali radioattivi.
    1. Posizionare la carta assorbente in hood e sostituire aspirazione per aspiratore designata per l'uso radioattivo. Nota: Tutti i rifiuti radioattivi devono essere correttamente smaltiti con conformità alle norme di sicurezza.
  2. Aggiungere 1-2 ml di 10 mCi / ml di [α- 33 P] dTTP e 4 ml di 1 M ditiotreitolo (DTT) per ogni 1 ml aliquota di RT master mix (vedi Tabella 10 e Ostrowski et al. 40).
  3. Mescolare accuratamente ogni provetta da 1,5 ml microcentrifuga di RT master mix, DTT, e [α- 33 P] dTTP con una pipetta 1.000 microlitri e trasferimento in un trogolo sterile.
  4. Versare 25 ml di etichetta RT mescolano in ciascun pozzetto di 96 pozzetti a parete sottile piastra PCR. Nota: Includere lo spazio per un controllo positivo (MJ4 infezione WT) e il controllo negativo (infezione Mock).
  5. Aggiungere 5 ml di ogni supernatante alla piastra PCR contenente la master mix RT.
  6. Sigillare piastra PCR con copertura foglio adesivo e incubare per 2 ore a 37 ° C in un termociclatore. Per motivi di sicurezza, rinSE puntali per pipette con Amphyl e smaltire punte in piccolo contenitore contenenti rifiuti Amphyl, che sarà poi essere smaltiti nei rifiuti radioattivi.
  7. Dopo l'incubazione, fare piccoli fori nella pellicola di copertura con un 200 microlitri pipetta multicanale. Nota: Se i puntali delle pipette toccano liquido in bene, sostituire suggerimenti prima di passare alla colonna successiva o riga.
  8. Mix campioni 5x e trasferimento 5 ml di ciascun campione sulla carta DE-81. Asciugare 10 min.
  9. Macchie Lavare 5x con 1x SSC (cloruro di sodio, citrato di sodio), e poi 2x con il 90% di etanolo a 5 minuti a lavaggio. Lasciare asciugare all'aria.
    1. Mettete ogni macchia in un contenitore lavaggio separato, come ad esempio una scatola di immagazzinaggio panino, aggiungere il tampone di lavaggio abbastanza (1x SSC o il 90% EtOH) per coprire macchia, e agitare per 5 minuti.
    2. Eliminare il tampone di lavaggio nel contenitore e ripetere separato. Nota: I primi 3 lavaggi sono considerati radioattivi e devono essere smaltite correttamente. Gli ultimi 2 lavaggi possono essere smaltiti regolarmente.
  10. Una volta asciutto, autoefully avvolgere macchia a Saran avvolgere ed esporre ad un phosphoscreen in un cassetto ben chiuso durante la notte a temperatura ambiente.
  11. Analizzare phosphoscreens con phosphorimager e quantificare trascrizioni radioattivi.
  12. Disegnare un cerchio attorno ad ogni segnale radioattivo utilizzando il software OptiQuant. Rappresentare graficamente i valori di Unità Digital Light (DLU) per generare le curve di replica.
  13. Al fine di generare punteggi di capacità di replica, i valori DLU erano log 10 -transformed e piste sono state calcolate utilizzando il giorno 2, 4, e 6 punti di tempo. Replica piste sono poi divisi per il pendio di WT MJ4 nei punteggi di capacità di replica ordine generare. E 'importante per normalizzare base ai valori MJ4 WT ottenuti dalla stessa piastra RT per ridurre la variabilità intra-saggio.

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Risultati

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Per eseguire correttamente questo protocollo, che crea un plasmide provirale in grado di assemblare completamente funzionale, infettive chimere Gag-MJ4, grande cura deve essere presa per generare le opportune ampliconi della PCR. Determinare se la PCR ha generato all'amplicon bavaglio di dimensioni appropriate è fondamentale. I prodotti dovrebbero essere meno di 100 paia di basi (bp) del amplicone circa 1.700 bp rappresentato nella figura 1A. La lunghezza esatta di questo frammento varierà a se...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A causa della lunghezza e la natura tecnica di questo protocollo, ci sono diversi passaggi che sono fondamentali sia per la costruzione di successo di plasmidi chimerici Gag-MJ4 nonché per la quantificazione della capacità di replicazione virale. Anche se la strategia di clonazione basata enzima di restrizione per l'introduzione di geni gag estera in MJ4 descritto in questo protocollo ha numerosi vantaggi rispetto ai metodi basati ricombinazione utilizzati in precedenza, il protocollo può essere tecnicament...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I ricercatori ringraziano tutti i volontari in Zambia che hanno partecipato a questo studio e tutto il personale dello Zambia Emory HIV Research Project a Lusaka che ha reso possibile questo studio. Gli investigatori desiderano ringraziare Jon Allen, Smita Chavan e Mackenzie Hurlston per l'assistenza tecnica e la gestione dei campioni. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Mark Brockman per le sue discussioni e la generosa donazione delle cellule GXR25.

Questo studio è stato finanziato da R01 AI64060 e R37 AI51231 (EH) e dall'International AIDS Vaccine Initiative. Questo lavoro è stato reso possibile in parte dal generoso sostegno del popolo americano attraverso l'Agenzia degli Stati Uniti per lo Sviluppo Internazionale (USAID). I contenuti sono sotto la responsabilità degli autori dello studio e non riflettono necessariamente le opinioni dell'USAID o del governo degli Stati Uniti. Questo lavoro è stato anche supportato, in parte, dal Virology Core presso l'Emory Center for AIDS Research (Grant P30 AI050409). DC e JP sono stati sostenuti in parte da Action Cycling Fellowships. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla sovvenzione di base dello Yerkes National Primate Research Center (2P51RR000165-51). Questo progetto è stato anche finanziato in parte dal National Center for Research Resources P51RR165 ed è attualmente supportato dall'Office of Research Infrastructure Programs/OD P51OD11132.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PCR Reagents
GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalt standard
VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalt standard
GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalt standard
BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalt standard
MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalt standard
MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCCTTCTAGC 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalt standard
BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, desalt standard
GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalt standard
For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalt standard
GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalt standard
Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalinizzazione standard
Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, desalinizzazione standard
CoolRack PCR 96 XTBiocisionBCS-529
CoolRack M15BiocisionBCS-125
Acqua priva di nucleasiFisherSH30538FSProdotto da Hyclone
QIAamp Viral RNA Mini KitQiagen52906
Simport PCR 8 provette a strisce, blu (tappo piatto)DaiggerEF3647BX
SuperScript III sistema RT-PCR in un solo passaggioLife Technologies/Invitrogen12574035
Phusion Hot-start II DNA polimerasiFisherF-549L
PCR Nucleotide MixRoche4638956001
Agarosio, alta resistenza del gelFisher50-213-128
TAE 10XLife Technologies/InvitrogenAM9869
Promega 1 kb Scala DNAFisherPRG5711Prodotto da Promega
Sybr Safe DNA Gel Stain, 10.000xLife Technologies/InvitrogenS33102
Wizard SV Gel e Sistema di pulizia PCRPromegaA9282
Lamette da barba, a taglio singoloFisher12-640Prodotto da Surgical Design
Thermocycler, PTC-200MJ Research
Microbiology & Reagenti di clonazione
LB Agar, MillerFisherBP1425-2
LB Brodo, LennoxFisherBP1427-2
Sterili 100 x 15 mm Piastre di Petri in polistireneFisher08-757-12
Ampicillina sale sodicoSigma-AldrichA9518-5G
Falcon 14 ml Polipropilene tubi a fondo tondoBD Biosciences
endonucleasi di restrizione NgoMIVNew England BioLabsR0564L
Endonucleasi di restrizione BclINew England BioLabsR0160L
Endonucleasi di restrizione HpaINew England BioLabsR0105L
T4 DNA ligasi, 5 U/μ lRoche10799009001
JM109 cellule competenti, >108 cfu/μ gPromegaL2001
Sistema di miniprep plasmidico PureYieldPromegaA1222
Safe Imager 2.0 Transilluminatore a luce bluInvitrogenG6600
Microfuge 18 centrifugaBeckman Coulter367160
Reagenti per colture cellulari
Pulitore/disinfettante per anfileFisher22-030-394
Fugene HD, 1 mlVWRPAE2311Prodotto da Promega
Hexadimethrine bromide (Polybrene)Sigma-AldrichH9268-5G
Costar Plates, 6 pozzetti, piattoFisher07-200-83Prodotto da Corning Life
Costar Plates, 24 pozzetti, piattoFisher07-200-84Prodotto da Corning Life
Piastre Costar, 96 pozzetti, rotondeFisher07-200-95Prodotto da Corning Life
Flasks, Filtro Corning superiore/collo inclinato, 75 cm2Fisher10-126-37
Flask, Filtro Corning superiore/collo inclinato, 150 cm2Fisher10-126-34Prodotto da Corning Life
Tubi conici, 50 ml, tappo bluFisher14-432-22Prodotto da BD Biosciences
Tubi conici, 15 ml, tappo bluFisher14-959-70CProdotto da BD Biosciences
Trypsin-EDTAFisherMT25052CIProdotto da Mediatech
RPMI, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11875-119
DMEM, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11965-118
Penicillina/ Streptomicina/Glutammina, 100xLife Technologies/Invitrogen10378-016
PBS con magnesio e calcio, 500 mlLife Technologies/Invitrogen14040-133
PBS senza magnesio e calcioLife Technologies/Invitrogen20012-050
Provette Sarstedt, colori assortitiSarstedt72.694.996
Vassoi serbatoio per Multicanale, 55 mlFisher13-681-501
DEAE-DextranFisherNC9691007
Corning 96 micropiastra trattata con coltura tissutale a V trasparenteFisher07-200-96Prodotto da Corning Life
HEPES, soluzione tampone 1 MLife Technologies/Invitrogen15630-080
FBS, definito, 500 mlFisherSH30070 03
X-galVWRPAV3941Prodotto da Promega
Glutaraldeide, Grado II, 25% in H2OSigma-AldrichG6257-100ML
1 M Soluzione di cloruro di magnesioSigma-AldrichM1028-100ML
Soluzione di formaldeide, per biologia molecolare, 36,5%Sigma-AldrichF8775-500ML
Potassio esacianoferrato(II) triidratoSigma-AldrichP9387-100G
Esacianoferrato di potassio(III)Sigma-AldrichP8131-100G
Centrifuga Allegra X15-RBeckman Coulter392932
TC10 contatore cellulare automatizzatoBio-Rad1450001
Microscopio invertito VistaVisionVWR
Reagenti per saggi di quantificazione della trascrittasi inversa
dTTP, [α-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCiPerkin-ElmerNEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8.0Life Technologies/Invitrogen15568025Deve essere regolato a pH 7.8 con KOH
2 M Cloruro di potassio (KCl)Life Technologies/InvitrogenAM9640GAdjust a 1 soluzione M
0,5 M EDTALife Technologies/Invitrogen15575-020
Nonidet P40Roche11333941103
Acido poliadenilico (Poly rA) sale di potassio Midland Reagente Co.P-3001
Oligo d(T) primerLife Technologies/Invitrogen18418-012
Ditiotreitolo (DTT)Sigma-Aldrich43815-1G
SR, schermo al fosforo a super risoluzione, piccoloPerkin-Elmer7001485
Corning Costar Thermowell 96-well plate model (M) PolicarbonatoFisher07-200-245Prodotto da Corning Life
Nastro sigillante in alluminio per micropiastre Corning a 96 pozzetti, Fisher non sterile07-200-684Prodotto da Corning Life
DE-81 carta a scambio anionicoWhatman3658-915
Citrato trisodico diidratoSigma-AldrichS1804-1KG
Cloruro di sodioFisherS671-3
Cassetta per autoradiografiaFisherFB-CA-810
Schermo di fosforo di stoccaggio a ciclonePackard
352059

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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