Caratterizzazione di G recettori accoppiati alla proteina da un calcio di Mobilitazione Assay Basato sulla fluorescenza

Sommario

La basato sulla fluorescenza calcio saggio mobilitazione qui descritto è un sistema di screening inversa farmacologia media produttività per l'identificazione di ligando funzionalmente attivazione (s) di orfani accoppiato a proteina G recettori (GPCR).

Abstract

Per più di 20 anni, farmacologia inversa è stata la strategia preminente per scoprire i ligandi attivazione di orfani G proteine ​​recettori accoppiati (GPCR). L'inizio di un saggio farmacologia inversa è la clonazione e successiva trasfezione di un GPCR di interesse in un sistema di espressione cellulare. Il recettore eterologo espresso viene poi sfidato con una libreria di composti di ligandi candidati per identificare il ligando (s)-recettore attivazione. Attivazione del recettore può essere valutato dai cambiamenti nella concentrazione di molecole di secondo messaggero del reporter, come il calcio o cAMP misura. Il calcio mobilitazione test basato sulla fluorescenza qui descritto è un mezzo di throughput di uso frequente inversione dosaggio farmacologia. Il GPCR orfano viene transitoriamente espresso in 293T embrionali renali umane (HEK293T) cellule e promiscua Gα ₁₆ costrutto è co-trasfettate. A seguito del legame al ligando, l'attivazione della subunità Gα ₁₆ induce il rilascio di calcio fRom Il reticolo endoplasmatico. Prima dello screening ligando, le cellule che esprimono i recettori sono caricati con un indicatore di calcio fluorescente, Fluo-4 acetossimetilico. Il segnale fluorescente di Fluo-4 è trascurabile in cellule in condizioni di riposo, ma può essere amplificato più di 100 volte sull'interazione con ioni di calcio che vengono rilasciati dopo l'attivazione del recettore. La tecnica descritta non richiede la creazione richiede tempo di linee cellulari stabilmente trasfettate in cui il materiale genetico trasfettate è integrato nel genoma della cellula ospite. Invece, una trasfezione transiente, generando espressione temporanea del gene target, è sufficiente per eseguire il test di screening. La configurazione permette di medio-capacità di proiezione di centinaia di composti. Co-trasfezione del promiscua Gα _16, che si accoppia alla maggior GPCR, permette la via di segnalazione intracellulare da reindirizzare verso il rilascio di calcio, indipendentemente dalla via di segnale nativo in sett endogenoIngs. Le cellule HEK293T sono facili da gestire e hanno dimostrato la loro efficacia nel corso degli anni nel recettore saggi deorphanization. Tuttavia, l'ottimizzazione del saggio per i recettori specifici può rimanere necessaria.

Introduzione

Recettori accoppiati alla proteina G (GPCR) costituiscono uno dei più grandi e più varie famiglie tra tutte le proteine ​​della superficie cellulare. La loro presenza nei vertebrati, invertebrati, piante, lieviti e muffe melma, nonché in protozoi e la prima diploblastic Metazoa indica che GPCR sono tra le molecole più antichi collegati con la trasduzione del segnale ^1. I loro ligandi naturali attivazione comprendono una grande varietà di stimoli esterni, tra cui peptidi, ammine biogene, odoranti, glicoproteine, e fotoni ^2. Come tali, questi sistemi di segnalazione recettore-ligando sono coinvolte in una grande varietà di processi fisiologici. L'ampio spettro funzionale li rende particolarmente adatti per lo sviluppo di farmaci terapeutici che coprono una vasta gamma di malattie umane. Circa il 50-60% dei bersagli farmacologici attuali sono rappresentati da GPCR ^3,4. Oltre alla loro grande importanza nel settore farmaceutico, GPCR sono anche sotto i riflettori per lo sviluppo di unnuova generazione di specie-specifici insetticidi ^5,6 e pesticidi in genere. Poiché i ligandi naturali di molti GPCR sono ancora non identificati, sono classificati come GPCR orfani. La deorphanization di questi recettori migliorerà la comprensione dei loro ruoli fisiologici negli organismi e può scoprire bersagli putativi per le nuove applicazioni della droga ^7.

Dal momento che la genomica, la strategia farmacologia inversa viene ampiamente applicato per la deorphanization dei GPCR ^8. L'approccio implica che un recettore orfano viene utilizzato come un 'gancio' a 'ripescare' il suo ligando attivazione da un estratto biologico o da una libreria di composti sintetici. Il GPCR di interesse è quindi clonato e successivamente trasfettati in un sistema di espressione cellulare. Nei metodi più comunemente utilizzati, l'attivazione del recettore è determinata dai cambiamenti nella concentrazione di molecole secondo messaggero misura ⁹ (ad esempio, equorina) ¹⁰ o indicatori calcio fluorescenti (ad esempio, Fluo-4) ^11. I saggi basati sulla fluorescenza, in cui le cellule che esprimono i recettori sono caricati con un indicatore fluorescente calcio prima dello screening ligando, hanno il vantaggio che essi consentono screening ad alto rendimento grazie alla loro facilità di utilizzo, tempo di lettura breve, e la flessibilità dello screening molteplici recettori orfani su una singola piastra ^12.

Qui, il calcio test mobilitazione basato sulla fluorescenza è accuratamente descritto ed illustrato dal processo deorphanization della Drosophila melanogaster breve neuropeptide F (SNPF) recettore. Questo sistema di segnalamento neuropeptidergic stato originariamente caratterizzato da Mertens et al. nel 2002 ¹³ con un saggio di bioluminescenza calcio eseguita in ovariche di criceto cinese (CHO)¹⁴ e da Feng et al. Nel 2003 con un saggio elettrofisiologico utilizzando ovociti di Xenopus ^15. La presenza del sistema di segnalazione SNPF sembra essere limitata al phylum degli Arthropoda, dove è implicato in una vasta gamma di processi compreso il regolamento di alimentazione, la crescita, reazioni di stress, la locomozione, e ritmi circadiani ^16.

La ricerca sui sistemi di segnalamento neuropeptidergic negli insetti può non solo portare a nuovi bersagli per lo sviluppo di insetticidi, ma la conoscenza del loro funzionamento può anche essere estrapolati verso gli altri organismi, come molti sistemi di segnalamento sono stati generalmente ben conservati nel corso dell'evoluzione ^17. Negli ultimi dieci anni, sono stati compiuti grandi progressi nel processo deorphanization di GPCR neuropeptide insetti. Nonostante questi sforzi, solo un piccolo numero di recettori sono stati abbinati al loro legante affine, e carichi di informazioni di sequenza pernuove GPCR orfani è diventato disponibile a causa della forte espansione della genomica ^18. La disponibilità di / approcci di screening high-throughput medio, come il calcio mobilitazione test basato sulla fluorescenza, che ha dimostrato di essere una tecnica ampiamente applicata ^9,18, è quindi prezioso.

Il calcio mobilitazione saggio basato sulla fluorescenza come qui descritto viene eseguita in 293T rene embrionale umano (HEK293T) linea cellulare e utilizza una sonda fluorescente per determinare le variazioni delle concentrazioni intracellulari di calcio all'attivazione recettoriale. Per garantire un'elevata espressione e livelli di traduzione del recettore, una sequenza di consenso Kozak ¹⁹ viene aggiunto all'estremità 5 'della sequenza codificante-recettore, che viene successivamente clonato in un vettore di espressione (ad esempio, serie vettore pcDNA per linee cellulari di mammifero). Poiché è difficile prevedere il endogeno proteina G accoppiamento di un GPCR orfano basato su informazioni di sequenzada solo, il secondo molecole messaggere (ad esempio, calcio o cAMP) che sono modulati dopo l'attivazione del recettore spesso rimangono sconosciute prima dell'identificazione ligando. Per aggirare questo problema, promiscui proteine ​​G della famiglia G _q (ad esempio, murino Gα ₁₅ o Gα umano ₁₆ [usato qui]) o proteine ​​chimeriche G (ad esempio, Gα _qi5) che interagiscono con la maggior parte dei GPCR e inducono il rilascio di calcio può essere co-espressi ^20,21,22. Dopo il legame del ligando al suo recettore, il GPCR subisce un cambiamento conformazionale che porta all'attivazione di specifiche vie intracellulari. La guanosina difosfato (GDP) molecola, legata in condizioni di riposo alla subunità Gα _16, sarà sostituito da un trifosfato guanosina (GTP) molecola. Questo provoca la dissociazione della proteina eterotrimerica G in un Gα ₁₆ e Gβγ subunità. La subunità Gα ₁₆ attiva la fosfolipasi C &# 946; (PLCβ), che a sua volta idrolizza il legato alla membrana fosfatidilinositolo bifosfato (PIP ₂₎ con conseguente diacilglicerolo (DAG) e inositolo trifosfato (IP _3). IP ₃ si diffonderà in tutto il citoplasma e attiva IP canali del calcio _3-dipendenti presenti nella membrana del reticolo endoplasmatico, che induce il rilascio di calcio nel citoplasma.

Il rilascio del calcio su attivazione del recettore avviene in pochi secondi e può essere rilevato da celle di carico prima del saggio di screening con un colorante sensibile al calcio, come Fluo-4 acetossimetilico (AM) ^11. Il gruppo estere AM consente il fluoroforo di attraversare la membrana cellulare e viene tagliata fuori dalle esterasi citoplasmatiche volta all'interno della cellula. Di conseguenza, le cariche negative dei coloranti fluorescenti vengono smascherati, impedendole di diffondere fuori dalla cellula e permettendogli di interagire con ioni calcio. Il segnale o fluorescentef Fluo-4 è trascurabile in cellule in condizioni di riposo solo contenenti concentrazioni di calcio nell'intervallo nanomolare. Tuttavia, quando il calcio viene rilasciato in seguito ad attivazione del recettore, il segnale può aumentare concentrazione-dipendente per più di 100 volte, garantendo così un elevato rapporto segnale-rumore. Fluo-4 presenta anche una vasta gamma dinamica della notifica [calcio] intorno a un K _d (calcio) di 345 nM, che lo rende adatto per misurare le variazioni di calcio fisiologicamente rilevanti in una vasta gamma di celle. L'eccitazione di Fluo-4 avviene a 488 nm e l'emissione di fluorescenza viene misurata a 525 nm ^11. Fluorimetri come il lettore di piastre fluorescenza (FLIPR) ^23, il NOVOSTAR, o il FlexStation (per stazioni) ¹² sono / sistemi high-throughput medio che consentono aggiunta del composto simultanea e il rilevamento del segnale di Fluo-4 all'attivazione dei recettori per ogni pozzo in una piastra di saggio. Il saggio mobilizzazione del calcio qui descritto si basa sulla stazioneDispositivo 96 pozzetti sistema micropiastra.

Il software SoftMax Pro (software) è utilizzato per azionare il dispositivo ferroviaria nonché per l'analisi dei dati. Il programma visualizza subito i risultati come grafici in formato a 96 pozzetti. Pozzi multipli possono essere selezionati contemporaneamente per confrontare i risultati di questi pozzetti nello stesso grafico. Valori dell'unità fluorescente relativa (RFU) di pozzetti in ogni colonna sono misurati contemporaneamente per un periodo di due minuti, partendo prima dell'aggiunta di composti ai pozzetti e continua dopo la misurazione del segnale di fluorescenza dopo l'attivazione del recettore. Tipicamente, l'andamento di una curva agonista allinea con la linea di base fino a un composto attivazione viene aggiunta alle cellule, con un conseguente rapido aumento del segnale fluorescente. L'altezza di picco è correlata con la concentrazione agonista finale nel pozzo. Dopo il picco, il segnale fluorescente scende lentamente verso il livello basale. La misura RFU can essere convertito in curve concentrazione-risposta per determinare il valore _EC50 (concentrazione efficace massimale metà) di un ligando. In generale, almeno tre schermi indipendenti, ognuna con tre repliche di una serie di concentrazioni, deve essere eseguita a comporre una curva di concentrazione-risposta affidabile.

Si raccomanda di includere diversi controlli positivi e negativi nel disegno sperimentale. Prima di tutto, un controllo trasfezione, cioè l'attuazione di un recettore con un ligando noto, deve essere testato. Ciò consente di verificare se l'agente trasfezione era operativa. Incorporazione di un esperimento di controllo con un agonista di un recettore endogeno della linea cellulare e un controllo negativo (ad esempio, tampone di lavaggio) Si raccomanda inoltre di monitorare la salute e la vitalità delle cellule e di escludere la possibilità che il tampone di lavaggio è stato contaminato con un fattore che potrebbe provocare un auto-fluorerisposta profumo. Agonisti usati sono un peptide derivato dalla proteasi-activated receptor-1 (PAR _1), che agisce come un agonista selettivo PAR _1, o carbacolo, che attiva il recettore dell'acetilcolina. Cellule trasfettate con un vettore di espressione vuota dovrebbero essere testati per escludere che i composti attivi interagiscono con i recettori endogeni della cellula. Ottimizzazione dei diversi parametri descritti nel protocollo di seguito può essere richiesto per sistemi diversi di segnalamento. Una figura schematica del calcio completa mobilitazione saggio basato sulla fluorescenza è illustrato nella Figura 1.

Figura 1. Schema generale del calcio dosaggio mobilitazione basato sulla fluorescenza. Automatizzato di gestione dei liquidi e fluorescenza simultanea misurazioni vengono effettuate con la stazioneLettore di dispositivo di micropiastre, guidato dal software. Il dispositivo della stazione contiene tre cassetti: uno per la piastra di cella, piatto composto e punta rack. I trasferimenti Pipettatore build-in composti da una colonna della piastra composto alla colonna corrispondente della piastra di cella (passo 1). Ciascun pozzetto della piastra di cella contiene un monostrato di cellule HEK293T che sono state co-trasfettate con il GPCR di interesse e la subunità promiscua Gα _16. Quando un composto attiva il recettore, il Pil Gα _16-bound viene sostituito da GTP. La subunità Gα ₁₆ dissocia successivamente dal complesso Gβγ e attiva la fosfolipasi Cβ (PLCβ), che a sua volta idrolizza fosfatidilinositolo bifosfato (PIP ₂₎ con conseguente diacilglicerolo (DAG) e inositolo trifosfato (IP _3). IP ₃ attiva IP canali presenti nella membrana del reticolo endoplasmatico calcio _{3-dipendente,} inducendo il rilascio di int calcioo il citoplasma. L'interazione di calcio con Fluo-4 (con cui le cellule vengono caricati prima complicare aggiunta) si traduce in un segnale fluorescente (passaggio 2). Il software presenta i risultati come unità di fluorescenza relativa valori (RFU) in funzione del tempo, e altezze correla con la concentrazione del ligando in modo concentrazione-dipendente. Questi dati possono poi essere convertiti in una curva concentrazione-risposta per determinare il valore EC ₅₀ di una coppia ligando-recettore (passaggio 3).

Protocollo

Nota: Tutte le azioni in cui sono coinvolte cellule devono essere effettuate in un ambiente sterile, lavorando in un flusso laminare.

1. Manutenzione della linea HEK293T cellulare

1. Crescere le cellule HEK293T in un pallone T-75 a 37 ° C in un incubatore umidificato CO ₂ 5%.
2. Passaggio cellule quando viene raggiunta una confluenza del 80%. Nota: Questo richiede normalmente 3-4 giorni. Le cellule in coltura continua permettono 20-25 passaggi utilizzabili per lo screening.
   1. Posizionare tampone fosfato del Dulbecco (PBS) senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio,-tripsina-etilendiamminotetraacetico PBS acido (EDTA) (500 ml PBS arricchito con 10 ml di soluzione di tripsina-EDTA e 4,5 ml 4% EDTA) e terreno di crescita (500 ml mezzo di Eagle modificato da Dulbecco - alte concentrazioni di glucosio [DMEM] supplementato con 10% di siero fetale bovino [FBS] e 1 mm penicillina-streptomicina [PS]) a temperatura ambiente mezz'ora in anticipo.
   2. Rimuovereil vecchio terreno di crescita dalle cellule. Risciacquare le cellule morte con 3 ml di PBS e togliere la PBS.
   3. Aggiungere 3 ml di PBS-tripsina-EDTA, incubare per 1 min a temperatura ambiente e rimuovere la soluzione Nota: La morfologia delle cellule cambierà da a-forma di sfera a forma di stella.
   4. Allentare le cellule dal fondo del pallone picchiettando leggermente e raccogliere le cellule risciacquando le peggiori diverse volte con 10 ml di terreno di coltura fresco.
   5. Trasferire 1 ml della coltura cellulare in un nuovo T-75 pallone contenente 14 ml di terreno di coltura fresco, e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato CO ₂ 5%.

2. Trasfezione transiente delle cellule HEK293T

1. Crescere le cellule HEK293T in un pallone T-75 3 giorni prima del dosaggio effettivo mobilizzazione del calcio avviene. Assicurarsi di utilizzare tre T-75 palloni, uno per trasfezione con il costrutto recettore, una per trasfezione con un vettore vuoto di espressione, come controllo negativo, e one per il controllo trasfezione. Nota: Il passaging delle celle viene eseguita come descritto al punto 1.2. Quando più piastre a 96 pozzetti devono essere schermati, T-150 palloni possono essere utilizzati per ottenere un rendimento più elevato di cellule (per fare questo, doppie tutti i quantitativi indicati nei punti 1.2.5, 2.3, 3.1.3 e 3.1.4) .
2. Incubare le beute a 37 ° C in un incubatore umidificato CO ₂ 5% per 20-24 ore fino a che le colture cellulari avvicinano 50-70% di confluenza.
3. Co-trasfezione una popolazione di cellule con il vettore di espressione codificante la GPCR di interesse e l'Gα ₁₆ costrutto, il secondo pallone con il vettore vuoto e il costrutto Gα _16, e il terzo con il controllo e la trasfezione Gα ₁₆ costrutto. Nota: In questo protocollo, il recettore Drosophila SNPF è stato clonato in un vettore di espressione di mammifero pcDNA3.1 ^13. JetPRIME stato utilizzato per eseguire la trasfezione, ma altri reagenti di trasfezione può essere utilizzato come bene.
   1. Aggiungi aotale di 7,8 mg DNA (3,9 mcg costrutto recettore o vettore vuoto, e 3,9 mg Gα ₁₆ costrutto di espressione) in una provetta da 1,5 ml e aggiungere 500 ml di buffer JetPRIME. Mescolare bene nel vortex la provetta e centrifugare a breve.
   2. Aggiungere 37,5 ml di reagente JetPRIME, vortex e centrifugare per 1 minuto a 14.000 x g. Incubare la miscela di trasfezione 10 min a temperatura ambiente.
   3. Aggiungere goccia a goccia la miscela di trasfezione al mezzo di coltura cellulare e assicurarsi di pipettare direttamente nel terreno evitando il contatto con le pareti del pallone di coltura. Incubare le beute a 37 ° C in un incubatore umidificato CO ₂ 5% per 20-24 ore.

3. Calcio mobilitazione Assay

1. Raccogliere le cellule transfettate e le sementi in, piatti trasparenti con fondo nero con pareti da 96 pozzetti.
   1. Posizionare il PBS, PBS-tripsina-EDTA e il supporto di trasferimento DMEM (500 ml DMEM supplementato con 10% FBS dializzatoe 1% PS) a temperatura ambiente mezz'ora in anticipo.
   2. Rivestire la 96-ben chiare piastre di fondo nero a parete con 60 ml di PBS con fibronectina (0,0025%) per pozzetto (5,85 ml di PBS e 150 microlitri fibronectina [0.1%] per piastra). Incubare le piastre a temperatura ambiente per 1 ora con il coperchio. Rimuovere la soluzione dai pozzetti e incubare nuovamente le piastre per 1 ora senza il coperchio a temperatura ambiente. In alternativa, è possibile usare le piastre pre-sensibilizzate per l'adesione delle cellule migliorata.
   3. Togliere il vecchio mezzo di coltura dalle cellule e lavare le cellule morte off con 3 ml di PBS e rimuovere il PBS.
   4. Aggiungere 3 ml di PBS-tripsina-EDTA, incubare per 1 minuto, quindi rimuovere la soluzione. Nota: La morfologia delle cellule cambia da stella a forma a sfera a forma di.
   5. Allentare le cellule dal fondo del pallone picchiettando leggermente e raccoglierli risciacquando più volte con 10 ml di terreno DMEM trasferimento. Trasferire le cellule in una provetta Falcon da 50 ml.
   6. Contare ilnumero di cellule per ml (eseguita con un NucleoCounter qui, ma una camera di Burker è accettabile). Aggiungere 100 microlitri della coltura cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Aggiungere 100 microlitri di buffer di lisi e mescolare toccando il tubo. Aggiungere 100 microlitri tampone stabilizzante e mescolare toccando.
   7. Riempire un NucleoCassette con la sospensione cellulare e contare le cellule con il contatore. Moltiplicare il numero di celle da tre, come le cellule sono state diluite di un fattore tre quando si aggiunge la lisi e stabilizzante buffer nel punto 3.1.6.
   8. Diluire le cellule ad una concentrazione finale di 600.000 cellule / ml e 150 ml di seminare le cellule per pozzetto in piastre rivestite per ottenere una densità cellulare di circa 90.000 cellule per / pozzetto. Evitare bolle d'aria e toccare la piastra per diffondere uniformemente le cellule al fine di ottenere uno strato di cellule contigue. Incubare le piastre a 37 ° C in un incubatore umidificato CO ₂ 5% per 16-24 ore.
2. Caricare le cellule con il colorante fluorescente e preparare il coPiastra mpound.
   1. Preparare la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) / HEPES / Ca ^{2 +} / albumina sierica bovina (BSA) buffer: aggiungi 165 microlitri CaCl ₂ soluzione stock (1 M CaCl ₂ in acqua distillata [dH ₂ O] - conservare a temperatura ambiente), Soluzione 500 HEPES microlitri magazzino (1 M HEPES in dH ₂ O, pH 7,4 - conservare a temperatura ambiente), e 0,05 g BSA a 50 ml HBSS. Si noti che l'acido grasso libero BSA è utilizzato per le prove di calcio, come acidi grassi possono attivare i recettori specifici, compromettendo il segnale di calcio del recettore di interesse.
   2. Preparare la soluzione probenecid (100x, 250 mm): sciogliere 0,71 g di probenecid in 5 ml NaOH (1 M) e aggiungere 50 microlitri magazzino HEPES soluzione e 5 ml della / HEPES / Ca ^{2 +} / tampone BSA HBSS - preparare sempre soluzione fresca. Nota: probenecid inibisce trasportatori di anioni inorganici che può rimuovere Fluo-4 dal citoplasma, riducendo così il segnale fluorescente. Si consiglia di eseguire il loading dye inla presenza e l'assenza di probenecid per determinare se trasportatori di anioni inorganici presentano un potenziale problema nelle linee cellulari particolari in esame, come probenecid potrebbe anche diminuire il segnale agonista-mediata.
   3. Preparare il tampone di lavaggio: aggiungere 500 microlitri di soluzione probenecid a 50 ml HBSS / HEPES / Ca ^{2 +} / tampone BSA, regolare il pH a 7,4 e filtrare la soluzione tampone. Sempre preparare tampone fresco, e 50 ml di tampone per è necessaria piatto.
   4. Preparare una soluzione al 10% di acido Pluronic: mescolare 50 microlitri di acido Pluronic (20% w / v in dimetil-solfossido [DMSO]) con 50 microlitri DMSO - se si verifica la cristallizzazione, il calore a 37 ° C e preparare sempre soluzione fresca.
   5. Preparare Fluo-4 soluzione AM (1mm): aggiungere 44 ul di soluzione al 10% di acido pluronico di una fiala che contiene 50 mcg Fluo-04:00 e vortex fino a quando non è completamente sciolto. Evitare l'esposizione alla luce per evitare l'imbiancamento del fluoroforo.
   6. Preparare tampone di caricamento: aggiungere 8.8 ml DMEM Supplemented con HEPES 10 mM e 2,5 mM probenecid (pH 7,4) alla soluzione Fluo-4 AM (44 microlitri) e vortice. Utilizzare sempre tampone fresca.
   7. Scartare medio dalle cellule, lavare le cellule con 200 microlitri di PBS per pozzetto, e rimuovere PBS.
   8. Aggiungere 55 microlitri di buffer di caricamento per pozzetto e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Avvolgere la piastra in alluminio per evitare l'esposizione della piastra alla luce.
   9. Assicurarsi di asciugare i composti prima schermata se vengono disciolte in solventi che sono dannosi (ad esempio, acetonitrile) per il sistema di espressione cellulare.
   10. Solubilizzare i peptidi in tampone di lavaggio in provette da 1,5 ml microcentrifuga siliconati. Preparare una serie di diluizioni per eseguire una analisi di concentrazione-risposta e per determinare il valore EC ₅₀ di un ligando. Aggiungere 70 ml di ligando nel corrispondente pozzetto della piastra composto (piastre da 96 pozzetti a V) e comprendono controlli positivi (agonista endogeno) e negativi (tampone di lavaggio) su ciascuna piastra. Non E: Se un composto non è solubile nel tampone di lavaggio, si può provare altri solventi non nocivi per le cellule in esame, come acqua o soluzioni che emulsionare solubilizzano oli e altre sostanze insolubili in acqua (per esempio, Kolliphor EL) .
   11. Misurare tutti i campioni in triplice copia. Tenere presente che 50 ml di un ligando dal piatto composto saranno trasferiti in un pozzo con 100 microlitri di tampone di lavaggio della piastra di cella durante il dosaggio, così preparare i composti a 3 volte la concentrazione finale desiderata.
   12. Eliminare il tampone di caricamento dalla piastra di cella e aggiungere 100 microlitri di tampone di lavaggio a ciascun pozzetto. Incubare la piastra 15 min a temperatura ambiente ed evitare l'esposizione alla luce.
   13. Eliminare il tampone di lavaggio dalla piastra di cella e aggiungere 100 microlitri nuovo tampone di lavaggio a ciascun pozzetto.
   14. Incubare la piastra di cella, la piastra di composto, e un rack punta (96 pozzetti, consigli per stazioni pipette) per 15 min a 37 ° C.

title "> 4. Saggio sul Dispositivo Stazione

1. Creare e caricare il file di protocollo desiderato con il software e attivare l'unità di controllo della temperatura nella camera di lettura. Qui, misurare le risposte di calcio a 37 ° C per 2 min una riga alla volta con 1,52 sec intervallo tra le letture successive (misurazione di una piastra a 96 pozzetti completa richiede circa 25 min) a 525 nm. Impostare l'eccitazione di Fluo-4 488 nm e trasferire un volume totale di 50 microlitri di composto alla piastra di cella, 18 secondi dopo l'inizio lettura, con la velocità di erogazione fissato a 26 ml / sec e un'altezza di pipetta 135 microlitri.
2. Posizionare il composto e piastra di cella, e il rack punta nei cassetti appropriati del dispositivo ferroviaria.
3. Eseguire una singola lettura della piastra di cella alla stessa lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione in modalità ENDPOINT, prima di iniziare lo schermo attuale in modalità FLEX. Nota: Questa misura dà unità di fluorescenza relativa valori (RFU) e consente di rilevare la variabilità tra noills della piastra. Valori compresi tra 20.000 e 40.000 sono considerati accettabili.
4. Avviare il test e analizzare i dati con il software.

Risultati

Serie di concentrazioni che vanno da 50 micron a 0.001 nm sono stati testati per tutti e quattro i peptidi Drosophila SNPF (Drome-SNPF-1: AQRSPSLRLRFamide, Drome-SNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-SNPF-3: PQRLRWamide, Drome-SNPF-4: PMRLRWamide) su HEK293T cellule che esprimono il recettore transitoriamente Drosophila SNPF e la subunità promiscua Gα _16. Il GPCR è stato attivato da tutti e quattro i peptidi in concentrazioni finali fino a 0,1 nM, e l'attivazione del recettore era dipendente dalla concentrazione. Figura 2 mostra i grafici corrispondenti a uno dei tre repliche della serie Drome-SNPF-1 concentrazione. Il controllo negativo (tampone di lavaggio) non ha indotto un segnale fluorescente, mentre il controllo positivo (PAR ₁ - ₁ pM) ha provocato forte attivazione della proteasi endogene-activated receptor-1, portando ad un segnale fluorescente alta (± 30.000 RFU). Va notato che una deviazione dila curva tipica può indicare anomalie. Ad esempio, un aumento costante della curva senza ritornare al basale potrebbe essere collegato ai segnali-non-recettore mediata, come la presenza di ionofori del calcio, o un doppio strato lipidico perturbato causando perdite di calcio.

Il software consente l'immissione di formule per determinare la percentuale di attivazione o gli errori standard dei differenti concentrazioni tra gli altri. I dati risultanti vengono usati per comporre preliminari curve concentrazione-risposta per stimare i valori _di EC _50, come mostrato per i quattro peptidi Drome-SNPF in Figura 3. Le curve di figura 3 comprendono anche i dati per il controllo negativo in cui la serie di concentrazione i peptidi Drome-SNPF sono stati testati su HEK293T cellule trasfettate con un pcDNA3.1 vettore vuoto. I risultati indicano che l'aggiunta di peptidi a queste cellule non hanno effetto sui recettori endogeni, ma anzi activmangiato il recettore di interesse. Il calcio mobilitazione saggio basato sulla fluorescenza è stata poi ripetuta tre volte in modo indipendente. Sulla base dei preliminari curve concentrazione-risposta della schermata iniziale, le concentrazioni testate sono state adattate per coprire la gamma dinamica della curva (Figura 4). I valori di EC50 di Drome-SNPF-1 (2.04 ± 1.48 nM [95% intervallo di confidenza]), Drome-SNPF-2 (5.89 ± 3.74 nM), Drome-SNPF-3 (5,55 ± 3,95 nm) e Drome-SNPF- 4 (0,50 ± 1,01 nM) sono simili, che indica che essi sono ugualmente potenti per attivare il recettore.

Figura 2. Graphical uscita del software per una risposta di fluorescenza mediato da recettore di una serie di concentrazioni. Dodici (concentrazioni finali che vanno da 50 mM a 0.001 nM) of Drome-SNPF-1 peptide sono stati testati sul recettore Drome-SNPF. L'attivazione è espresso in unità di fluorescenza relativa valori (RFU). Il grafico superiore dà i risultati dei sei concentrazioni più alte e grafico inferiore dei sei concentrazioni più basse. Il controllo positivo (+) è PAR ₁ (1 micron) e il controllo negativo (-) è tampone di lavaggio.

Figura 3. Preliminari curve concentrazione-risposta di peptidi Drosophila SNPF determinata da un singolo calcio mobilitazione saggio basato sulla fluorescenza. Le curve concentrazione-risposta del recettore Drosophila SNPF transitoriamente espresso in cellule HEK293T per i quattro peptidi Drosophila SNPF sono mostrati in blu. Per i controlli negativi (indicati in rosso), peptidi sono stati testati su HEK293Tcellule trasfettate con un pcDNA3.1 vettore vuoto. Le risposte fluorescenti sono mostrati come relativa (%) al valore massimo (100% di attivazione). Le curve sono il risultato di un esperimento in cui ciascuna serie di concentrazioni è stata misurata in triplicato. Le barre verticali rappresentano gli errori standard della media (SEM), che a volte sono più piccoli i simboli utilizzati (in questo caso, solo i simboli sono raffigurati).

Figura 4. Curve concentrazione-risposta e corrispondenti valori di EC ₅₀ di peptidi Drosophila SNPF determinata da tre saggi mobilizzazione del calcio basato sulla fluorescenza indipendenti. Le curve concentrazione-risposta del recettore Drosopihla SNPF transitoriamente espressi in cellule HEK293T per i quattro peptidi Drosophila SNPF sono il risultato di tre me indipendenteasurements ogni eseguita in triplice copia (n ≥ 9). Le risposte fluorescenti sono mostrati come relativa (%) al valore massimo (100% di attivazione). Gli asterischi indicano le concentrazioni per i quali n ≤ 9. Barre di errore indicano SEM, che a volte sono più piccoli dei simboli utilizzati (in questo caso, solo i simboli sono raffigurati). CE ₅₀ valori sono visualizzati con i loro intervalli di confidenza al 95%.

Discussione

Il calcio dosaggio mobilitazione basato sulla fluorescenza è stato applicato con successo per confermare la caratterizzazione funzionale del sistema di segnalamento peptidergico Drosophila SNPF, che è stata già eseguita da Mertens et al. con un saggio di bioluminescenza e da Feng et al. con un saggio ^13,15 elettrofisiologico. I valori di EC ₅₀ ottenuti con il test di fluorescenza nelle cellule HEK293T sono circa 10 volte inferiori a quelli ottenuti con il saggio di bioluminescenza eseguita in cellule CHO (Drome-SNPF-1: fluo = 2.04 nM, lumi = 51 nM; Drome-SNPF- 2: fluo = 5.89 nM, lumi = 42 Nm; Drome-SNPF-3: fluo = 5.55 nM, lumi = 31 nM; Drome-SNPF-4: fluo = 0.50 nM, lumi = 75 nM). Queste variazioni possono essere spiegate da diversi fattori, tra cui il fatto che uno dei sistemi di espressione utilizzati può essere più adatto per l'espressione funzionale di un dato recettore, o la piegatura di alcuni recettori può essere meno efficiente in ctipi cellulari alune. I valori di EC ₅₀ di tutte e quattro peptidi Drome-SNPF sono nell'intervallo nanomolare quando testati sulla loro recettore sia con la fluorescenza e il saggio di bioluminescenza, generalmente sostenere la rilevanza fisiologica della loro interazione peptide-recettore in vivo.

Si noti che nessun controllo trasfezione con un recettore per cui il ligando attivazione è noto è stato incluso nella schermata presentata qui, perché il sistema di segnalamento Drosophila SNPF è normalmente il controllo trasfezione in apparati sperimentali. Il controllo positivo con un ligando endogeno delle cellule HEK293T (PAR ₁₎ e il controllo negativo (tampone di lavaggio) sono stati inclusi nello schermo. I risultati del PAR ₁ hanno dimostrato che le cellule erano in buone condizioni. Il controllo negativo (tampone di lavaggio) non ha provocato un segnale fluorescente, che indica che il mezzo in cui i peptidi sono disciolti era esente da qualsiasi contaminante che potrebbe influence i risultati.

Il sistema di segnalazione Drosophila SNPF caratterizzato precedentemente è stato usato qui per spiegare la mobilitazione di calcio saggio basato sulla fluorescenza. A tal fine, serie concentrazione dei ligandi attivanti sono stati testati immediatamente. Tuttavia, quando un recettore orfano è portato a sovraespressione in un saggio di screening per testare una libreria contenente centinaia di composti, si raccomanda di primo schermo con relativamente elevate concentrazioni finali dei leganti (ad es., 10 o 1 mM). In seguito al rilevamento di un composto attivazione, una serie di diluizioni di tale composto può essere analizzato al fine di comporre una curva concentrazione-risposta e per determinare il valore EC _50.

Una volta che il ligando attivazione di un recettore è determinato, la via di segnalazione intracellulare può esaminare ulteriormente adattato il protocollo. L'analisi può essere eseguita come descritto sopra, ma senza co-trasfezione del G ^5; ₁₆ subunità. Quando una risposta di calcio è misurata, significa che le coppie recettore endogeno attraverso una Gα _q subunità del sistema di espressione cellulare. Quando si osserva alcun segnale fluorescente, possono essere applicati protocolli per misurare i cambiamenti nelle concentrazioni di altri messaggeri secondari (ad es., CAMP).

Studi di relazione struttura-attività (SAR) possono anche essere effettuate per definire core sequenza del peptide necessaria per l'attivazione del recettore. Primo, sequenze troncate vengono valutati per definire la minima sequenza aminoacidica del peptide che è ancora in grado di attivare il recettore. Successivamente, i peptidi possono essere testati in cui sistematicamente ogni amminoacido è stato sostituito da un residuo di alanina. Test sintetici serie alanina-sostituzione sul recettore permette di determinare l'importanza di ciascuna delle amminoacidi per l'attivazione del recettore ^24,25.

Nonostante il suo uso frequente ed effi comprovaticacia, va sottolineato che il saggio qui descritto potrebbe bisogno di alcuni adattamenti per ottenere risultati ottimali per i recettori specifici di interesse. La subunità Gα ₁₆ ha il vantaggio che si lega alla maggior GPCR, ma può anche avere un effetto dominante negativo sui recettori che endogenamente coppia tramite Gα ²² _q. In questo caso, può essere utile per testare diverse combinazioni di proteine ​​G durante l'ottimizzazione di un saggio calcio romanzo e di confrontare i risultati Gα recettori accoppiati _q-in assenza o presenza di Gα _16. Saggi alternativi che siano indipendenti dalla interazione proteina G per rilevare l'attivazione del recettore possono anche essere eseguite, come la traslocazione di arrestina GFP-etichettata, o la rilevazione delle variazioni di potenziale di membrana (ad es., Dal FLIPR potenziale di membrana Kit Assay). Oltre al Fluo-04:00 qui utilizzato, una vasta gamma di altri fluorofori calcio-sensibili, ciascuno con la propria spettrale e chemicAL proprietà, è disponibile. Il fluoroforo più appropriato può essere selezionato in base alla cella del tipo GPCR e il lettore di piastre disponibili, ma verifica sperimentale è necessario. Le quantità di DNA trasfettate e la necessità rapporto reagente DNA / trasfezione da determinare per ogni combinazione linea del reagente-cell receptor-trasfezione. Infine, va tenuto presente che le cellule in coltura continua consentono solo 20-25 passaggi di utilizzo per eseguire i saggi di screening.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
HEK293T cellule
: Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS)	Soluzione di tripsina-EDTA Sigma-Aldrich	D8537
(0,25%)	Sigma-Aldrich	T4049
sale disodico dibasico diidrato (EDTA)	MP Biomedicals	195173
Glucosio medio - alto di Eagle modificato di Dulbecco  (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Siero fetale bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Penicillina-Streptomicina (P-S)	Sigma-Aldrich	P4333
jetPRIME	Trasfezione Polyplus	114-01	Reagente di trasfezione FuGENE HD (Promega); Lipofectamina LTX & Reagente Plus (Life technologies)
Siero fetale bovino dializzato (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392
Fibronectina da plasma umano	Sigma-Aldrich	F0895
Reagente A100, Tampone di lisi	Chemometec	910-0003
Reagente B, Tampone stabilizzante	Chemometec	910-0002
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Tampone HBSS: Soluzione salina bilanciata di Hank	Sigma-Aldrich	H8264
Probenecid	Sigma-Aldrich	P8761
NaOH (1 M)	Vel	2781
Acido pluronico	Invitrogen	P-3000MP
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1, ... (Invitrogen)
Palloni per coltura tissutale TPP (T-75 e T-150)	Sigma-Aldrich	Z707503 e Z707554
dispositivo FlexStation	Molecular Devices		NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)
Piastre in polistirene a parete nera (96 pozzetti) con fondo trasparente	Greiner Bio-One	655090	Micropiastre Corning a 96 pozzetti in polistirene nero con fondo trasparente e poli-D-lisina
NucleoCassette	Chemometec	941-0001
NucleoCounter NC-100	Chemometec
Provette per microcentrifuga, siliconate	BioCision	BCS-2470
Piastre a 96 pozzetti in polistirene a forma di V	Greiner Bio-One	651101
96 pozzetti, puntali per pipette FlexStation	Molecular Devices	9000-0912
Software Soft Max Pro	Molecular Devices