Questo protocollo combina elettrofilatura e microsfere per sviluppare scaffold di ingegneria tissutale per dirigere i neuroni. Il fattore di crescita nervoso è stato incapsulato all'interno di microsfere di PLGA e elettrofilato in scaffold fibrosi di acido ialuronico (HA). La bioattività della proteina è stata testata seminando gli scaffold con i gangli della radice dorsale del pulcino primario e coltivandoli per 4-6 giorni.
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Articolo metodologico
Electrospinning Growth Factor Releasing Microsfere in Fibrosi Ponteggi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questa procedura descrive un metodo per fabbricare un substrato multiforme per dirigere la crescita delle cellule nervose. Questo sistema incorpora segnali meccanici, topografici, adesivi e chimici. Le proprietà meccaniche sono controllate dal tipo di materiale utilizzato per fabbricare le fibre elettrofilate. In questo protocollo utilizziamo il 30% di acido ialuronico metacrilato (HA), che ha un modulo di trazione di ~500 Pa, per produrre un'impalcatura fibrosa morbida. L'elettrofilatura su un mandrino rotante produce fibre allineate per creare un segnale topografico. L'adesione si ottiene rivestendo l'impalcatura con fibronectina. La sfida principale qui affrontata è fornire un segnale chimico in tutta la profondità dell'impalcatura per periodi prolungati. Questa procedura descrive la fabbricazione di microsfere di acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA) che contengono il fattore di crescita nervoso (NGF) e l'impregnazione diretta dell'impalcatura con queste microsfere durante il processo di elettrofilatura. A causa dell'ambiente di produzione difficile, comprese le elevate forze e le cariche elettriche, la vitalità delle proteine viene misurata dopo la produzione. Il sistema fornisce il rilascio di proteine per oltre 60 giorni e ha dimostrato di promuovere la crescita delle cellule nervose primarie.
Introduzione
Una delle sfide in corso in ingegneria dei tessuti neurali è la creazione di un condotto del nervo (NC) che imita la matrice extracellulare, dove i nervi crescono naturalmente. La ricerca ha dimostrato che le cellule rispondono a diversi fattori nel loro ambiente, tra cui meccanica, topografico, adesivi e segnali chimici 1-3. Una delle sfide principali in questo settore sta determinando la combinazione appropriata di segnali e fabbricando un sistema in grado di mantenere spunti per un lungo periodo per sostenere la crescita delle cellule 4. Neuroni periferici sono noti a preferire un substrato morbido, diretto da fibre allineate e rispondere agl....
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Protocollo
1. Acqua / Olio / Acqua Doppia Emulsione microsfere di produzione
- Prima preparare 2% e 0,5% w / v soluzioni di alcoli polivinilici (PVA) in acqua deionizzata. Mescolare le soluzioni a 50 ° C fino a chiaro, questo può richiedere diverse ore. Preparare una soluzione al 2% v / v alcool isopropilico in acqua deionizzata.
- Preparare una soluzione acquosa di proteine idrofila desiderato. La tabella seguente fornisce esempi di formulazioni.
Tabella 1:. Esempi....
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Risultati
Microsfere 50 ± 14 micron di diametro, con un incapsulamento di proteine oltre l'85% sono stati costantemente prodotto e elettrofilate in ponteggi. Dimensione è stata determinata mediante l'imaging campioni di microsfere da tre lotti di produzione separate. Le immagini catturate in cui su un microscopio ottico e lunghezze dove misurata utilizzando software laboratorio commerciale. Figura 1 mostra un istogramma della distribuzione dimensionale. Tasso di incapsulamento è stato testato anche da t.......
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Discussione
Molti studi hanno dimostrato che le cellule nervose possono essere diretti da stimoli topografici (allineamento della fibra) e segnali chimici (fattori di crescita) 1,2,10,11,35. Electrospinning è un metodo facile per creare fibre allineate. I fattori di crescita favoriscono la crescita dei nervi, ma al fine di includerli in condotti nervose (NC), è necessario un metodo per rilascio prolungato. Per creare un sistema più robusto con entrambi i segnali, questi due segnali devono essere combinati. Diversi metodi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato parzialmente finanziato attraverso la Richard Barber Foundation e una Thomas Rumble Fellowship (TJW).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Proteggere dalla luce |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Metacrilossail tiocarbamil rodamina B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Preparare la soluzione madre nella |
| pompa a siringa | KD Scientific | KDS100 | |
| Fonte di alimentazione | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Deve essere collegato a un mandrino personalizzato |
| Tachimetro | Magazzino strumenti di rete | ESI-330 | Utilizzare per monitorare la velocità |
| del mandrinoOmnicure UV Spot Cure System con adattatore di collimazione | EXFO | S1000 | |
| Aghi | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Vetrini coprioggetti | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Alcool polivinilico | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Alcool isoporopilico | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Fattore di crescita nervoso (NGF) | R& D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Acido polilattico-glicolico (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Diclorometano | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Dosaggio delle proteine | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimetossisilil)metacrilato di propile | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectina | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutammina | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldeide | Alfa Aesar | A11313 |
Riferimenti
- Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5
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Ristampe e permessi
