Questa procedura mostra come indirizzare gli interneuroni nel prosencefalo del topo in via di sviluppo per mezzo dell'elettroporazione in utero. Questa tecnica è stata particolarmente efficace per ottenere l'espressione genica selettiva nei sottotipi di interneuroni destinati agli strati superficiali della corteccia.
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Articolo metodologico
Sottotipo-selettivo elettroporazione della corticale interneuroni
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo studio del sistema nervoso centrale (CNS) maturazione si basa su di targeting genetica delle popolazioni neuronali. Tuttavia, il compito di limitare l'espressione di geni di interesse per specifici sottotipi neuronali si è dimostrato straordinariamente difficile a causa della relativa scarsità di specifici elementi promotori. Interneuroni GABAergici costituiscono una popolazione neuronale con una vasta diversità genetica e morfologica. Infatti, più di 11 differenti sottotipi di interneuroni GABAergici sono stati caratterizzati nella corteccia mouse 1. Qui vi presentiamo un protocollo adatto per il targeting selettivo delle popolazioni GABAergici. Abbiamo raggiunto sottotipo selettivi mirati interneuroni GABAergici utilizzando l'elemento enhancer della trascrizione homeobox fattori Dlx5 e Dlx6, omologhi del distale-less (Dll) gene Drosophila 2,3, per guidare l'espressione di geni specifici mediante elettroporazione in utero.
Introduzione
La maggior parte delle corticali interneuroni GABAergici provengono da due strutture embrionali transitori denominate le eminenze gangliari mediale e caudale (MGE e CGE, rispettivamente) 4. Parvalbumina e somatostatina esprimere interneuroni sono originari del MGE, mentre Calretinin (Cr), Vasointestinal peptide (VIP) e Reelin (Re) che esprime interneuroni provengono dalla CGE. Questi sottotipi di interneuroni possono essere distinte dalle loro date di nascita. MGE sottotipi derivati sono nati tra il giorno embrionale 9.5 (E9.5) e e16.5 5,6. Al contrario, gli interneuroni CGE derivati nascono da E12.5 attraverso e18.5 con il loro picco produt....
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Protocollo
Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con i regolamenti e le linee guida del Care and Use Committee animali istituzionale della Scuola di Medicina di NYU.
Mouse Ceppi
Swiss Webster topi femmina forniti da TACONIC sono stati utilizzati per questi esperimenti. Al fine di indirizzare specificamente interneuroni superficiali di livello, sono stati utilizzati embrioni E15.5.
Nota: Il plasmide utilizzato in questo lavoro (Dlx5 / 6.eGFP plasmide 3 mg / mL) è stato generato utilizzando tecniche di clonazione standard. Il eGFP cDNA è stato clonato in un Dlx5 / 6-Pmin-polyA
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Risultati
Abbiamo adattato la tecnica di elettroporazione in utero per raggiungere tipo cellulare specifico orientamento dei neuroni in scadenza. Per guidare l'espressione di eGFP in interneuroni CGE-derivati, abbiamo utilizzato l'elemento enhancer Dlx5 / 6 e limitati i nostri iniezioni per E15.5, la fase in cui la maggior parte degli interneuroni CGE-derivati vengono generati. Abbiamo effettuato l'analisi a P8 e P15 11 (figure 1 e 2). Abbiamo confermato.......
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Discussione
LIMITI DELLA TECNICA
Mentre questa tecnica permette di cella di analisi autonoma di processi cellulari, non è adatto per l'analisi di popolazione. I electroporations sono molto scarse, con meno di un migliaio di cellule elettroporate al cervello. Di conseguenza, la tecnica non può essere utilizzata per valutare conseguenze comportamentali dovute alla manipolazione genetica degli interneuroni CGE-derivati.
Mentre electroporations effettuate ai sottotipi bersag.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati a Lihong Yin per l'assistenza tecnica. NVD è destinatario di un NARSAD Young Investigator Award ed è anche sostenuto da sovvenzioni dal NIH (5 K99 MH095825-02). La ricerca in laboratorio Fishell è sostenuto dal National Institute of Health, Istituto Nazionale di Salute Mentale (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Istituto nazionale dei disordini neurologici e Stroke (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) e la Fondazione Simons.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Elettroporatore con pedale | Protech International | CUY21 | |
| Elettrodi a paletta da 5 mm. | Protech International | CUY650P5 | |
| Termoforo | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Estrattore | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Sistemi di anestesia | Harvard Apparecchio | 726425 | |
| Forbici operative delicate 4.75" Dritto Affilato/Affilato | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Seta Treccia Nera 18" C-1 Scatola 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applicazione Pinze 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Forbici a morsetto | Roboz | RC-4894 | |
| Pinze di tenuta | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Tubo capillare in vetro | FHC | 27-30-0 | Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
Riferimenti
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K.
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Ristampe e permessi
