È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Le colture per pluripotenti umane alternative staminali produzione di celle, manutenzione e analisi genetica

12.2K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/51519

⸱

24 luglio 2014

 ,  ,  , 
1NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Craniofacial and Skeletal Diseases Branch, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo protocolli di coltura di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), basati sulla crescita di singole cellule dissociate in monostrato (NCM) di tipo non coloniale. Questo nuovo metodo, che utilizza inibitori della chinasi Rho-associati o l'isoforma 521 della laminina (LN-521), è adatto per la produzione di grandi quantità di hPSC omogenee, la manipolazione genetica e la scoperta di farmaci.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono molto promettenti per la medicina rigenerativa e le applicazioni biofarmaceutiche. Attualmente, la coltura ottimale e l'espansione efficiente di grandi quantità di hPSC di livello clinico sono questioni critiche nelle terapie basate su hPSC. Convenzionalmente, le hPSC si propagano come colonie sia su sistemi di coltura feeder che feeder-free. Tuttavia, questi metodi presentano diverse limitazioni importanti, tra cui una bassa resa cellulare e la generazione di cellule eterogeneamente differenziate. Per migliorare gli attuali metodi di coltura di hPSC, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo metodo, che si basa sulla coltura di monostrato di tipo non colonico (NCM) di singole cellule dissociate. Qui, presentiamo protocolli NCM dettagliati basati sull'inibitore della chinasi associata Rho (ROCK) Y-27632. Forniamo anche nuove informazioni sulla coltura di NCM con diverse piccole molecole come l'Y-39983 (inibitore di ROCK I), il fenilbenzodiossano (inibitore di ROCK II) e la tiazovicina (un nuovo inibitore di ROCK). Estendiamo ulteriormente il nostro protocollo di base per coltivare hPSC su proteine extracellulari definite come l'isoforma 521 della laminina (LN-521) senza l'uso di inibitori ROCK. Inoltre, sulla base della NCM, abbiamo dimostrato l'efficiente trasfezione o trasduzione di DNA plasmidico, particelle lentivirali e microRNA basati su oligonucleotidi in hPSC al fine di modificare geneticamente queste cellule per analisi molecolari e scoperta di farmaci. I metodi basati su NCM superano le principali carenze della coltura di tipo colonia e quindi possono essere adatti per produrre grandi quantità di hPSC omogenee per future terapie cliniche, ricerca sulle cellule staminali e scoperta di farmaci.

Introduzione

La capacità di hPSCs di differenziare verso tessuti adulti multilineage ha aperto nuove strade alla cura dei pazienti che soffrono di malattie gravi che coinvolgono cardiovascolare, epatico, pancreatico e sistemi neurologici 1-4. Vari tipi di cellule derivate da hPSCs sarebbe anche fornire piattaforme cellulari robuste per la modellazione della malattia, l'ingegneria genetica, screening di farmaci e test tossicologici 1,4. La questione chiave che assicura loro applicazioni cliniche e farmacologiche futuri è la generazione di un gran numero di hPSCs clinico-grade in coltura cellulare in vitro. Tuttavia, i sistemi di coltura attuali sono insufficienti o intrinsecamente variabile, che coinvolge vari alimentazione e senza alimentatore culture del hPSCs come colonie 5,6.

Colony-tipo crescita delle quote hPSCs molte caratteristiche strutturali della massa cellulare interna (ICM) di embrioni di mammiferi. L'ICM è incline a differenziarsi in tre strati germinaliin un ambiente multicellulare causa dell'esistenza di gradienti di segnalazione eterogenei. Pertanto, l'acquisizione di eterogeneità in sviluppo embrionale precoce è considerata come un processo necessario per la differenziazione, ma una caratteristica indesiderata della cultura HPSC. L'eterogeneità nella cultura HPSC è spesso indotto da eccessivi segnali apoptotici e differenziazione spontanea a causa di condizioni di crescita ottimali. Così, in colonia-tipo coltura, le cellule eterogenee si osservano spesso nella periferia delle colonie 7,8. È stato anche dimostrato che le cellule in cellule staminali embrionali umane (hESC) Colonie risposte differenziali Esporre a molecole di segnalazione come BMP-4 9. Inoltre, metodi di coltura colonia producono produzioni di cellule basse così come i tassi di recupero molto bassi cellulare da crioconservazione a causa di tassi di crescita incontrollabili e segnale apoptotico Percorsi di 6,9. Negli ultimi anni, diverse culture sospensioni sono state sviluppate per hPSCs coltura, soprattarly per l'espansione di grandi quantità di hPSCs in-e alimentatore condizioni prive di matrice 6,10-13. Ovviamente, diversi sistemi di coltura hanno i loro vantaggi e svantaggi. In generale, l'eterogeneità hPSCs rappresenta uno dei principali inconvenienti di tipo colonia e cultura aggregato metodi, che sono ottimali per la consegna di DNA e RNA materiali in hPSCs per l'ingegneria genetica 6.

Chiaramente, vi è la necessità imperativa di sviluppare nuovi sistemi che aggirano alcune carenze delle attuali metodi di coltura. Le scoperte di piccoli inibitori della molecola (come l'inibitore ROCK Y-27632 e JAK inibitore 1) che migliorano la sopravvivenza a cella singola spianare la strada per dissociato-HPSC cultura 14,15. Con l'uso di queste piccole molecole, abbiamo recentemente sviluppato un metodo di coltura in base al tipo non-colonia (NCM) crescita di dissociate-hPSCs 9. Questo metodo di coltura romanzo combina passaging cella singola e ad alta densitàplaccatura metodi, che ci permette di produrre grandi quantità di hPSCs omogenee sotto cicli di crescita costante senza grandi anomalie cromosomiche 9. In alternativa, cultura NCM potrebbe essere implementato con diverse piccole molecole e matrici definite (quale laminine) al fine di ottimizzare il metodo di coltura per le applicazioni di larghezza. Qui vi presentiamo diversi protocolli dettagliati basato sulla cultura NCM e delineare le procedure dettagliate per l'ingegneria genetica. Per dimostrare la versatilità dei protocolli di NCM, abbiamo provato anche la cultura NCM con inibitori ROCK diversi e con il singolo laminina isoforma 521 (vale a dire, LN-521).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Basato Single-cell di tipo non-colonia monostrato (NCM) cultura della hPSCs.

1. Preparativi

  1. Rendere 500 ml di terreno per la cultura di fibroblasti embrionali di topo (MEF): medie DMEM supplementato con 10% FBS, 2 mM L-glutammina, e 0,1 mm aminoacidi non essenziali (NEAA).
  2. Isolare fibroblasti embrionali di topo (MEF), le cellule derivate dal ceppo CF1 a seguito di un protocollo di routine 16 e cultura MEF sul 0,1% di gelatina rivestite 6-pozzetti di coltura cellulare in DMEM. In alternativa, l'acquisto di azioni del MEF al passaggio 3 da risorse commerciali.
  3. Preparare piatti Matrigel.
    1. Diluire 5 ml di hESC qualificati Matrigel magazzino con 5 ml di DMEM/F12 medio (raffreddato a ~ 4 ° C) e conservare il 50% aliquote in una -20 ° C freezer. Scongelare ghiacciato Matrigel magazzino in frigorifero (~ 4 ° C) O / N e diluire ulteriormente la Matrigel in mezzo DMEM/F12 freddo (per dare luogo ad una concentrazione di lavoro 2,5%).
    2. Coat 6 pozzetti piastre di coltura cellulare con 1,5 ml di 2,5% Matrigel per bene, conservare le piastre rivestite in frigorifero O / N (Nota: utilizzare la piastra Matrigel rivestite entro 2 settimane).
    3. Rimuovere la piastra Matrigel dal frigorifero, lasciare che la piastra si riscaldi a temperatura ambiente nella cappa di coltura cellulare per 10-30 min (Nota: non scaldare la piastra in un incubatore coltura cellulare), e aspirare DMEM prima della placcatura hPSCs.
  4. Rendere 500 ml mezzo hESC: 80% medio DMEM/F12, 20% KSR, 2 mM L-glutammina, 0,1 mM aminoacidi non essenziali, 0,1 mM β-mercaptoetanolo, e 4 ng / ml di FGF-2.
  5. Preparare 10 ml di 2X HPSC medio di congelamento: 60% FBS, 20% DMSO e 20 mM Y-27632 in mTeSR1 mezzo, sterilizzare per filtrazione, e utilizzare il mezzo entro 1 settimana.

. 2 Protocollo 1 (Elementare): Grow HPSC Colonie su Alimentatori

  1. Utilizzare numeri passaggio MEF a 5 o 6 (designato come p5 e p6) per cultura HPSC per vedere Resul coerentets. Mitoticamente inattivare MEF trattando le cellule con 10 pg / ml mitomicina C per 3 ore a 37 ° C, lavare le cellule 3x con di 1X Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (D-PBS), e poi si dissociano MEF con 0,05% tripsina in 0,53 mM EDTA. In alternativa, irradiare MEF alla dose di 8.000 rad considerando un irradiatore a raggi X.
  2. Contare il numero di cellule utilizzando il metodo di esclusione del Trypan Blue macchia sotto microscopio. In alternativa, utilizzare un contatore automatico cella.
  3. Piastre MEF irradiati su lastre di polistirene 6 pozzetti rivestiti con 0,1% di gelatina ad una densità di 1,88 x 10 5 cellule per pozzetto (cioè, 1,96 x 10 4 cellule / cm 2). Incubare le cellule a 37 ° C e 5% di CO 2 per 24 ore.
  4. Rimuovere il terreno di coltura MEF per aspirazione con una pipetta Pasteur (Nota: nessun fasi di lavaggio necessari in questo momento).
  5. Triturare HPSC colonie dalla cultura precedente in piccoli ciuffi, esaminano i grumi sotto il microscopio per assicurare loro dimensioni variano from 50 a 100 micron di diametro, e piastra ciuffi HPSC sulla cima MEF strati feeder in un pozzetto contenente 2 ml di HPSC medie.
  6. Cambiare hESC mezzo al giorno per 3 a 5 giorni, record di crescita colonia fotografia, contrassegnare tutte le colonie morfologicamente alterati o differenziati (~ 5%), e rimuovere manualmente le colonie contrassegnati con delicatezza aspirazione con una pipetta Pasteur.
  7. Risciacquare le restanti colonie MEFs due volte (2 min ciascuno con D-PBS), e incubare le colonie con 2 ml di 1 mg / ml di collagenasi IV in HPSC medio per 10 a 30 minuti), ed esaminare il distacco delle colonie HPSC dal MEF superficie rivestita (Nota: utilizzare un raschietto per aiutare il processo di distacco solo se le colonie sono strettamente collegati alla piastra).
  8. Aggiungere 5 ml di HPSC mezzo a ciascun pozzetto per minimizzare le reazioni enzimatiche, trasferimento colonie ad una provetta da 15 ml, permettere colonie HPSC sedimentare per 3 a 5 minuti a temperatura ambiente, e garantire la sedimentazione delle colonie tramite visualizzazione diretta del cells nella parte inferiore del tubo (Nota: non centrifugare la provetta in questa fase).
  9. Rimuovere il surnatante contenente MEF residue e dissociato singole cellule, risospendere le colonie con 5 ml di hESC medie, e ripetere l'operazione di sedimentazione due volte.
  10. Rimuovere le medie, triturare colonie HPSC in piccoli ciuffi, negozio in 1X HPSC congelamento medio (o CryoStore CS10 mezzo congelamento) per la crioconservazione (1 confluente bene per fiala congelata) o piastra su un 6-pozzetti per passaging cellulare.

3 Protocollo 2:. Convertire HPSC colonie da alimentatori a NCM

  1. Sciacquare pellets HPSC in D-PBS una volta, incubare il pellet con 1 ml di 1X Accutase per 10 minuti, ed esaminare la reazione enzimatica sotto un microscopio per assicurare dissociazione singola cellula.
  2. Terminate le reazioni enzimatiche da risospendere delicatamente le cellule in 5 ml di mTeSR1 mezzo contenente 10 mM Y-27632 seguito da centrifugazione a 200 xg a temperatura ambiente per 5 min(Nota, non utilizzare eccessive forze di centrifugazione che causano danni alle cellule).
  3. Aggiungere 5 ml di mTeSR1 mezzo al pellet, risospendere il pellet come singole cellule, e filtro dissociato cellule attraverso un colino cella 40 pm (per eliminare eventuali aggregati di cellule residue).
  4. Seed 1,3-2 x 10 6 hPSCs in un pozzetto (1,4-2,1 x 10 5 cellule / cm 2) di un 6-pozzetti rivestiti con 2,5% hESC qualificato Matrigel, aggiungere mTeSR1 medio fino a 2,5 ml, e comprendono 10 micron Y-27632 nel mezzo (per facilitare il 24 hr placcatura singola cellula iniziale). In alternativa, utilizzare le seguenti piccole molecole di sostituire 10 micron Y-27632 per migliorare la placcatura unicellulare: 1 micron Y-39983 (ROCK I inibitore), 1 mM phenylbenzodioxane (inibitore ROCK II), 1 micron thiazovivin (un inibitore ROCK romanzo) , e inibitore JAK 2 mM 1.
  5. Sostituire il mezzo con drug-free medio mTeSR1 il giorno successivo (entro 24 ore), dissociare le cellule da uno in piùbene, e contare il numero di cellule per determinare singola cellula efficienza placcatura (Nota: approssimativamente, dal 50 al 90% della singola cellula placcatura di efficienza che può essere raggiunto in questa fase).
  6. Permettono alle cellule di crescere come una cellula formata singolo monostrato per alcuni giorni con 3 ml di mTeSR1 medie. Cambiare medio giornaliero.
  7. Determinare empiricamente la pianificazione per passaging adattato NCM seconda della densità cellulare. Passage quando la crescita delle cellule raggiunge confluenza al giorno 3 o 4 ° giorno, o al punto di tempo 4 ore dopo la scomparsa dei confini cellula-cellula. Dissociare le cellule in 1 ml di Accutase, utilizzare un 1 a 3 rapporto di splittaggio (cioè, 1 confluenti ben di cellule piastrate in 3 pozzetti della piastra da 6 pozzetti) per passaging cella, e stabilizzare adattato NCM da 5 passaggi.
  8. Il congelamento delle cellule
    1. Utilizzare un pozzetto confluenti (~ 5-6 x10 6 cellule) per una fiala congelata: dissociare celle da una confluenti bene con 1 ml di Accutase per 10 min.
    2. Diluire wesima 5 ml di mTeSR1 medie e centrifugare le cellule come descritto sopra.
    3. Risospendere il pellet in 500 ml di mTeSR1 medio e poi aggiungere lentamente 500 ml di 2X HPSC medio di congelamento (contenenti 20 micron Y-27632) in un flaconcino di crioconservazione. In alternativa, risospendere le cellule in 1X HPSC medio congelamento contenenti inibitore JAK 2 mM 1 o 1X CryoStor CS10 medio in presenza di 10 pM o Y-27632 o 2 inibitore JAK 1 mM.
    4. Mettere fiale congelate in un cryocontainer ghiaccio freddo (bottom-riempita con isopranol) e trasferire il cryocontainer ad un -80 ° C freezer immediatamente.
    5. Trasferire le cellule dal -80 ° C congelatore ad un serbatoio di azoto liquido (il giorno successivo) per la crioconservazione a lungo termine.
  9. Scongelamento delle cellule
    1. Utilizzare un flaconcino crioconservazione per la placcatura 1 pozzetto di una piastra da 6 pozzetti.
    2. Pre-riscaldare medio mTeSR1 in un bagno d'acqua a 37 ° C per 10 min, cellule disgelo nella stessa bagnomaria per 2 min,goccia a goccia aggiungere celle a 5 ml di pre-riscaldato medio mTeSR1 contenenti 10 mM Y-27632, e centrifuga come sopra descritto.
    3. Risospendere delicatamente i pellet cellulari con 2 ml di mTeSR1 mezzo contenente 10 mM Y-27632 e lentamente trasferire cellule ad una ben pre-rivestito con Matrigel (Nota: evitare di produrre bolle d'aria).
    4. Cambia medio giornaliero e si aspettano una crescita HPSC raggiungere confluenza al giorno 3 o 4.

4 Protocollo 3:. Convertire HPSC colonie su Matrigel per NCM Cultura

  1. Rimuovere un piatto Matrigel rivestite da frigorifero, posizionare la piastra nella cappa coltura tissutale da 10 a 30 minuti, rimuovere il terreno da ciascun pozzetto della piastra, e aggiungere 2 ml di pre-riscaldato medio mTeSR1 a ciascun pozzetto.
  2. Trasferimento triturato ciuffi HPSC dalla cultura alimentatore (Passo 2.10 del protocollo di base) alla piastra sopra Matrigel. Aggiungi mTeSR1 medio fino a 2,5 ml di volume finale in ogni pozzetto.
  3. Cambiare mezzo al giorno per 3 a 4 giornis fino colonie raggiungono l'80-90% di confluenza.
  4. Per passaging cella: sciacquare le colonie con D-PBS due volte, trattare le cellule con 1 ml di 2 mg / ml dispasi a 37 ° C per 15 a 20 minuti, e sedimenti e passaggio cellule come grumi.
  5. Per la cultura NCM: ripetere i passaggi 3,1-3,9 descritto nel protocollo 2.

5 Protocollo 4:. NCM Cultura della hPSCs su LN-521

  1. Scongelare il ricombinante soluzione LN-521 a 4 ° C prima del giorno di utilizzo e rendere la soluzione di rivestimento laminina (LCS) diluendo la laminina scongelato con 1X D-PBS (contenente Ca 2 + / Mg 2 +) ad una concentrazione finale di 10 ug / ml.
  2. Aggiungere 1 ml di LCS da un pozzetto in 6 pozzetti (nota: evitare a secco durante il processo di rivestimento).
  3. Sigillare la piastra ricoperta con Parafilm per evitare l'evaporazione e conservare il piatto in frigorifero (4 ° C) O / N (nota: utilizzare la piastra entro 1 settimana).
  4. Rimuovere delicatamente le LCS con una pipetta Pasteur, senza peruching la superficie rivestita e aggiungere 2 ml di mTeSR1 mezzo ad un pozzetto.
  5. Riscaldare tutte le soluzioni di coltura (inclusi D-PBS) in un bagno d'acqua a 37 ° C per 25 min.
  6. Convertire colonie HPSC a NCM
    1. Dissociare aggregati cellulari alle celle singole con Accutase come descritto nel protocollo 2.
    2. Seme circa 1,3-2 x 10 6 hPSCs in uno LN-521 rivestita di (1,4-2,1 x 10 5 cellule / cm 2) senza la presenza di inibitori ROCK.
    3. Cambiare mezzo al giorno per 3-4 giorni.
    4. Dissociare le cellule in 1 ml di Accutase al giorno 3 o 4 per il prossimo passaging cellulare utilizzando un 1 a 3 rapporto di splittaggio.

. 6 Protocollo 5: NCM cultura per il plasmide DNA Transfezione

  1. Adattare le colonie HPSC alla cultura NCM come descritto nei protocolli 2-4.
  2. Piatto dissociata hPSCs a 12-pozzetti con una densità cellulare di 7,5 x 10 5 cellule / pozzetto in mTeSR1 medio in presenza di 10 mM Y-27632.
  3. Sostituire mTeSR1 media con drug-free mTeSR1 medio tra 4-8 ore dopo la placcatura le cellule.
  4. Per ogni trasfezione, diluire 2,5 mg di plasmidi di espressione (ad esempio, pmaxGFP) e 5 ml di Lipofectamine 2000 in provette Eppendorf separati in 125 ml ciascuna di Opti-MEM Ridotto Serum Medium.
  5. Dopo 5 min, miscelare i reagenti diluito e incubare per 20 min a temperatura ambiente (per formare complessi trasfezione).
  6. Aggiungere 250 microlitri complessi trasfezione per ciascun pozzetto contenente hPSCs in 1 ml mTeSR1 medio e incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 per 24 ore.
  7. Esaminare l'efficienza di trasfezione sotto un microscopio a fluorescenza e fotografia casualmente per il calcolo della effettiva efficienza di trasfezione.

. 7 Protocollo 6: NCM cultura per trasfezione di microRNA

  1. Dissociare hPSCs semi-confluenti al giorno 2 in condizioni NCM con l'aggiunta di 1 ml di Accutase per pozzetto in 6 -Pozzetti.
  2. Aggiungere 10 ml di mTeSR1 mezzo per diluire le reazioni enzimatiche e centrifugare a 200 xg per 5 min.
  3. Risospendere il pellet cellulare con mTeSR1 medio, seminare le cellule ad una densità di 7,5 x 10 5 cellule per pozzetto in una piastra 12 pozzetti in mTeSR1 terreno contenente 10 mM Y-27632, e lasciare che le cellule attaccano per 4 ore.
  4. Sostituire il mezzo con Y27632-libera mTeSR1 medie.
  5. Utilizzare disponibili in commercio microRNA (ad esempio, un non-targeting miRIDIAN miRNA Transfezione controllo etichettato con Dy547). Titolare concentrazioni che vanno 0-160 nM utilizzando i reagenti forniti e seguire le istruzioni del produttore.
  6. Ottimizzare l'efficienza di trasfezione per ciascuna concentrazione in linee HPSC dal imaging di fluorescenza Dy547 delle cellule vive sotto un microscopio a 24 ore dopo la trasfezione.
  7. Calcolare le efficienze di trasfezione in base alla percentuale di cellule positive Dy547 su tutte le cellule impressi.
. tle "> 8 Protocollo 7: NCM cultura per la trasduzione di vettori lentivirali

  1. Ripetere i passaggi 7,1-7,4 del protocollo 6.
  2. Calcolare la quantità di particelle virali da utilizzare per la trasduzione: Utilizzare la seguente formula: TU = (MOI x CN) / VT, mentre TU indica il numero totale di unità di trasformazione, MOI è uguale alla molteplicità desiderato di infezione nel pozzo (MOI o TU / cell), CN specifica il numero di celle in ogni bene, e VT indica archivi titoli virali (TU / ml). Ad esempio, dato che i titoli azionari virali per SMART-shRNA vettore è uguale a 1 x 10 9 TU / ml (unità di trasformazione per ml), 7,5 x 10 5 cellule per pozzetto al momento della trasduzione e un MOI previsto di 20: utilizzare 15 microlitri delle particelle virali di archivi per ogni bene (nota: questa condizione è raccomandato per l'induzione lentivirali transitorio).
  3. Pre-riscaldare 300 ml di mTeSR1 medio con 10 mg / ml di polibrene per 30 min.
  4. Aggiungere 15 ml di archivi particelle virali inil mezzo mTeSR1 pre-riscaldato contenente polibrene e mescolare delicatamente la soluzione.
  5. Sostituire il mezzo di coltura cellulare con 300 ml di mezzo preriscaldata contenenti particelle virali.
  6. Dopo 4 ore di incubazione, esaminare turboGFP fluorescenza (un creatore di espressione shRNA) per determinare l'efficienza di trasduzione.
  7. Aggiungere 300 ml di ulteriore mezzo mTeSR1 alla trasduzione bene quando le cellule iniziano a esprimere turboGFP.
  8. Dopo 12-16 ore di incubazione, riesaminare l'espressione turbo-GFP.
  9. Effettuare esperimenti di follow-up desiderati con queste cellule trasdotte entro 72 ore.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Uno schema generale della cultura NCM

Figura 1 rappresenta un tipico schema cultura NCM indica le variazioni dinamiche di hPSCs dopo alta densità di placcatura unicellulare in presenza dell'inibitore ROCK Y-27632. Questi cambiamenti morfologici includono connessioni intercellulari dopo la placcatura, la formazione di cluster cellulari, e la crescita cellulare esponenziale seguita da condensazione cella (Figura 1A). Un esperimento rappres...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Ci sono due modi principali per hPSCs coltura in vitro: coltura convenzionale colonia-tipo (di celle alimentatori o matrici extracellulari) e cultura sospensione delle hPSCs gli aggregati senza alimentatori 6. Le limitazioni di entrambi colonia-tipo e sospensione metodi di coltura comprendono eterogeneità accumulati e cambiamenti epigenetici ereditabili. Cultura NCM, sulla base sia passaging singola cellula e cellula placcatura ad alta densità, rappresenta un nuovo metodo di coltura per la crescita H...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal Programma di Ricerca Intramurale del National Institutes of Health (NIH) presso il National Institute of Neurological Disorders and Stroke. Vorremmo ringraziare il Dr. Ronald D. McKay per la sua discussione e i suoi commenti su questo progetto.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Contacellule automatizzato CountessInvitrogen Inc.C10227Conteggio automatico delle cellule
Sistema a raggi X Faxitron CabinetFaxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL Modello RX-650Irradiazione a raggi X di MEF,
piastre MULTIWELL a 6 pozzettiBecton Dickinson, Labware353046piastre in polistirene
DMEMInvitrogen, Inc.11965– 092Per MEF medio
Mitomicina CRoche107409Inibitore mitotico
TripsinaInvitrogen Inc.25300-054Per dissociazione MEF
DMEM/F12Invitrogen Inc.11330– 032Per il terreno hPSC
Opti-MEM I Siero ridottoInvitrogen Inc.31985-062Per la trasfezione hPSC
FBS inattivato a caldoInvitrogen Inc.16000– 044Componente del
siero di ricambio MEF medium KnockoutInvitrogen Inc.10828– 028KSR, Componente del fluido hPSC
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfatoInvitrogen Inc.14190-144D-PBS, privo di Ca2+/Mg2+
Aminoacidi non essenzialiInvitrogen11140– 050NEAA, componente del medio hPSC
L-GlutamminaInvitrogen 25030– 081Componente del mezzo hPSC
mTeSR1 & IntegratoriStemCell Technologies5850TeSR2 senza proteine animali
& IntegratoriStemCell Technologies5860Terreno privo di xeno
β-mercaptoetanoloSigma M7522Componente di hPSC medium

MEF (CF-1) ATCC		American Type Culture Collection (ATCC) SCRC-1040Per la coltura in feeder di hPSC
qualificata per hESC MatrigelBD Bioscience354277Per la coltura senza feeder di hPSC
Laminina-521BioLaminaLN521-02Proteina ricombinante umana
FGF-2 (FGF ricombinante, basica)R& D Systems, MN223-FBFattore di crescita nel mezzo hPSC
CryoStor CS10StemCell Technologies7930
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-1041X soluzione enzimatica mista
Inibitore JAK IEMD4 Biosciences420099Un inibitore della Janus chinasi
Y-27632EMD4 Biosciences688000Inibitore ROCK
Y-27632Stemgent04-0012Inibitore ROCK
Y-39983Stemgent04-0029Inibitore ROCK I
FenilbenzodioxanoStemgent04-0030Inibitore ROCK II
ThiazovivinStemgent04-0017Un nuovo inibitore ROCK
BD Falcon Cell StrainerBD Bioscience35234040 µ filtro per cellule m
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 CThermo Scientific C6516F-1"Il signor Frosty" Contenitore di congelamento
Lipofectamine 2000Invitrogen Inc.11668-027Reagenti di trasfezione
DharmaFECT DuoThermo ScientificT-2010-02Reagente di trasfezione
MiRIDIAN non mirato Controllo di trasfezione miRNAThermo ScientificIP-004500-01-05Marcato con Dy547, per monitorare la consegna di microRNA 
SMART-shRNAThermo Scientific Da determinareVettore lentivirale
pmaxGFPamaxa Inc (Lonza)Incluso in ogni kit di trasfezionePlasmide di espressione per il controllo della trasfezione
Oct-4Santa Cruz Biotechnologysc-5279IgG2b di topo, marcatore pluripotente
SSEA-1Santa Cruz Biotechnologysc-21702IgM di topo, marcatore di differenziazione
SSEA-4Santa Cruz Biotecnologiasc-21704Topo IgG3, marcatore pluripotente
Tra-1-60Santa Cruz Biotecnologiasc-21705 IgM di topo, marcatore pluripotente
Tra-1-81Santa Cruz Biotechnologysc-21706IgM di topo, marcatore pluripotente
CK8 (C51)Santa Cruz Biotechnologysc-8020IgG1 di topo, contro la citocheratina 8
&alfa;-fetoproteinaSanta Cruz Biotechnologysc-8399AFP, IgG2a di topo
HNF-3β (P-19)Santa Cruz Biotechnologysc-9187FOXA2, anticorpo policlonale di capra
Troponina T (Av-1)Thermo ScientificMS-295-P0Mouse IgG1
DesminThermo ScientificRB-9014-P1IgG di coniglio
Anti-NANOGReproCELL Inc, GiapponeRCAB0004P-FAnticorpo policlonale 
Anti-GFAP di rattoZymed13-0300Proteina acida fibrillare gliale
Albumina (clone HSA1/25.1.3)Cedarlane Laboratories Ltd.CL2513AIgG1 di topo
Actina muscolare liscia (clone 1A4)DakoCytomation IncIR611/IS611IgG2a di topo
NestinaChemicon InternationalMAB5326Anticorpo policlonale di coniglio
TUBB3Convance IncMMS-435PTuj1, IgG2a di topo
HNF4α (C11F12)Cell Signaling Technologies3113Anticorpo monoclonale di coniglio
Paraformaldeide (soluzione)Microscopia elettronica Sciences15710PFA, fissativo, diluito in D-PBS
, ,

Riferimenti

  1. Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  4. Burridge, P. W., et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  5. Mallon, B. S., et al. StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health. Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).
  6. Chen, K. G., et al. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  7. Bendall, S. C., et al. IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature. 448, 1015-1021 (2007).
  8. Moogk, D., et al. Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation. Cytometry A. 77, 321-327 (2010).
  9. Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).
  10. Amit, M., et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).
  11. Dang, S. M., et al. scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
  12. Serra, M., et al. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).
  13. Steiner, D., et al. propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension. Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).
  14. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  15. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
  16. Jozefczuk, J., et al. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  17. Kozhich, O. A., et al. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2012).
  18. Kunova, M., et al. Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability. Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).
  19. Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2, 167(2011).
  20. Amps, K., et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).
  21. Baker, D. E., et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).
  22. Lee, A. S., et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  23. Domogatskaya, A., et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).
  24. Domogatskaya, A., et al. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
  25. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).
  26. Liew, C. G., et al. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
  27. Braam, S. R., et al. Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media. Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).
  28. Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Cellule staminali pluripotenti umanecoltura in monostratoinibitore ROCK Y 27632coltura su laminina 521modificazione geneticatrasfezione cellulareespansione delle cellule staminalicoltura con proteine definiteinibitori a piccole molecolecoltura priva di colonie
Le colture per pluripotenti umane alternative staminali produzione di celle, manutenzione e analisi genetica
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.