L'imaging time-lapse nell'animale vivente fornisce informazioni preziose sulla riorganizzazione strutturale nel cervello intatto. Qui, introduciamo una preparazione di cranio assottigliato che consente l'imaging transcranico di strutture sinaptiche marcate in fluorescenza nella corteccia di topo vivente mediante microscopia a due fotoni.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Nella corteccia dei mammiferi, i neuroni formano reti estremamente complicate e scambiare informazioni a livello delle sinapsi. I cambiamenti della concentrazione sinaptica, nonché aggiunta / rimozione di sinapsi, si verificano in modo dipendente dall'esperienza, fornendo la base strutturale di plasticità neuronale. Come componenti postsinaptici delle sinapsi più eccitatori nella corteccia, spine dendritiche sono considerati un buon indicatore di sinapsi. Prendendo vantaggi della genetica del topo e tecniche di etichettatura fluorescenti, i singoli neuroni e le loro strutture sinaptiche possono essere etichettati nel cervello intatto. Qui vi presentiamo un protocollo di imaging transcranica con due fotoni microscopia a scansione laser per seguire fluorescente post-sinaptici spine dendritiche nel tempo in vivo. Questo protocollo utilizza un preparato assottigliato-teschio, che mantiene il cranio intatto ed evita effetti infiammatori provocati dall'esposizione delle meningi e la corteccia. Pertanto, le immagini possono essere acquisite subito dopo suviene eseguita rgery. La procedura sperimentale può essere eseguita ripetutamente su vari intervalli temporali da ore ad anni. L'applicazione di questa preparazione può anche essere esteso per indagare diverse regioni corticali e strati, così come altri tipi di cellule, in condizioni fisiologiche e patologiche.
Introduzione
La corteccia dei mammiferi partecipa a molte funzioni cerebrali, dalla percezione e il controllo del movimento per l'elaborazione delle informazioni sensoriali astratta e cognizione. Varie funzioni corticali si basano sui diversi circuiti neurali, che sono costituiti da diversi tipi di neuroni che comunicano e scambiano informazioni su singole sinapsi. La struttura e la funzione delle sinapsi sono costantemente in corso di modifica in risposta alle esperienze e patologie. Nel cervello maturo, la plasticità sinaptica assume la forma di entrambe le modifiche di forza e l'aggiunta / rimozione di sinapsi, che giocano un ruolo importante nella formazione e il mant....
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Protocollo
Approvazione deve essere ottenuto da istituti d'origine prima dell'inizio della chirurgia e studio di imaging. Esperimenti descritti in questo manoscritto sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti della University of California, Santa Cruz Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa.
1. Chirurgia
- Sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici e sterilizzare l'area di lavoro con il 70% di alcol accuratamente prima di un intervento chirurgico.
- Anestetizzare il mouse intraperitoneale (IP) iniezione di soluzione anestetica KX (200 mg / ketamina kg e 20 mg / kg xilazin....
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Risultati
In YFP-H topi linea 25, proteina fluorescente gialla esprime in un sottoinsieme di neuroni piramidali strato V, che proiettano loro dendriti apicali agli strati superficiali della corteccia. Attraverso la preparazione assottigliato-teschio, i segmenti dendritiche fluorescente possono essere ripetutamente ripreso sotto il microscopio a due fotoni su vari intervalli di imaging, che vanno da ore a mesi. Qui mostriamo un esempio di rappresentazione quattro volte le stesse dendriti oltre 8 giorni in corteccia moto.......
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Discussione
Per ottenere un successo preparato assottigliato-teschio, diversi passaggi in questo protocollo sono cruciali. 1) Lo spessore del cranio. L'osso cranico ha una struttura a sandwich, con due strati di alta densità dell'osso compatto e uno strato intermedio di bassa densità dell'osso spugnoso. Mentre il micro trapano ad alta velocità è adatto per rimuovere gli strati esterni di osso compatto e osso spugnoso, la lama microchirurgico è ideale per diluire lo strato interno di osso compatto. Poiché lo spessore e l.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Ringraziamo James Perna per l'illustrazione grafica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institute of Mental Health a YZ
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ketamina | Bioniche Pharma | 67457-034-10 | Miscelato con xilazina per anestesia |
| Xilazina | Lloyd laboratories | 139-236 | Miscelato con ketamina per anestesia |
| Soluzione salina | Hospira | 0409-7983-09 | 0,9% NaCl per iniezione e imaging |
| Lame di rasoio | Microscopia elettronica scienze | 72000 | Lamette da barba in acciaio inossidabile a doppio taglio |
| Tamponi imbevuti di alcol | Fisher Scientific | 06-669-62 | Tamponi sterili per la preparazione dell'alcol |
| Unguento per gli occhi | Henry Schein | 102-9470 | Unguento oftalmico Petrolatum lubrificante oculare sterile |
| trapano ad alta velocità | Fine Science Tools | 18000-17 | Il micro trapano ad alta velocità è adatto per assottigliare lo strato esterno di osso compatto e mirare a una piccola area |
| Micro frese in acciaio | Fine Science Tools | 19007-14 | da 1,4 mm di diametro |
| Surgistar | 6961 | La lama microchirurgica è adatta per assottigliare lo strato interno di osso compatto e lo strato intermedio di osso spugnoso | |
| Colla cianoacrilica | Fisher Scientific | NC9062131 | Fissare la piastra della testa sul cranio |
| Sutura | Havard Apparato | 510461 | Sutura di seta sterile e non assorbente, 6-0 monofilamento |
| Microscopio da dissezione | Olympus | SZ61 | |
| CCD camera | Infinity | ||
| Microscopio a due fotoni | Prairie Technologies | Ultima IV | |
| 10X obiettivo | Olympus | NA 0.30, | |
| aria 60X obiettivo | Olympus | NA 1.1, IR permeabile, | |
| immersione in acqua Laser Ti-zaffiro | Spectra-Physics | Mai Tai HP |
Riferimenti
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in neurosciences
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Ristampe e permessi
