Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata<em&gt; In Situ</em&gt; Protocollo di ibridazione in<em&gt; Xenopus</em

Sommario

L'embrione di Xenopus laevis continua ad essere eccezionalmente utile nello studio dello sviluppo precoce grazie alle sue grandi dimensioni e alla facilità di manipolazione. Viene fornito un protocollo semplificato per l'ibridazione in situ dell'intera montatura che può essere utilizzato nell'identificazione di organi specifici in questo sistema modello.

Abstract

L'organogenesi è lo studio di come gli organi vengono specificati e quindi acquisiscono la loro forma e funzioni specifiche durante lo sviluppo. L'embrione di Xenopuslaevis è molto utile per lo studio dell'organogenesi perché le sue grandi dimensioni lo rendono molto adatto per identificare gli organi nelle prime fasi dell'organogenesi. Al momento, il metodo principale utilizzato per identificare un organo specifico o primordio è l'ibridazione in situ a montatura intera con sonde di RNA antisenso marcate specifiche per un gene che è espresso nell'organo di interesse. Inoltre, è relativamente facile manipolare i geni o le vie di segnalazione in Xenopus e l'ibridazione in situ consente di analizzare i cambiamenti nella presenza o nella morfologia di un organo bersaglio. L'ibridazione in situ dell'intera montatura è un protocollo di più giorni con molti passaggi coinvolti. Qui forniamo un protocollo semplificato con un numero ridotto di passaggi e reagenti utilizzati che funziona bene per i test di routine. I robot di ibridazione in situ hanno notevolmente facilitato il processo e descriviamo in dettaglio come e quando utilizziamo tale tecnologia nel processo. Una volta completata l'ibridazione in situ, catturare l'immagine migliore del risultato può essere frustrante. Forniamo consulenza su come ottimizzare l'imaging dei risultati dell'ibridazione in situ. Sebbene il protocollo descriva la valutazione dell'organogenesi in Xenopus laevis, lo stesso protocollo di base può quasi certamente essere adattato a Xenopus tropicalis e ad altri sistemi modello.

Introduzione

Il modello di espressione di un gene specifico è un'informazione importante nel determinare il ruolo potenziale di quel gene nello sviluppo di un organo o di un tipo di cellula specifico. In poche parole, se non viene espresso al momento e nel luogo giusto, è improbabile che svolga un ruolo chiave. In Xenopus, come nella maggior parte degli embrioni precoci, il test più comunemente usato per rilevare l'espressione di un gene è l'ibridazione in situ a montaggio intero utilizzando sonde di RNA antisenso marcate. L'uso della colorazione degli anticorpi per valutare l'espressione di un gene in Xenopus sta diventando sempre più comune man mano che i ricercatori scoprono anticorpi, di solito sollevati contro le proteine dei mammiferi, che reagiscono in modo incrociato all'omologo di Xenopus o generano i propri ^1-3. Tuttavia, la stragrande maggioranza degli studi sull'organogenesi di Xenopus utilizza ancora sonde di RNA antisenso. Quando vengono utilizzati gli anticorpi, ogni singolo anticorpo richiede spesso l'ottimizzazione per la concentrazione di anticorpi primari o i protocolli di fissazione. Al contrario, il protocollo per le ibridazioni in situ è essenzialmente invariante per diverse sonde. Il concetto di base è relativamente semplice ed è stato ben consolidato un eccellente protocollo standard ⁴. Il nostro protocollo è una versione semplificata del protocollo ^{originale 4} che fornisce ancora un'eccellente rilevazione dei modelli di espressione genica nell'embrione precoce. Gli embrioni vengono fissati e quindi preparati per l'ibridazione modificando le soluzioni e le temperature in modo tale da consentire un legame ad alta stringenza della sonda di RNA antisenso marcata al suo mRNA bersaglio. La sonda non legata viene lavata via e gli embrioni vengono quindi preparati per il legame di un anticorpo contro l'etichetta sulle sonde di RNA. L'anticorpo in eccesso viene quindi lavato via e viene utilizzata una reazione enzimatica del colore per localizzare il punto in cui la sonda di RNA è legata nell'embrione. Ora ci sono un certo numero di linee transgeniche di Xenopus che guidano l'espressione di proteine fluorescenti in tessuti specifici e queste sono disponibili presso i centri di stoccaggio Xenopus come il National Xenopus Resource a Woods Hole. Sebbene sia molto utile per molti esperimenti che richiedono l'esame dell'organogenesi negli embrioni viventi, questa opzione richiede un alloggiamento separato per le linee transgeniche.

L'ibridazione in situ può delineare chiaramente dove si formeranno organi o tipi di cellule specifici nell'embrione precoce (Figura 1). La tecnica è notevolmente sensibile dato che è possibile rilevare l'espressione genica in un piccolo numero di cellule in un singolo embrione ⁵. Tuttavia, l'ibridazione in situ utilizzando l'intensità della colorazione colorimetrica non è considerata quantificabile perché la reazione cromatica non è lineare. Nonostante la difficoltà nel quantificare l'intensità della colorazione, i cambiamenti nell'espressione sono spesso abbastanza evidenti; in particolare quando l'ibridazione in situ mostra aumenti o diminuzioni quantificabili nella dimensione dei domini di espressione ^6,7.

I chiari vantaggi dell'ibridazione in situ a montatura intera la rendono un saggio critico nello studio dello sviluppo precoce. Tuttavia, è un processo che richiede molto tempo e molti passaggi nell'arco di diversi giorni. Questo protocollo è una versione semplificata del protocollo standard che elimina diversi passaggi senza ridurre la qualità del risultato in situ. La semplificazione elimina anche le fonti di variabilità, facilitando la risoluzione dei problemi se un'ibridazione in situ non è ottimale. In particolare, abbiamo eliminato l'uso di trattamenti con proteinasi K e RNAsi dell'embrione, due passaggi che possono dipendere dalla qualità del reagente e possono anche ridurre l'intensità del segnale se esagerati. Il protocollo offre anche un certo grado di risparmio sui costi grazie all'eliminazione dell'uso di diversi reagenti. Infine, questo protocollo fornisce anche alcune semplici linee guida per una migliore acquisizione delle immagini dei risultati dell'ibridazione in situ. Sebbene questo protocollo sia ottimizzato per il lavoro negli embrioni di Xenopus, è probabile che almeno alcune delle semplificazioni saranno applicabili al lavoro di ibridazione in situ in altri sistemi embrionali.

Protocollo

1. Embryo Preparazione

1. Se non è fatto di routine come parte della cultura dell'embrione, de-gelatina embrioni utilizzando 2,5% cisteina, pH 8.0 prima della fissazione ^8. Anche se non è assolutamente necessario, è utile rimuovere manualmente la busta concimazione prima del fissaggio utilizzando una pinza sottile.
   1. Utilizzare pipette Pasteur di vetro per il trasferimento degli embrioni. La pipetta non è sufficientemente larga per trasferire gli embrioni in modo da utilizzare una penna di diamante per tagliare la pipetta di vetro in un punto sufficientemente largo per raccogliere un embrione. Eliminare i bordi taglienti delle pipette dopo il taglio passando rapidamente la punta di taglio attraverso la fiamma di un bruciatore Bunsen per fondere i bordi taglienti.
      NOTA: La cura deve essere presa, come il vetro può essere ancora sufficientemente calda da causare ustioni anche se sembra aver raffreddato mediante ispezione visiva.
2. Eseguire la fissazione embrione nelle fasi. In primo luogo, preparare fiale di vetro per l'utilizzo in fissaggio embrione. Utilizzare questi flaconi per tutte le fasi, tra cui finalestoccaggio. Utilizzare fiale che sono chiare con una buona tenuta Teflon nel coperchio, consentendo per monitorare gli embrioni durante tutte le fasi del processo. Etichettare le fiale con un'adeguata informazione sperimentale utilizzando pennarello indelebile e poi coprire l'etichetta con nastro adesivo trasparente, come anche pennarello indelebile sarà persa nel corso del procedimento a causa dell'uso di alcoli e altri solventi.
   1. Utilizzare Mempfa per fissare gli embrioni. Effettuare una scorta di 8% paraformaldeide in lotti di 50-100 ml alla volta. Utilizzare circa il 75% della richiesta H ₂ O e si riscalda a 50-60 ° C, che è necessario per ottenere la paraformaldeide in soluzione.
      NOTA: Questa soluzione è leggermente diversa da quella utilizzata nelle versioni Memfa protocollo pubblicato più vecchie in quanto utilizza paraformaldeide piuttosto che di formaldeide.
   2. Aggiungere 2-3 gocce di NaOH 10N o fino a quando il pH è pari a circa 7,5 (uso della carta pH per controllare il pH). Paraformaldeide è molto tossico, quindi generare la soluzione di riserva in una cappa aspirante. Una volta che il parala formaldeide è in soluzione, filtrare la soluzione attraverso carta Whatman in un contenitore fresco e inserirlo H ₂ O al volume finale. Se necessario, conservare la soluzione paraformaldeide a 4 ° C per 1-2 settimane.
   3. Assemblare i restanti componenti della soluzione di fissaggio Mempfa (Tabella 1). Assicurarsi che la concentrazione finale di lavoro di paraformaldeide 4%. Conservare tutti i componenti della soluzione di fissaggio a 4 ° C come scorte.
   4. Usando una pipetta di vetro taglio, fissare gli embrioni aggiungendo gli embrioni alle fiale di vetro etichettati che sono stati riempiti con i circa 3-4 ml di soluzione Mempfa (Tabella 1). Evitare di fissare più di 20-30 embrioni per flacone. Aggiungere gli embrioni con un minimo di trasferimento di liquido dal mezzo embrione. Fissare embrioni in soluzione Mempfa per 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
   5. Per le strutture in ritardo endoderma eseguire l'in situs su isolate manualmente intestinale e endoderma derivati ^​​9,10, Che consente una buona penetrazione della sonda ed evita anche cavità colorazione.
   6. Conservare una soluzione di metanolo 100% a -20 ° C. Dopo la fissazione paraformaldeide, sostituire la soluzione Mempfa con circa 4 ml di -20 ° C, 100% di metanolo per la conservazione degli embrioni.
   7. Agitare i flaconi dopo l'aggiunta del metanolo per evitare gli embrioni di attaccarsi al vetro o altri embrioni. Inoltre, assicurarsi che i flaconi sono ermeticamente chiusi perché il metanolo può evaporare in freezer nel tempo se sciolto.
      NOTA: embrioni può essere conservato per almeno un anno, e probabilmente più, nel metanolo prima della colorazione senza perdita di qualità in situ ibridazione.

2. Sonda Preparazione

1. Utilizzare 1-2 mg di DNA stampo per rendere le sonde digossigenina marcato. Cut plasmide contenente la sequenza di DNA appropriata all'estremità 5 'del gene di interesse con un enzima di restrizione adeguato that vettoriale per generare sonde antisenso.
   NOTA: Il plasmide dovrebbe avere un sito di legame appropriata polimerasi RNA (es T7, T3, o SP6).
2. Lasciare il DNA, acqua, NTP mescolare e tampone polimerasi riscaldare a temperatura ambiente prima di assemblare la reazione di sintesi della sonda. Aggiungere i componenti della reazione di sintesi di RNA in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml nell'ordine indicato nella tabella 2. Regolare il volume di acqua aggiunta per portare il volume totale della reazione di sintesi della sonda a 20 microlitri. Montare la reazione a temperatura ambiente perché i componenti del buffer polimerasi può precipitare il DNA modello quando in concentrazioni elevate e freddo.
3. Incubare la reazione di trascrizione per 2 ore a 37 ° C.
   NOTA: Incubazioni di poco più di due ore porta ad effetti negativi, ma anche mostrano poco aumentato la resa. Se incubati per un'ora, il rendimento sarà ridotto, ma comunque sufficiente per effettuare una buona sonda.
   1. In attesa per la reazione di trascrizione alla fine, fare un gel di agarosio che verrà utilizzato per verificare la qualità della sonda. Sciogliere 1 mg di agarosio in 100 ml di tampone TAE 1x (vedi Tabella 1) riscaldando la soluzione al punto di ebollizione. Rimuovere la soluzione dal calore quando la polvere agarosio si è completamente dissolto.
   2. Aggiungere 2 microlitri etidio bromuro soluzione madre (10 mg / ml) a circa 100 ml di gel di agarosio durante l'agarosio si è raffreddata a circa 60 ° C per permettere la visualizzazione di RNA sotto ultravioletta (UV).
      NOTA: Questa soluzione gel di agarosio può essere conservato in un incubatore a 60 ° C in modo che future gel possono essere versati senza sciogliersi ripetuto. Prestare attenzione nel maneggiare bromuro di etidio causa di potenziale tossicità.
4. Aggiungere 1 ml DNAseI (RNAse grado libero) per la reazione di trascrizione dopo l'incubazione 2 ore e incubare per altri 10 min a 37 ° C per eliminare DNA stampo.
5. Rimuovere 1 ml di miscela di reazioneverificare l'1% gel di agarosio-TAE e il resto (20 microlitri) aggiungere 80 ml ​​di 1% SDS in tampone TE (10 mM Tris pH 8,0, EDTA 1 mM), 10 ml di 5M NH ₄ acetato, e 220 ​​microlitri etanolo freddo. Vortex la miscela vigorosamente e mettere da parte in ghiaccio in attesa dei risultati del controllo di qualità RNA.
   1. Eseguire le 1 ml di RNA rimossi prima della precipitazione sul 1% gel-TAE. Per facilitare il carico sul gel, aggiungere 4-5 ml di acqua e 1 ml di colorante carico standard per l'RNA. Mostra la RNA sul gel utilizzando un transilluminatore luce UV per verificare la qualità della sonda (vedi la discussione).
6. Precipitare il RNA residuo che è stato allocato su ghiaccio nel passo 2.5 facendo girare in una microcentrifuga a piena velocità per 10 a 15 min. Aspirare il surnatante con una pipetta di vetro attirato e lasciare asciugare brevemente.
   1. Risospendere la sonda con 1 ml di tampone di ibridazione RNA (Tabella 1) nella provetta eppendorf. Vortex e briefly riscaldare il tubo a 37 ° C e agitare nuovamente. Trasferire la soluzione della sonda ad una vite da 15 ml tappo della provetta di polistirene e riempire di 7-10 ml con tampone di RNA ibridazione. Nota: La sonda può essere diluito ulteriormente (a 10 volte l'ulteriore diluizione può ancora funzionare), spesso con conseguente basso fondo, ma le reazioni di colorazione anche richiedere più tempo.

3. In ibridazione in situ

1. Prendere gli embrioni che sono stati memorizzati in -20 ° C metanolo e lasciarla riscaldare a temperatura ambiente. Eseguire l'intera procedura in fiale di vetro. Se gli embrioni diversi da un gruppo stanno per essere guardato da diverse sonde, tenerli in un singolo flaconcino fino a poco prima che le sonde sono aggiunti per ridurre la variabilità e del lavoro il primo giorno.
   1. Reidratare gli embrioni attraverso una serie di metanolo come indicato nella Tabella 3 (vedi Tabella 1 per ricette lavaggio) in preparazione per l'aggiunta della sonda. Agitare delicatamente la Embryos dopo ogni modifica al fine di garantire che non si attengono ai lati o l'altro, e roccia gli embrioni montando i flaconi su una nutator. Durante il trasferimento dei liquidi, controllare l'interno dei tappi per garantire che gli embrioni sono stati intrappolati lì.
   2. Una volta nella soluzione della sonda, gli embrioni ibridare overnight come descritto nella Tabella 3.
2. Rimuovere la soluzione della sonda. Salvare la sonda utilizzata per la memorizzazione in un 15 ml con tappo a vite tubo di polistirene, contrassegnato con la data e il numero di volte in cui la sonda è stato utilizzato, a -20 ° C.
   NOTA: La stessa sonda può essere riutilizzato più volte per la successiva ibridazioni in situ fino a quando le reazioni colorimetriche iniziano a prendere un tempo eccessivamente lungo per raggiungere l'intensità desiderata.
   1. Una volta che la sonda è rimosso, preparare gli embrioni per la colorazione di anticorpi contro la sonda attraverso la serie di lavaggi descritti nella Tabella 4. Modificare la temperatura come richiesto (Tabella 4) t spostandoegli nutator, con fiale di embrioni allegati, direttamente nel forno di ibridazione che sono impostati alla temperatura adeguata.
   2. Portare il volume appropriato del MAB + HTSS + BR + anti-Dig anticorpi (Tabella 4) nel momento in cui gli embrioni vengono incubati nel MAB + HTSS + BR soluzione bloccante in modo che l'anticorpo è bloccato prima di aggiungere al embrioni. Fare le soluzioni bloccano fresco il giorno di utilizzo.
3. Rimuovere la soluzione di anticorpi e iniziare lavaggi come indicato nella Tabella 5 seguente notte di incubazione con l'anticorpo. Eseguire almeno dodici 30 min lavaggi per preparare per la colorazione con il substrato della fosfatasi alcalina e ridurre lo sfondo, per quanto possibile. Utilizzare tampone MAB o soluzione OTC (Tabella 1) per le fasi di lavaggio.
   NOTA: soluzione TBT è ttw che ha 2 mg / ml di BSA aggiunto.
   1. Sostituire l'ultima soluzione di lavaggio con la BM substrato fosfatasi alcalina viola. Eseguire le REAC colorazionezione sia a temperatura ambiente oa 37 ° C.
      NOTA: La colorazione è più rapida a 37 ° C, ma se lasciato overnight, sfondo inaccettabile colorazione spesso può essere un risultato. Le reazioni di colorazione spesso richiedono colorazione durante la notte e la temperatura ambiente è più sicuro per questo.
   2. Se è necessaria un'ulteriore colorazione e la soluzione viola BM sta assumendo un colore blu, sostituire la soluzione colorante con fresco BM Viola e mettere i tubi in 37 ° C. Se l'mRNA bersaglio è molto abbondante, mettere gli embrioni nella soluzione colorante a 4 ° C durante la notte e quindi spostare gli embrioni a temperatura ambiente oa 37 ° C per consentire un migliore monitoraggio della reazione di colorazione.
   3. Monitorare con attenzione nuove reazioni, come il tempo di risultato finale varia considerevolmente tra i diversi RNA bersaglio. Per coerenza, arrestare la reazione di colorazione (vedi 3.4) quando non ci sono nuovi siti di espressione derivanti con più di incubazione. È importante sottolineare che, se in situ ibridazione viene utilizzato come dosaggioper esperimenti in cerca di diversi gruppi di trattamento, utilizzare lo stesso tempo per le reazioni di colore tra trattamento e di controllo embrioni.
4. Arrestare la reazione di colorazione e preparare gli embrioni per la conservazione e la registrazione di immagini cambiando i liquidi come indicato nella Tabella 6. Non oscillare gli embrioni in questa fase, perché la rimozione di macchie può essere visualizzato come colorazione viola del metanolo intorno gli embrioni.
   NOTA: Spesso embrioni hanno una colorazione blu chiaro dalla soluzione colorante e il metanolo freddo può almeno parzialmente rimuovere che, anche se questo non è sufficiente a rimuovere lo sfondo pesante o cavità colorazione. Metanolo freddo si riferisce a metanolo che viene mantenuto in un freezer a -20 ° C.
   1. Reidratare gli embrioni e fissare la macchia con Mempfa (Tabella 6). Una volta fissato, rimuovere il Mempfa e lavare gli embrioni con il 25% di metanolo.
   2. Rimuovere il metanolo 25% e aggiungere la soluzione di sbianca se la rimozione di pigmento endogenoè obbligatorio. Fare attenzione nel maneggiare la soluzione sbiancante in quanto può causare ustioni. Osservare la sbianca strettamente come avviene in tempi relativamente brevi e il grado di candeggio può essere variata per i diversi effetti (Figura 2).
   3. Disidrata embrioni attraverso una serie di metanolo al 100% di metanolo per la conservazione a lungo termine dopo il candeggio, o trasferire a PBS per la conservazione a breve termine e di imaging successiva (vedi Tabella 6).

4. Imaging embrioni

1. Una volta che un embrione ha completato il processo di colorazione, l'embrione immagine in modo che le informazioni di cui viene espresso il gene di interesse viene catturato per un pubblico più vasto. Utilizzare 1% agarosio come sfondo per visualizzare gli embrioni non liquidati.
   NOTA: Il agarosio dà uno sfondo blu / grigio che contrasta bene con l'embrione e il colore blu della reazione di colorazione. Aiuta anche diffondere ombre e riflessi che deviano l'attenzione dall'embrione distrazione.
   1. Aggiungi agarosio all'acqua e quindi portare ad ebollizione fino a quando l'agarosio è in soluzione e poi lasciare raffreddare a 50 prima di versare nella capsula di Petri. Come con la soluzione di gel TAE, conservare la soluzione di agarosio a 55 ° C incubatore per molteplici usi. Versare il agarosio ad una profondità di circa 2 mm nella capsula di Petri. Se necessario, regolare la profondità di agarosio per produrre un leggermente diverso tonalità di sfondo.
   2. Dopo reidratazione dal magazzino in metanolo ad una soluzione acquosa (PBS o TTW), utilizzando una serie metanolo, posizionare gli embrioni in una capsula di Petri con la base agarosio (vedi tabella 6). Mantenere la soluzione pulita e, se necessario, utilizzare semplice filtraggio per eliminare piccolo particolato che può compromettere lo sfondo pulito di buone immagini.
   3. Per l'immagine gli embrioni di visualizzazioni alternative, come ad esempio dal lato ventrale, tagliare i canali sottili in agarosio per adattare l'embrione utilizzando una pinza sottile e posizionare gli embrioni in quei canali per l'orientamento (Figura 3 ). Fare attenzione nel manipolare gli embrioni in quanto sono facilmente danneggiati.
      NOTA: La maggior parte degli stadi hanno una posizione caratteristica che assumono quando sono immessi in soluzione. Ad esempio, gli embrioni blastula stadi tendono a sedersi animale verso l'alto. Una volta che gli embrioni cominciano ad allungarsi, depongono dalla loro parte.
2. Utilizzare la sorgente di luce in fibra ottica per illuminare l'embrione da un angolo basso, creando ombre sull'embrione che forniscono profondità all'immagine e contribuire a discernere strutture superficiali. Perché sbiancamento può eliminare pigmento che fornisce punti di riferimento utili, utilizzare shadowing per gli embrioni fortemente sbiancati.
3. Cancellare gli embrioni di immagine colorazione che è profondo all'interno dell'embrione, come nelle notocorda, polmone, o regioni del cervello, (Figura 4). Per fare questo, mettere gli embrioni attraverso una serie metanolo fino a 100% metanolo.
   1. Dopo immersione completa in metanolo, trasferire gli embrioni ad una soluzione di una parte di alcool benzilico e due parti benzile esserenzoate (BABB). Gli embrioni inizialmente galleggiare sulla superficie ma come il metanolo mescola con il BABB, che affondano nel BABB. Eseguire ogni passo che fare con BABB in fiale di vetro o piatti; BABB si scioglierà qualsiasi plastica o vernice.
   2. Una volta eliminato, visualizzare gli embrioni con luce trasmessa proveniente da sotto l'embrione. Regolare l'intensità della luce così come l'angolo dal basso per migliorare il contrasto e fornire il colore migliore.
   3. Durante la visualizzazione embrioni eliminato sollevano la capsula di Petri di vetro dalla base. Per fare ciò, semplicemente utilizzando altri due coperchi capsula di Petri a sollevare in modo che la regione del recipiente con embrioni è elevata.
      NOTA: Questo ha il vantaggio di prendere la base fuori fuoco e di eliminare gli effetti di disturbo da imperfezioni o macchie sulla base del microscopio che può interferire con l'immagine.

5. Fare doppio ibridazione in situ

1. Per visualizzare contemporaneamente il pattern di espressione di two diversi geni in un singolo embrione, sintetizzare due sonde, una per ciascuno dei diversi geni. Sintetizzare una sonda con DIG-11-UTP come etichetta come descritto sopra. Diluire il prodotto della reazione di trascrizione in tampone RNA ibridazione per produrre una sonda più concentrato rispetto 3x utilizzati per singolo ibridazioni in situ.
   1. Sintetizzare l'altra sonda di interesse utilizzando lo stesso protocollo per DIG etichettato sondato salvo che fluoresceina-12-UTP deve essere sostituito DIG-11-UTP. Diluire il prodotto della reazione di trascrizione in tampone RNA ibridazione per produrre una sonda più concentrato rispetto 3x utilizzati per singolo ibridazioni in situ.
   2. Mescolare le due sonde concentrati in un rapporto 1: 1. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare la sonda con fluoresceina per il gene che mostra la più forte espressione nel singolo in protocollo situ.
2. Utilizzare lo stesso in protocollo situ descritta per singolo in situ </ Em> ibridazioni, tranne utilizzare la doppia sonda (probe contenente la miscela 1.5x concentrato di sonde digossigenina e marcato con fluoresceina) alla fine del primo giorno in luogo di un'unica sonda situ ibridazione.
   1. Seguire il protocollo di ibridazione singolo il secondo giorno del doppio in protocollo situ, tranne frammenti uso anti-fluoresceina AP Fab in una diluizione 1: 4000 in luogo di frammenti anti-DIG-AP Fab. Lavare l'anticorpo in eccesso dal embrione come nel singolo in protocollo situ ed effettuare la prima reazione del colore utilizzando il substrato BM-Viola AP.
3. Dopo la prima reazione del colore, disattivare l'anticorpo fluoresceina in 0,1 M glicina a pH 2.0 per 40 minuti, seguiti da cinque dieci minimo di lavaggi in MAB. Bloccare gli embrioni in MAB + HTSS + BR per 90 min. Aggiungere l'anticorpo anti-DIG ad una diluizione 1: 2.000 in MAB + HTSS + BR e incubare a 4 ° C durante la notte.
   1. Il giorno seguente, lavare gli embrioni °oroughly in MAB (12 lavaggi di 30 minuti) per rimuovere l'anticorpo in eccesso.
   2. Lavare gli embrioni per 10 min a AP Buffer (Tabella 1) e quindi macchiare con BCIP (0.5mg / ml in tampone AP).
      NOTA: La combinazione in situ dovrebbe dare una colorazione blu-viola scuro per la prima reazione di colore e una reazione di colore azzurro per il secondo (Figura 5).
   3. Arrestare la reazione finale del colore rimuovendo il tampone AP e lavare tre volte con MAB. Fissare gli embrioni con Mempfa per 10 min. Lavare gli embrioni con 5 lavaggi rapidi in MAB o TBT.
   4. Con questa combinazione di colori, l'uso di metanolo nei trattamenti post colorazione è più possibile, in quanto elimina il solo colore BCIP. Conservare gli embrioni dopo colorazione e la fissazione in PBS con il 0,02% di sodio azide. Intensità di colorazione può essere debole con letto in situs. Se questo è un problema, ridurre i lavaggi a quattro, ciascuna di durata 2 ore.

Risultati

L'uso di sonde specifiche del tessuto può fornire informazioni eccellente per quanto riguarda lo stato di sviluppo per organi specifici. Nei seguenti esempi, la fase dell'embrione si basa sulla tabella di gestione temporanea Nieuwkoop e Faber ^11. Se uno usa geni forma sonde espressi dopo la differenziazione, troponina I cardiaca in fase di 28-30, per esempio (Figura 1C), la presenza o la dimensione di un organo differenziata può essere valutata in ogni differenziazione fase d...

Discussione

La possibilità di utilizzare l'ibridazione in situ per visualizzare il pattern di espressione di geni specifici rimane il metodo più comunemente utilizzato per identificare organi specifici o tipi cellulari nell'embrione Xenopus. Questo è causa di numerosi vantaggi offerti da questa tecnica. L'espressione di un gene in grado di identificare le strutture specifiche ben prima di qualsiasi segno istologico di differenziazione, come nel caso di espressione Nkx2.5 nei progenitori cardia...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Labguake Agitatori per provette	VWR	17-08-2011
VWR Fiale	VWR	VWR 10-07-2012
L-Cisteina	BioShop	CYS342.500
Set di trifosfato ribonucleosidico, 100mM	Roche	11277057001
Digoxigenina-11-UTP	Roche	11209256910
Inibitore della Rnasi (Rnase OUT)	Invitrogen	10777-019
T7 RNA polimerasi	fermentas	EPO111
T3 RNA polimerasi	fermentas	EPO101
SP6 RNA polimerasi	fermentas	EPO131
Dnase 1	Invitrogen	18047-019
Siero di pecora	Wisent	31150
Reagente bloccante	Roche	11096176001
BM viola Substrato Ap	Roche	11442094001
Anti-Digoxigenina-Ap Frammenti di Feb	Roche	11093274910
Metanolo	VWR	CAMX0485-7
NaCl	BioShop	SOD002.10
SDS	EM	7910
EDTA	BioShop	EDT001.500
Tris	BioShop	TRS003.5
Tween-20	EM	9480
MgSO4	Sigma	M-2643
Mops	BioShop	MOP001.250
EGTA	Sigma	E-3889-25G
Paraformaldeide	BioShop	PAR070.500
Formamide	VWR	CAFX0420-4
RNA	Roche	10109223001
acido maleico	VWR	CAMX0100-3
citrato tri-sodio	BioShop	CIT001
Perossido di idrogeno (soluzione al 30%)	EM	HX0635-2
BSA	BioShop	ALB001.100
PVP-40	ICN	195451
Ficoll 400	GE Healthcare	17-0300-10
Alcool benzilico	Sigma	B-1042
Benzoato benzilico	Sigma	B-6630
Agarosio ultrapuro	Invitrogen	16500-500