In vitro delle cellule Cultura modello per Tossico per inalazione Chemical Testing

Sommario

Questo protocollo è progettato per dimostrare metodo di esposizione di colture cellulari a sostanze chimiche tossiche inalate. Esposizione di differenziata interfaccia aria-liquido (ALI) colture di cellule epiteliali delle vie aeree fornisce un modello unico di esposizione vie aeree per gas tossici quali cloro. In questo manoscritto descriviamo effetto dell'esposizione cloro su colture di interfaccia aria-liquido di cellule epiteliali e coltura sommersa di cardiomiociti. Sistemi di esposizione in vitro consentono importanti studi meccanicistici per valutare percorsi che possono poi essere utilizzati per sviluppare nuovi agenti terapeutici.

Abstract

Le colture cellulari sono indispensabili per sviluppare e studiare l'efficacia di agenti terapeutici, prima del loro utilizzo in modelli animali. Abbiamo la capacità unica di modellare cellule dell'epitelio delle vie respiratorie umane e del muscolo cardiaco ben differenziate. Questo potrebbe essere uno strumento prezioso per studiare gli effetti deleteri delle sostanze chimiche tossiche per via inalatoria, come il cloro, che può normalmente interagire con le superfici delle cellule e formare vari sottoprodotti su reagendo con l'acqua, e limitare i loro effetti nelle culture sommerse. Il nostro modello utilizzando colture di cellule epiteliali delle vie respiratorie umane ben differenziati a interfaccia aria-liqiuid aggira questa limitazione, nonché offre la possibilità di valutare i meccanismi critici di tossicità delle sostanze chimiche potenzialmente tossiche per via inalatoria. Descriviamo una maggiore perdita dell'integrità della membrana, il rilascio caspasi e morte su tossica chimica per via inalatoria come l'esposizione al cloro. In questo articolo, vi proponiamo i metodi per modellare l'esposizione cloro nel cuore dei mammiferi e delle vie respiratorie epiteliale cells di cultura e di semplici test per valutare il suo effetto su questi tipi di cellule.

Introduzione

Esposizione a sostanze chimiche tossiche inalatoria (tic) / gas come cloro (Cl ₂₎ rimane un problema sanitario in corso in esposizioni accidentali che nel loro uso potenziale come agente minaccia chimica. Anche se i polmoni sono l'obiettivo primario, organi come cuore e cervello sono anche colpiti ^1-3. Modelli in vivo sono generalmente utilizzati per la tossicità di test da tic, ma in vitro per la valutazione della tossicità sono più semplici, più veloci e più conveniente. In modelli in vitro consentono anche vasto studio delle interazioni agente-cellulari che possono essere difficili da valutare in vivo. Tali sistemi di esposizione in vitro sono rari e inoltre, in alcuni modelli convenzionali dove gli agenti tossici vengono aggiunti al mezzo di coltura in cui le cellule sono sommersi, le proprietà degli agenti possono cambiare a causa di interazioni di legame e dai componenti del mezzo. In tali scenari sistemi di coltura cellulari come interfaccia aria-liquido (ALI) colture di cellule primarie umane epiteliali delle vie aeree, qui proposte, che possono essere direttamente esposti ad agenti gassosi potrebbero essere promettenti.

Cellule epiteliali che rivestono le vie respiratorie sono le prime linee di difesa contro le sostanze chimiche tossiche inalate. L'epitelio delle vie aeree umano forma una barriera fisica tra il lume e le celle sottostanti nel polmone e partecipa alla risposta del polmone. Si produce una serie di citochine e altri agenti pro e anti-infiammatori e secerne muco liquido superficie / vie aeree (ASL) che copre l'epitelio. Una delle limitazioni nella convenzionale sommerso in sistemi di coltura in vitro è anche che l'ASL e muco che copre la superficie epiteliale viene rimosso o diluite. Questo non riflette lo stato fisiologico delle cellule epiteliali del polmone che sono esposte all'aria. Così, un sistema ideale in vitro per test di tossicità TIC dovrebbe replicare questa architettura. C'è grande interesse per lo sviluppo rapido di screening metodi che predicono tossicità vivo. Le cellule epiteliali coltivate nella ALI differenziare e hanno strutture e funzioni ben differenziati rispetto alle cellule coltivate sommerse e servire un modello superiore delle vie respiratorie.

In questo studio, descriviamo l'uso della cultura aria-liquido-interfaccia vie respiratorie umane (tracheobronchiale), le cellule epiteliali per testare la tossicità velenoso gas inalato e lo confrontiamo con una cultura di cellule sommerso di cardiomiociti, quindi studiando un altro obiettivo importante di tossicità.

Protocollo

1. Culture Rat cardiomiociti

1. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dalla cura degli animali e l'uso comitato istituzionale, IACUC.
2. Ottenere cardiomiociti di ratto dal cuore (ventricoli) di ratti maschi (240-260 g) utilizzando metodi descritti in precedenza ^4. Brevemente, anestetizzare animali con una iniezione intraperitoneale di pentobarbital (100 mg / kg; confermare anestesia metodo pizzico piedi) e quindi rimuovere cuori in 10,0 ml, Ca ^{2 +} contenente tampone Krebs Ringer, pH 7,4 1 mM.
3. Sciacquare i cuori 5-6x per rimuovere il sangue e poi passare a un buffer di Ca ^{2 +} libero Krebs Ringer contenente 0,02% della proteasi e 0,06% collagenasi A (5.0 ml / cuore). Incubare i cuori in questa soluzione per 10-15 minuti a 37 ° C con agitazione intermittente.
4. Dopo 10-15 minuti, lavare la soluzione enzimatica con tampone di Ca ^{2 +} libero Krebs Ringer per un ulteriore 5 min. Rilasciare le cellule dal tessuto flaccido noizione di una pipetta 25 ml pipettando sospensione su e giù parecchie volte.
5. Separare le cellule dal tessuto per filtrazione attraverso una rete di nylon 70 micron e permettono loro di stabilirsi in tampone Krebs Ringer contenente 0,1 mM Ca ^{2 +.} Sospendere il pellet di cellule in 1,0 ml di tampone Krebs Ringer contenente 0,2 mM Ca ^{2 +.}
6. Strato con cautela over 5,0 ml 60 mg / ml di albumina sierica bovina, BSA, in 15 ml provette per centrifuga per separare cardiomiociti da nonmyocytes e permettere loro di accontentarsi di 30 min. I cardiomiociti sono più pesanti e si portano sul fondo della provetta. Rimuovere accuratamente le cellule surnatante e dei media. Ripetere questo passaggio una volta per purificare ulteriormente le cellule.
7. A poco a poco la transizione da lavare (in gradini con 0,25 mm, 0,5 mm 0,75 mm e 1,0 mM Ca ^{2 +} contenente tampone) le ventricolari miociti / cardiomiociti a 1,0 mM Ca ^{2 +} contenente tampone e risospeso in mezzo ACCT composto da Dulbecco Modified Eagle Medium , DMEM containing 2 mg / ml BSA, 2 mM L-carnitina, creatina 5 mM, taurina 5 mM, 100 IU / ml di penicillina, e 100 pg / ml streptomicina.
8. Piastra cardiomiociti in ACCT mezzo ad una densità da 100 a 150 cellule / mm ² sul 100 o 35 mm laminina capsule di Petri di plastica o 40 x 22 mm coprioggetto di vetro rivestiti con laminina (1 mg / cm ²⁾ rivestite. Dopo 1 ora, lavare i piatti con 2,0 ml ACCT per rimuovere le cellule che non sono collegati. Aggiungere 10,0 ml di mezzo fresco e incubare le cellule.

2. Differenziata aria-liquido Interface (ALI) La cultura di cellule umane Airway epiteliali basali

1. Procurarsi tessuti tracheobronchiale umani da National Disease Research Interchange sotto Institutional Review Board protocolli approvati. La raccolta delle cellule ed eseguire cultura utilizzando una procedura ^5,6 pubblicata. Questa procedura utilizza colture di cellule in quanto sono un preciso modello per le esposizioni inalatorie umana verso TIC, tuttavia, se necessario, si può isolare e crescere a mo ALIutilizzare e / o cellule epiteliali delle vie aeree di ratto ^7,8.
2. In breve, fare piccoli pezzi (~ ¼ pollice) del tessuto dopo aver rimosso tutti i nodi del tessuto connettivo e linfonodi. Lavare il tessuto più volte in soluzione di Ringer lattato. Aggiungere tessuti in una provetta da 50 ml e aggiungere la soluzione di proteasi (1% Protease/0.01% DNasi in terreno minimo essenziale, MEM, tessuto a rapporto fluido (1,10)).
3. Muovere il tessuto a 4 ° C per tutta la notte. Terminare la dissociazione del tessuto con l'aggiunta di siero bovino fetale al 10%. Raschiare la superficie epiteliale con un bisturi chirurgico e raccogliere le cellule per centrifugazione (2000 rpm per 10 min).
4. Cellule piastra a passaggio uno snapwells collagene rivestite in mezzo speciale ALI preparati come descritto in dettaglio da Fulcher et al ^9. Culture per 5 giorni prima di cambiare all'interfaccia aria-liquido (ALI) rimuovendo i media apicali.
5. Nutrire le cellule utilizzando mezzi ALI ogni giorno si alternano e permettono alle cellule di differenziarsi per ulteriori 2-3 settimane (osservare numerose ciglia battitura e secrezione di muco) prima di eseguire le esposizioni. Lavare la superficie apicale con il caldo PBS con i cambiamenti dei media.

3. Cloro esposizione

1. Contenere il sistema di esposizione cloro (CES) all'interno di una cappa chimica qualificato con velocità frontale operativa di 100 fpm che fornisce il contenimento secondario necessaria per evitare l'esposizione del personale in caso di perdite accidentali di cloro.
2. Utilizzare il sistema sotto una leggera pressione positiva (0,5 pollici di acqua). Aria secca viene alimentata a 15 L / min e un adeguato livello di cloro viene alimentato per raggiungere la concentrazione di cloro finale desiderata. Le camere hanno un coperchio di chiusura con 4 mini serrature BCU e un basso durometro guarnizione siliconica per realizzare la tenuta a pressione.
3. Consegnare la miscela Cl ₂ attraverso un controller di portata massica. Il CES utilizza una bombola di gas compresso contenente 1,0% Cl ₂ in azoto secco.
4. Regolare il flusso d'aria di diluizione con l'progettato su misura del pannello di controllo e, analogamente, regolare la concentrazione di Cl ₂ consegnato alle camere di esposizione. Una pompa di campionamento a volume basso tira scarico dalle camere in un analizzatore di cloro per monitorare le concentrazioni che vengono poi registrati su un registratore di dati collegato all'analizzatore.
5. Misurare le portate all'interno delle camere di prima dell'esposizione utilizzando un misuratore di flusso per assicurare parità di tassi di consegna e di scarico.
6. Preparare le colture cellulari per l'esposizione rimuovendo il materiale surnatante e l'aggiunta di mezzi freschi (supporti basolaterali nelle culture ALI). Tutti i pretrattamenti con agenti potrebbero essere eseguite in questo momento.
7. Esporre le colture ALI di cellule epiteliali delle vie aeree a Cl ₂ gas (50, 100, o 300 ppm per 30 min) nelle due camere polisulfone biocontenimento sigillati. I cardiomiociti (immersi o culture sulle membrane confluente) sono esposti per 50 o 100 ppm Cl ₂ per 15 min.
8. Dopo l'esposizione irrigare le camere con aria fino alla Cl ₂ livello scende al di sotto di 1 ppm e può essere aperta in modo sicuro per rimuovere le cellule (entro 5 minuti).

4. Transepiteliale resistenza elettrica (TER) Misura

1. Misurare il TER di aria-liquido-interfaccia, ALI, culture usando un voltohmmeter epiteliale con un paio di argento cloruro elettrodi "bacchette".
2. Equilibrare l'elettrodo bacchette nel ALI mezzi 15 minuti prima dell'uso.
3. Aggiungi mezzi di caldo al apicale (1,0 ml) e basolaterale (2,0 ml) di superficie e misurare la TER utilizzando gli elettrodi bacchette del voltohmmeter.
4. Immergere il braccio più corto del elettrodo in apicali e il braccio più lungo nei media basolaterale. Fare clic sul pulsante 'misura' sul voltohmmeter per valutare la resistenza elettrica.
5. Il voltohmmeter ha la possibilità di misurare ohm o ohm k. Sottrarre la resistenza attraverso un supporto di coltura privo di cellule dalla resistenza misurata su ogni strato di cellule a cedere il transresistenza epiteliale (TER).

5. Caspase misura

1. Aggiungere mezzi freschi ALI (2,0 ml) alla superficie basolaterale post esposizione e incubare la cella a temperatura ambiente. Raccogliere i media surnatante a 4 e 24 ore.
2. Misurare caspasi 3/7 attività nei surnatanti Media mediante una caspasi commerciale 3/7 kit di analisi.

6. Western Blot e Immunocytochemistry

1. Eseguire western blot utilizzando lisati cellulari come descritto in precedenza ^10. Sospendere il lisato proteico (20 mg) a 5x tampone campione ridotto e far bollire per 5 min. Sottoporre il lisato proteico di SDS-PAGE (4-15%) e trasferire le proteine ​​separate da una membrana di nitrocellulosa blotting elettroforetico.
2. Bloccare il legame non specifico incubando la membrana con 5% di latte in tampone di lavaggio (PBS + 0,1% di detergente) e sondare le membrane con anticorpi primari contro SERCA2 o actina sarcomerica a 1:1000 diluizione, overnight a 4 ° C. Avanti, lavare e incubare le membrane con i rispettivi anticorpi secondari coniugati con perossidasi e sviluppare per il rilevamento come descritto in precedenza ¹⁰ utilizzando kit per il rilevamento perossidasi commerciale.
3. Per immunocitochimica trattano cellule vive coltivate su inserti o vetrini in piastre da 6 pozzetti con 0,4% Triton-X-100 in 10 mM tampone citrato di sodio per 20 minuti dopo risciacquo con PBS.
4. Blocco legame non specifico trattando le cellule con siero asino 5% per 20 minuti, e poi incubare le cellule con IgG non specifiche o di singoli anticorpi primari specifici per actina sarcomerica o Ki-67.
5. Lavare le cellule con PBS e incubare con anticorpi secondari coniugati fluorescenti per rilevare l'anticorpo primario e un colorante nucleare (1 mg / ml DAPI).
6. Lavare con PBS e montare coprioggetto utilizzando un mezzo di montaggio commerciali.
7. Visualizza la colorazione utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Risultati

Cardiomiociti forma di bastoncello primaria attaccano su matrici laminina e si diffondono e si differenziano in colture confluenti (Figure 1A e il suo inserto). Queste cellule sono state ulteriormente caratterizzate in base actina sarcomerica ed espressione SERCA2 (Figure 1B e 1C). Cardiomiociti di ratto sono molto sensibili alla tossicità del cloro come 15 minuti di esposizione a 100 ppm di cloro causato ingenti arrotondamento e morte cellulare nelle culture sommerse e...

Discussione

Il tipo più comune di esposizioni tossiche acuta si verifica quando si respira una sostanza chimica velenosa nei polmoni. Queste sostanze chimiche possono anche essere rapidamente assorbiti nel flusso sanguigno e possono influenzare altri organi come il cervello e il cuore. Tossicità per inalazione di vari agenti utilizzando modelli animali è stata studiata e riportata ampiamente, ma i meccanismi sono meno conosciuti. Questo è un grande ostacolo nello sviluppo di terapie efficaci. Assenza di sistemi di esposizione i...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ratti	Harlan Laboratories	Sprague-Dawley
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
cloro	AirGas, Inc	X02NI99CP163LS1
kit caspasi 3/7	Promega	G8091
Voltohmmetro epiteliale ed elettrodo a bacchetta	World Precision Instruments	EVOM e STX2
Inserti Snapwell	Corning	07-200-708
Filtro cellulare in nylon da 70 micron	Corning	#352360
Camere di biocontenimento in polisulfone	BCU, Allentown Cage Equipment	BCU
DMEM	Life technologies	12491-015
Anticorpo actina sarcomerico	Abcam Cambridge, MA	ab28052
Anticorpo SERCA2	Bioreagenti di affinità, Golden, CO	MA3-9191
Anticorpo Ki-67	Dako, Carpinteria, CA	M7248
Anticorpo secondario coniugato Alexa 488	Invitrogen, Grand Island, NY	A11029
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Carnitina	Sigma-Aldrich	C0283
Taurina	Sigma-Aldrich	T8691
Creatinina	Sigma-Aldrich	C6257
Krebs Ringer Buffer	Sigma-Aldrich	K4002
Proteasi	Sigma-Aldrich	P5147
Collagenasi	Sigma-Aldrich	C6885
DNAasi	Sigma-Aldrich	DN-25
Soluzione di ringer lattato	Abott Laboratories	7953
Siero d'asino	Fisher Scientific	017-000-001
PBS, soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma-Aldrich	D1408
4-15% gel SDS-PAGE	Bio-Rad	456-1083
Membrana nitrocellulosica	Bio-Rad	162-0115
Dergent, Tween	Sigma-Aldrich	P1379
Kit di rilevamento della perossidasi	Pierce	3402
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mezzi di montaggio, Fluormount G	eBiosciences	00-4958-02
Citrato di sodio	Sigma-Aldrich	71497
Collagene	Sigma-Aldrich	C7521
MEM	Sigma-Aldrich	M8028
Laminin	BD biosciences	354259
Penicillina/streptomicina	Life Technologies	15070063
FBS	Gibco	200-6140AJ