Linear Amplificazione Mediata PCR - Localizzazione di Genetica Elementi e caratterizzazione di Unknown Aggirare DNA

Summary

Linear-amplificazione mediata (LAM)-PCR è un metodo sviluppato per identificare le posizioni esatte di integrare vettori virali nel genoma. La tecnica si è evoluta per essere il metodo superiore per studiare la dinamica clonali nei pazienti di terapia genica, biosicurezza delle tecnologie innovative vettore, la diversità delle cellule T, modelli di cellule staminali del cancro, ecc

Abstract

La PCR mediata da amplificazione lineare (LAM-PCR) è stata sviluppata per studiare l'emopoiesi in cellule geneticamente corrette di pazienti trattati con terapia genica con sistemi vettoriali integrativi. Grazie all'integrazione stabile di vettori retrovirali, i siti di integrazione possono essere utilizzati per studiare il destino clonale delle singole cellule e della loro progenie. La LAM-PCR per la prima volta ha fornito la prova che la leucemia nei pazienti trattati con terapia genica ha avuto origine dalla sovraespressione indotta dal provirus di un proto-oncogene vicino. L'elevata sensibilità e specificità della LAM-PCR rispetto ai metodi esistenti come la PCR inversa e la PCR mediata da legatura (LM) è ottenuta mediante una fase iniziale di preamplificazione (PCR lineare di 100 cicli) utilizzando primer specifici per vettori biotinilati che consentono di eseguire successive fasi di reazione sulla fase solida (biglie magnetiche). La LAM-PCR è attualmente il metodo più sensibile disponibile per identificare il DNA sconosciuto che si trova in prossimità del DNA noto. Recentemente, è stata sviluppata una variante della LAM-PCR che elude la restrizione del digest, abrogando così il bias di recupero dei siti di integrazione e consente un'analisi completa delle posizioni dei provirus nei genomi dell'ospite. Il seguente protocollo spiega passo dopo passo l'amplificazione di sequenze 3' e 5' adiacenti al vettore lentivirale integrato.

Introduction

Linear-amplificazione mediata PCR (LAM-PCR) permette di identificare e caratterizzare Sconosciuto DNA fiancheggiante adiacente DNA nota di qualsiasi origine. Più specificamente, LAM-PCR è stato sviluppato per localizzare siti di integrazione vettore virale (IS) all'interno del genoma ospite ^1,2. Elementi genetici come retrovirus o trasposoni integrando il loro genoma nel genoma dell'ospite in un (semi-) modo casuale ^3-6. In molti casi è determinante conoscere esattamente la posizione in cui questi vettori integrati. LAM-PCR ha dimostrato di essere superiore a tecniche alternative come la legatura mediata PCR ⁷ e le sue variant....

Protocol

1. Preparazione dei linker Cassette (LC)

1. Mescolare 40 ml di LC1 oligonucleotide (Tabella 1), 40 ml di LC2 oligonucleotide (Tabella 1, con l'enzima di restrizione adeguato sbalzo), 110 ml di Tris-HCl (100 mM, pH 7,5), e 10 microlitri 250 mM MgCl _2.
2. Incubare a 95 ° C per 5 min e lasciare che la reazione raffreddare lentamente a temperatura ambiente. Aggiungere 300 ml H ₂ O e concentrare dsLinker-DNA su un filtro centrifugazione. Aggiungere 80 ml ​​H ₂ O per l'eluato e aliquote di 10 ml di cassette linker pronti a 0.2 provette per PCR.

2. Prea....

Results

LAM-PCR si traduce in amplificazione del vettore genoma giunzioni con una dimensione frammento definito per ogni incrocio. La dimensione dei singoli frammenti di PCR dipende dalla distanza tra la posizione del DNA noto nel genoma e il sito di riconoscimento dell'enzima di restrizione più vicino. Questo permette di visualizzare la diversità delle giunzioni amplificate in campioni analizzati mediante elettroforesi su gel, per es., Se sono presenti sul gel unico singolo (monoclonali), vari (oligoclonali), o più ba.......

Discussion

La tecnica LAM-PCR permette di identificare sconosciuti sequenze di DNA che fiancheggiano una regione del DNA noto. A causa della elevata sensibilità risultante dalla preamplificazione delle giunzioni con primers specifici ibridazione nella sequenza di DNA nota, è possibile amplificare e rilevare anche giunzioni rare fino al livello di singola cellula. Contrario, in una situazione policlonale LAM-PCR è in grado di amplificare migliaia di differenti giunzioni in una singola reazione.

Tuttavia.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNA polimerasi	Genaxxon Bioscience GmbH	M3001.5000	Alternative Taq Polimerasi possono essere utilizzate
PCR Buffer	Qiagen	201203	Si consiglia l'uso di questo tampone
dNTP-Miscela	Genaxxon Bioscience GmbH	M3015.4020	o qualsiasi altro dNTP
Oligonucleotidi (Primer)	MWG Biotech		HPLC purificato
Dynabeads M-280 Streptavidina	Invitrogen	11206D
PBS	Gibco	14190-086	0,1% in peso/vol BSA
6 M LiCl	Roth	3739,1	10 mM Tris-HCl (pH 7,5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7,5	USB Corporation	22637	o qualsiasi altro fornitore
EDTA	Applichem	A1103,0250	o qualsiasi altro fornitore
Klenow Polymerase	Roche Diagnostics	10104523001
Miscela di esanucleotidi	Roche Diagnostics	11277081001
Restriction endonuclease	NEB		o qualsiasi altro fornitore
Kit	di legatura del DNA Fast-LinkEpicentre Biotechnologies	LK11025
CircLigase ssDNA Ligase Kit	Epicentre Biotechnologies	CL4111K
NaOH	Sigma-Aldrich	72068	o qualsiasi altro fornitore
Agarose LE	Roche Diagnostics	11685660001	o qualsiasi altro fornitore
TBE tampone	Amresco	0658	o qualsiasi altro fornitore
Bromuro di etidio	Applichem	A2273,0005	Il bromuro di etidio è mutageno
100 bp DNA Ladder	Invitrogen	15628-050	o qualsiasi altro DNA ladder
20 mM NaCl	Sigma-Aldrich	71393-1L	o qualsiasi altro fornitore
Magna-Sep Separatore di particelle magnetiche...	Life Technologies	K158501	per l'uso con provette da 1,5 ml
Separatore di particelle magnetiche Magna-Sep	Technologies	K158696	per l'uso con piastre a 96 pozzetti
Amicon Ultra-0.5, membrana Ultracel-30	Millipore	UFC503096
PerfectBlue Gelsystem Midi S	PeqLab	40-1515	o altri sistemi di elettroforesi.
TProfessional 96	Biometra	050-551	o altro Termociclatore per piastre a 96 pozzetti
Agitatore orbitale KS 260 basic	IKA	2980200	o altro agitatore orizzontale
Provette per PCR da 0,2 ml	Biozym Scientific GmbH	711082	o altre provette per PCR da 0,2 ml
Provette da 1,5 ml	Eppendorf	12682	o altre provette da 1,5 ml
Sistema di documentazione su gel	PeqLab		o qualsiasi altro sistema di documentazione su gel
Spettrofotometro Nanodrop ND-1000	Thermo Scientific	ND-1000
Spreadex EL1200 gel prefabbricato	Elchrom Scientific	3497
Apparecchio per elettroforesi su gel sommerso SEA 2000	Elchrom Scientific	2001E
2100 Bioanalizzatore per elettroforesi	Agilent Technologies	G2939AA