Malattia mutazioni che causano in actina possono alterare la funzione del citoscheletro. Dinamica del citoscheletro vengono quantificati attraverso l'imaging di proteine con targhetta modo fluorescente utilizzando totale microscopia a fluorescenza interna. Come esempio, la proteina del citoscheletro, Aip1p, ha modificato la localizzazione e il movimento in cellule esprimenti l'isoforma actina mutante, R256H.
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Articolo metodologico
Aip1p Dynamics sono alterati dalla R256H mutazione in actina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mutazioni in actina causare una serie di malattie umane dovute a cambiamenti molecolari specifici che spesso alterano la funzione del citoscheletro. In questo studio, l'imaging di fluorescenza tagged proteine mediante fluorescenza interna totale (TIRF) microscopio viene utilizzato per visualizzare e quantificare i cambiamenti nelle dinamiche del citoscheletro. Microscopia TIRF e l'uso di tag fluorescenti consente inoltre per la quantificazione dei cambiamenti nelle dinamiche del citoscheletro causata da mutazioni in actina. Usando questa tecnica, quantificazione della funzione del citoscheletro in cellule vive integra pregevolmente studi in vitro della funzione della proteina. Come esempio, mutazioni di senso influenzano il residuo actina R256 sono stati identificati in tre isoforme di actina umani suggerendo questo aminoacido svolge un ruolo importante nelle interazioni regolamentazione. Gli effetti della actina mutazione R256H sui movimenti del citoscheletro sono stati studiati utilizzando il modello di lievito. La proteina, Aip1, che è noto per assistere cofilin in actina depolimerizzazione, eraetichettati con la proteina fluorescente verde (GFP) al N-terminale e tracciati in vivo mediante microscopia TIRF. La velocità di movimento Aip1p sia wild type e mutanti è stata quantificata. Nelle cellule esprimenti mutante R256H actina, Aip1p movimento è limitata e la velocità di movimento è circa la metà della velocità misurata in cellule di tipo selvatico (0,88 ± 0,30 micron / sec in cellule R256H rispetto a 1,60 ± 0,42 micron / sec in cellule di tipo selvatico, p <0.005).
Introduzione
Actina è la proteina dominante comprendente il citoscheletro e partecipa ai processi cellulari critici compresi divisione cellulare, movimento organello, la motilità cellulare, la contrazione e segnalazione. Negli ultimi dieci anni, le mutazioni che causano la malattia di actina sono stati scoperti in ciascuna delle sei isoforme di actina umani che portano a una serie di disturbi, da miopatie a malattia coronarica 1-7. I processi attraverso i quali le mutazioni di actina portano alla malattia continuano ad essere chiariti. Il modello di lievito resta il gold standard per studiare gli effetti biochimici di mutazioni sulla funzione actina causa dei vantaggi ....
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Protocollo
1. Clonazione nella PB1996 plasmidi
- Progettazione e ordinare primer di DNA da un oligonucleotide società di produzione che fiancheggiano la sequenza bersaglio e contenere siti di restrizione unici nel plasmide principale selezionato. NOTA: In questo caso, i primer sono stati progettati per amplificare le 400 coppie di basi all'estremità 5 'della sequenza Aip1. Il sito di restrizione XhoI è stato incorporato nel fondo circa 20 bp prima sequenza Aip1, e XmaI era inclusa circa 20 bp dopo la sequenza bersaglio Aip1. Il plasmide usato per la clonazione era PB1996, che contiene un tag 3XGFP per fluorescenza, un gene URA per la selezione ceppo di lievito,....
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Risultati
Un metodo per immagine dinamica di proteine citoscheletriche nella cellula è presentato. La proteina-actina vincolante, Aip1p, è stato taggato con GFP. Il motivo per il plasmide codificante il prodotto etichettato è mostrato in Figura 1. Il plasmide è stato poi trasformato in cellule di lievito. Espressione dei fluorescente etichettato Aip1p permesso visualizzazione del comportamento proteina nella cellula. Aip1p localizza tipicamente a chiazze actina nei siti di endocitosi 22. Per quantifi.......
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Discussione
Una strategia efficace per visualizzare la dinamica del citoscheletro e l'utilità nelle indagini sulle mutazioni patogene è stato descritto qui. Modalità di imaging avanzate hanno creato nuove opportunità per comprendere il movimento intracellulare di proteine nei pressi della membrana cellulare. Totale microscopia a fluorescenza di riflessione interna (TIRF) è una tecnica sensibile per studi funzionali in cellule viventi. TIRF utilizza un laser di eccitazione angolato che crea un campo evanescente a causa della d.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Peter Rubenstein per una discussione utile e consulenza tecnica e David Pellman per il clone PB1996 originale. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della March of Dimes e finanziamenti dal Ride for Kids.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agarosio | rpi | 9012-36-6 | |
| Blu di bromofenolo | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Kit di mutazione multipla diretta al sito USB | Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, a filamento singolo da testicoli di salmone | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Bromuro di etidio | Invitrogen | 15585-011 | Attenzione! Irritazione dannosa |
| Kit DNA fungino/batterico | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Acetato di litio | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Scala a bassa massa di DNA | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Kit Miniprep | Qiagen | 27106 | Qualsiasi kit funzionerà |
| Kit di legatura rapida | NEB | M2200S | |
| Sodio azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel e PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011-URA | |
| Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Qualsiasi macchina PCR funzionerà |
| Microscopio TIRF | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R fotocamera | Hamamatsu |
Riferimenti
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, e1483 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al.
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Ristampe e permessi
