Questo protocollo descrive la rilevazione qPCR del citomegalovirus in un tessuto bioptico fissato in formalina e incluso in paraffina, che è rapido, sensibile, specifico e utile per interpretare modelli di colorazione equivoci di ematossilina ed eosina o immunoistochimica.
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Articolo metodologico
qPCR è un metodo sensibile e rapido per il rilevamento del DNA Cytomegaloviral in fissato in formalina, incluse in paraffina biopsia
In questo articolo
Sommario
Abstract
E 'fondamentale individuare citomegalovirus (CMV) nel tratto gastrointestinale (GI) dei pazienti immunodepressi, data la loro maggior rischio di sviluppare infezioni gravi. Sono stati sviluppati molti metodi di laboratorio per la rilevazione di infezione da CMV, compresa sierologia, coltura virale, e metodi molecolari. Spesso, questi metodi riflettono coinvolgimento sistemico con CMV e non individuano il coinvolgimento del tessuto locale. Pertanto, il rilevamento di infezione da CMV nel tratto GI è spesso fatto da istologia tradizionale di tessuto bioptico. Ematossilina e eosina (H & E) colorazione in combinato disposto con l'immunoistochimica (IHC) sono rimasti i pilastri di esaminare tali biopsie. H & E e IHC volte provocano atipici (equivoci) pattern di colorazione, rendendo difficile l'interpretazione. E 'stato dimostrato che polymerase chain reaction quantitativa (qPCR) per CMV può correttamente essere eseguita su fissato in formalina, biopsia dei tessuti inclusi in paraffina (FFPE) per moltoalta sensibilità e specificità. L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare come eseguire il test qPCR per la rilevazione di CMV nella biopsia del tessuto FFPE in un ambiente di laboratorio clinico. Questo metodo è probabile che sia di grande beneficio per i pazienti in caso di colorazione equivoca di CMV in biopsie di GI.
Introduzione
Interpretazione del citomegalovirus (CMV) in campioni clinici è estremamente importante. CMV è un membro della sottofamiglia Betaherpesvirinae degli herpesvirus. Analogamente agli altri herpesvirus, CMV ha la capacità di stabilire infezione persistente o latente caratterizzata da una mancanza di replicazione virale attiva 1. La riattivazione del virus può verificarsi durante periodi di stress o di altro immunosoppressione, che porta alla replicazione virale attiva caratterizzata dal rilascio di virioni, che può essere accompagnata da manifestazioni di malattia 2-4. Gastrointestinale (GI) sintomi di malattia CMV spesso includono dolore addominale....
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Protocollo
Con l'approvazione del Institutional Review Board, una ricerca della banca dati laboratorio elettronico è stata effettuata per identificare fissato in formalina, paraffina (FFPE) blocchi che rappresentano casi di citomegalovirus (CMV) in gastrointestinali (GI) biopsie diagnosticati dal istopatologia (ematossilina eosina (H & E) e / o immunoistochimica (IHC)).
1. Tissue Processing da FFPE GI biopsia
- Raccogliere FFPE GI blocchi di tessuto per la biopsia citomegalovirus (CMV) polymerase chain reaction quantitativa (qPCR). Questi blocchi sono conservati a temperatura ambiente.
- Tubi Pre-label 1,7 ml microcentrifuga con....
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Risultati
Un totale di 228 blocchi di tessuto sono stati testati dal quantitativo polymerase chain reaction (qPCR), che comprendeva 91 citomegalovirus (CMV) casi positivi sulla base di istologia ed immunoistochimica positiva (IHC), 18 con equivoca CMV IHC, e 79 controlli negativi. Come illustrato nella figura 2, i casi positivi CMV avrebbero dimostrato tipiche inclusioni CMV virali (A) e / o positivo colorazione IHC (B). Casi dubbi avrebbero dimostrato rare, non classici pattern .......
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Discussione
Molti metodi di laboratorio sono disponibili per la diagnosi di citomegalovirus (CMV), tra cui la sierologia, coltura virale, saggi viremia molecolare, istologia del materiale bioptico, e, come recentemente dimostrato, saggi molecolari di fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) biopsia 5,6 tessuto. Sierologia, una volta che un pilastro della diagnosi, identifica solo in modo affidabile l'esposizione e non si correla bene con acuta infezione da CMV 7. Cultura virale, sia convenzionali .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Riconosciamo Amy Thomasson per la sua assistenza con la preparazione di questo manoscritto, e Fredrik Skarstedt e Ryan Christy per i loro sforzi nella preparazione di figure.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per microfuga da 1,7 ml | Costar | 3620 | |
| Pinze seghettate | Servizi di microscopia elettronica | 62086-1S | Micro Pinze MF-1 |
| Centrifughe da tavolo (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallone |
| Etanolo | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| Microtomo | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Kit di tessuti | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Kit di supplemento | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuga | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Blocco di raffreddamento | Roche | ||
| LightCycler Strumento di Tappatura | Roche | 3357317 | |
| Kit di Compensazione del Colore | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μ l Capillari | Roche | 1 909 339 | |
| Lame | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge a basso profilo |
Riferimenti
- Hodinka, R. L. Manual of Clnical Microbiology. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day ....
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Ristampe e permessi
