Questo protocollo descrive la rilevazione qPCR del citomegalovirus in un tessuto bioptico fissato in formalina e incluso in paraffina, che è rapido, sensibile, specifico e utile per interpretare modelli di colorazione equivoci di ematossilina ed eosina o immunoistochimica.
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Articolo metodologico
qPCR è un metodo sensibile e rapido per il rilevamento del DNA Cytomegaloviral in fissato in formalina, incluse in paraffina biopsia
In questo articolo
Sommario
Abstract
E 'fondamentale individuare citomegalovirus (CMV) nel tratto gastrointestinale (GI) dei pazienti immunodepressi, data la loro maggior rischio di sviluppare infezioni gravi. Sono stati sviluppati molti metodi di laboratorio per la rilevazione di infezione da CMV, compresa sierologia, coltura virale, e metodi molecolari. Spesso, questi metodi riflettono coinvolgimento sistemico con CMV e non individuano il coinvolgimento del tessuto locale. Pertanto, il rilevamento di infezione da CMV nel tratto GI è spesso fatto da istologia tradizionale di tessuto bioptico. Ematossilina e eosina (H & E) colorazione in combinato disposto con l'immunoistochimica (IHC) sono rimasti i pilastri di esaminare tali biopsie. H & E e IHC volte provocano atipici (equivoci) pattern di colorazione, rendendo difficile l'interpretazione. E 'stato dimostrato che polymerase chain reaction quantitativa (qPCR) per CMV può correttamente essere eseguita su fissato in formalina, biopsia dei tessuti inclusi in paraffina (FFPE) per moltoalta sensibilità e specificità. L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare come eseguire il test qPCR per la rilevazione di CMV nella biopsia del tessuto FFPE in un ambiente di laboratorio clinico. Questo metodo è probabile che sia di grande beneficio per i pazienti in caso di colorazione equivoca di CMV in biopsie di GI.
Introduzione
Interpretazione del citomegalovirus (CMV) in campioni clinici è estremamente importante. CMV è un membro della sottofamiglia Betaherpesvirinae degli herpesvirus. Analogamente agli altri herpesvirus, CMV ha la capacità di stabilire infezione persistente o latente caratterizzata da una mancanza di replicazione virale attiva 1. La riattivazione del virus può verificarsi durante periodi di stress o di altro immunosoppressione, che porta alla replicazione virale attiva caratterizzata dal rilascio di virioni, che può essere accompagnata da manifestazioni di malattia 2-4. Gastrointestinale (GI) sintomi di malattia CMV spesso includono dolore addominale e / o feci sanguinolente 1.
La diagnosi di CMV gastroenterite da istologia utilizza ematossilina ed eosina (H & E) per identificare inclusioni virali CMV. Nei casi in cui è alta ancora presenti inclusioni evidenti si osservano sospetto clinico, immunoistochimica (IHC) è spesso utilizzato come metodo di prova aggiunto. Tuttavia, IHCpuò anche essere ostacolata da figuranti pattern di colorazione cellulare non classici rare (equivoci), rendendo difficile interpretazione (Figura 2) 5. Si è cercato di utilizzare il DNA estratto da fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) tessuti GI biopsia e quantitativa reazione a catena della polimerasi (qPCR) per rilevare CMV in biopsie di GI. Questa tecnica ha dimostrato di essere utile nel rilevamento di CMV in biopsie GI, ed è particolarmente utile in casi di colorazione IHC equivoci 5,6. Inoltre, qPCR ha anche dimostrato di correlare bene con l'aggiunta di dati di test clinici CMV quando è disponibile 6. L'uso di qPCR nel rilevare CMV può portare a diagnosi precoce e il trattamento in caso di sospetto clinico per CMV è alto, ma H & E e CMV IHC sono negativi.
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Protocollo
Con l'approvazione del Institutional Review Board, una ricerca della banca dati laboratorio elettronico è stata effettuata per identificare fissato in formalina, paraffina (FFPE) blocchi che rappresentano casi di citomegalovirus (CMV) in gastrointestinali (GI) biopsie diagnosticati dal istopatologia (ematossilina eosina (H & E) e / o immunoistochimica (IHC)).
1. Tissue Processing da FFPE GI biopsia
- Raccogliere FFPE GI blocchi di tessuto per la biopsia citomegalovirus (CMV) polymerase chain reaction quantitativa (qPCR). Questi blocchi sono conservati a temperatura ambiente.
- Tubi Pre-label 1,7 ml microcentrifuga con il numero di identificazione univoco del blocco.
- Bloccare il volantino microtomo.
- Ospitare il blocco di tessuto nel morsetto.
- Utilizzando una lama inutilizzato fresco, allineare il blocco all'angolo coltello sul microtomo.
- Regolare il microtomo per tagliare 10 sezioni micron di spessore.
- Sblocca the volantino e avanzare il blocco verso la lama.
- Tagliare 5 sezioni del blocco a 10 micron intervalli di spessore, permettendo ogni taglio di rotolare in un rotolo di tessuto. Assicurarsi che ogni rotolo contiene una rappresentazione adeguata dei tessuti bioptici desiderati.
- Bloccare il volantino microtomo.
- Con una pinza, posizionare tutti e 5 i rotoli di tessuto in provetta da centrifuga pre-etichettati, facendo attenzione a solo manipolare il rotolo dalla paraffina, al fine di ridurre il potenziale di contaminazione incrociata. Far scattare il tappo sul tubo e rimetterlo sul rack.
- Rimuovere il blocco di tessuto dal microtomo.
- Rimuovere e gettare la lama.
- Decontaminare le superfici o strumenti che possano essere venuti a contatto con il tessuto precedente.
- Inserire una lama inutilizzato fresche nella porta coltello.
- Ripetere i passaggi 1,4-1,14 per ogni blocco aggiuntivo da elaborare. I tubi microcentrifuga contenenti i rotoli di tessuto possono essere conservati a temperatura ambiente fino a quando la time di estrazione del DNA.
2. Estrazione DNA da Rotoli di FFPE GI biopsia
NOTA: Questo protocollo è tratto dal foglietto illustrativo del tessuto kit FFPE DNA di estrazione (ATTENZIONE: fare riferimento alla Scheda Dati di Sicurezza (SDS)).
- Aggiungere 1 ml di xilene (ATTENZIONE: fare riferimento alla scheda di sicurezza) ad ogni provetta per microcentrifuga campione. Chiudere il coperchio e mescolare vigorosamente nel vortex per 10 secondi.
- Procedere con l'estrazione del DNA come specificamente indicato nel foglio illustrativo del produttore con le seguenti modifiche.
- Primo aggiungere 6 ml di controllo interno (IC) ad ogni provetta per microcentrifuga.
- A seguito della ATL / proteinasi K lisi incubazione a 56 ° C per 1 ora, incubare a 99 ° C per 30 min, anziché 90 ° C per 1 ora.
- Durante l'ultima fase di eluizione del DNA, aprire con cautela il coperchio della colonna di purificazione del DNA e applicare 50 microlitri di acqua DNasi / RNasi-free distillata al centro della membrana, anziché buffer ATE.
NOTA: Consultare il foglietto illustrativo per la conservazione e preparazione dei reagenti appropriati. DNA deve essere estratto da tutti e 5 i rotoli FFPE. Eseguire tutte le fasi di centrifugazione a temperatura ambiente (15-25 ° C).
3. QPCR per CMV
- Polymerase Chain Reaction (PCR) Procedimento
- Generare un foglio di lavoro di Excel PCR per la sessione d'analisi CMV. Questo foglio di lavoro Excel calcola la quantità totale di ogni reagente necessario per rendere il master mix con Mg. Si moltiplica la quantità di ogni reagente necessario per campione (elencati di seguito) volte il numero di campioni e controlli più uno (per compensare la perdita a causa di pipettaggio).
- Comprendono i seguenti reagenti in ciascuna reazione PCR nella quantità indicata:
Reagente0; Importo per campione
CMV LC master mix fiala 12,5 ml
Mg soluzione giallo fiala 2,5 ml
Volume totale 15.0 ml
- Comprendono i seguenti reagenti in ciascuna reazione PCR nella quantità indicata:
- Includere in ogni test, eseguire un acqua o nessun controllo di destinazione (NTC), controllo negativo, un controllo basso positivo, un alto controllo positivo, e sia QS3 o QS4, e tutti i campioni dei pazienti. I capillari devono essere impostati in questo ordine.
- Ottenere il blocco di raffreddamento specifico per lo strumento PCR in tempo reale che viene conservata a 4 ° C. Posizionare i tubi capillari appropriate nel blocco di raffreddamento. Non toccare la superficie dei capillari. Utilizzare sempre guanti quando si maneggiano i capillari.
- Impostare tutte le reazioni a catena della polimerasi in una cappa pulita, non inquinata con l'amplificazione produzionets.
- Rimuovere il corretto numero di flaconcini di maestri del kit PCR per testare tutti i campioni dei pazienti, più 5 controlli. Lasciate che i flaconi master, soluzione Mg e PCR grado disgelo dell'acqua nel blocco di raffreddamento. Ogni flaconcino master contiene reagenti sufficienti per 12 test.
- Vortice delicatamente le fiale di master e rapido li girare nella centrifuga alla massima velocità.
- Unire il contenuto di ciascun flacone maestro in un flaconcino, e agitare delicatamente di nuovo.
- Unire il master mix e la soluzione Mg nelle quantità indicate nel foglio di lavoro PCR in un unico tubo microcentrifuga sterile.
- Mescolare delicatamente e un'aliquota di 15 ml di master mix con Mg in ogni provetta capillare, tranne il capillare in posizione 5, che è per lo standard di quantificazione (QS).
- Spostare il blocco di raffreddamento contenente i capillari e le master mix con Mg dalla cappa pulita ad una cappa di elaborazione.
- Aggiungere 2 ml di controllo interno (IC) per i rimanenti 30 ml di maestromescolare con Mg. Mescolare delicatamente e aliquota 15 microlitri nel capillare in posizione 5 (posizione per il QS).
- Pipettare 10 ml di acqua, controllano il DNA, o DNA campione nel tubo capillare appropriata. Tappare le provette capillari utilizzando lo strumento di tappatura.
- Prendere raffreddamento blocco / campioni allo strumento PCR real-time.
- Generare un foglio di lavoro di Excel PCR per la sessione d'analisi CMV. Questo foglio di lavoro Excel calcola la quantità totale di ogni reagente necessario per rendere il master mix con Mg. Si moltiplica la quantità di ogni reagente necessario per campione (elencati di seguito) volte il numero di campioni e controlli più uno (per compensare la perdita a causa di pipettaggio).
- Programmare il real-time PCR Instrument (cfr. tabella 1)
- Amplificazione e la rilevazione eseguite sullo strumento PCR real-time
- Accedere al computer
- Fare doppio clic sull'icona dello strumento e accedere al software.
- Accendere lo strumento PCR real-time
- Clicca su "CMV / EBV" dallo schermo anteriore.
- Seguire le istruzioni della procedura guidata macro.
- Selezionare la casella per eseguire un auto-test quando richiesto dal software. Un self-test deve essere eseguito una volta al giorno lo strumento è in uso.
- Assegnare un nome alla corsa.
- Regolare il conteggio del campione si trova nella LEF superioret angolo della pagina per la somma di controlli e pazienti inclusi nella corsa e inserire il numero identificativo di ogni campione del paziente.
- Fare clic sulla scheda "Abs Quant".
- In "Tipo di campione", assegnare il tipo di campione appropriato per lo standard.
- Digitare le concentrazioni previste per lo standard di quantificazione (QS).
- Rimuovere i tubi capillari sul blocco di raffreddamento e metterli nella posizione corrispondente nella giostra (raffreddamento blocco campioni # 1 deve essere posto in posizione # 1 sulla giostra, ecc).
- Posizionare la giostra in centrifuga e premere start dello strumento.
- Aprire centrifuga e rimuovere la giostra.
- Posizionare la giostra nello strumento PCR real-time. Chiudere il coperchio.
- Premere il tasto "Start Esegui".
- Lo strumento PCR real-time controllerà ogni posizione per un campione. Non a piedi dallo strumento fino a quando questo controllo è stato completato, specialmentecialmente se uno dei capillari non è nel carosello. Lo strumento di notare che questo e chiedere se la corsa deve essere continuato. Rispondere di sì prima di partire.
- Una volta che la corsa è completa, chiudere il report che è stato generato.
- Clicca su "Absolute Quantitation".
- Fare clic sulla freccia accanto a Colore compensazione.
- Fare clic su "Select compensazione del colore" dalla casella a discesa.
- Scegliere il file di compensazione colore più attuale da applicare alla corsa.
- Fare clic su OK quando la finestra si apre.
- Fare clic sulla freccia curva standard.
- Selezionare "uso esterno" dal menu a discesa.
- Selezionare più file corrente curva standard esterno, quindi fare clic su OK.
- Guardate ogni curva sotto il menu Assoluto Quantificazione per garantire che le curve siano presenti e non linea piatta, se la concentrazione è assegnato. L'Assoluto quantificazione del 705/Back 530 viene analizzata automaticamente.
- Qucontrollo nalità
- Genera una nuova curva standard ogni volta che viene ricevuto un numero nuovo lotto di reagenti, o ogni sei mesi, a seconda di quale è più frequente.
- Aggiungere 10 ml di ogni standard al master mix con Mg. Considerate le norme incluse nel kit come DNA precedentemente estratto.
- Aggiungere 1 ml di controllo interno per ogni standard al master mix con Mg utilizzati per generare la curva standard per assicurare quantificazione accurata. Non aggiungere IC al master mix con Mg per il Control Template No (NTC).
- Preparare un NTC e tre repliche di quantificazione Standards QS 4, 3, 2, 1, e una diluizione 1:10 del QS4 per la corsa per generare la curva standard, pari a 16 punti dati.
- Selezionare "replica di" nel menu a tendina per gli standard ripetute
- Scegli canale 530/back nessuno e attivare compensazione del colore quando si analizza la corsa,
- In "Curva Standard (In Run)", selezionare "salva con nome exinterna "e il nome della curva. Inserisci il commento "applicato come curva standard" per il salvataggio.
- Rappresentare graficamente i risultati. Il coefficiente di linearità risultante deve essere ≥ 0,81.
- Per le corse giornaliere, includere una copia del QS3 o QS4 come controllo nella corsa. L'attuale curva standard esterna può essere importato in corsa durante la fase di analisi.
- Esegui controlli: nessun controllo del DNA, di controllo negativo, bassi e alti controlli positivi. Carica virale atteso è determinato e regolato per ogni fornitore e numero di lotto.
- Aggiungere un IC a ciascun campione e controllo durante l'estrazione del DNA.
- Se uno qualsiasi dei controlli cadono fuori portata, registrare i risultati inaccettabili e di sottoporre il test per la risoluzione dei problemi.
- Frequenza dei controlli
- Includere in ogni corsa: un NTC, alto positivo, e standard di controllo positivo negativo, basso.
NOTA: i limiti accettabili per i controlli. Nessun picchi dovrebbero essere osservared per il modello no (NTC) e controlli negativi. Peaks dovrebbero essere presenti nel canale 530 e carica virale attesi sono determinati e adeguati per ogni fornitore e il numero di lotto per i controlli positivi alte e basse.
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Risultati
Un totale di 228 blocchi di tessuto sono stati testati dal quantitativo polymerase chain reaction (qPCR), che comprendeva 91 citomegalovirus (CMV) casi positivi sulla base di istologia ed immunoistochimica positiva (IHC), 18 con equivoca CMV IHC, e 79 controlli negativi. Come illustrato nella figura 2, i casi positivi CMV avrebbero dimostrato tipiche inclusioni CMV virali (A) e / o positivo colorazione IHC (B). Casi dubbi avrebbero dimostrato rare, non classici pattern ...
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Discussione
Molti metodi di laboratorio sono disponibili per la diagnosi di citomegalovirus (CMV), tra cui la sierologia, coltura virale, saggi viremia molecolare, istologia del materiale bioptico, e, come recentemente dimostrato, saggi molecolari di fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) biopsia 5,6 tessuto. Sierologia, una volta che un pilastro della diagnosi, identifica solo in modo affidabile l'esposizione e non si correla bene con acuta infezione da CMV 7. Cultura virale, sia convenzionali ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Riconosciamo Amy Thomasson per la sua assistenza con la preparazione di questo manoscritto, e Fredrik Skarstedt e Ryan Christy per i loro sforzi nella preparazione di figure.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per microfuga da 1,7 ml | Costar | 3620 | |
| Pinze seghettate | Servizi di microscopia elettronica | 62086-1S | Micro Pinze MF-1 |
| Centrifughe da tavolo (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallone |
| Etanolo | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| Microtomo | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Kit di tessuti | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Kit di supplemento | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuga | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Blocco di raffreddamento | Roche | ||
| LightCycler Strumento di Tappatura | Roche | 3357317 | |
| Kit di Compensazione del Colore | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μ l Capillari | Roche | 1 909 339 | |
| Lame | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge a basso profilo |
Riferimenti
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