La stimolazione dei citoplasmatici DNA Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Sommario

L'obiettivo del protocollo è quello di utilizzare metodi ottimali per stimolare i percorsi citoplasmatici rilevamento del DNA in cellule e in vivo. Questo risultato è ottenuto migliorando la generazione di lunga, il DNA a doppio filamento durante blunt-end legatura. Le cellule o topi sono poi transfettate con un reagente di trasfezione lipidico.

Abstract

Al fine di stimolare efficacemente una risposta immunitaria innata, il DNA deve essere di lunghezza e purezza sufficiente. Vi presentiamo un metodo in cui DNA a doppia elica (dsDNA), che ha le caratteristiche necessarie per stimolare il DNA citoplasmatico percorsi di rilevamento possono essere generati a basso costo e con facilità. Con la concatemerization di brevi oligonucleotidi sintetici (che manca motivi CpG), dsDNA possono essere generati per essere di lunghezza sufficiente per attivare il rilevamento del DNA citosolico percorso. Questo protocollo prevede la legatura punta smussata degli oligonucleotidi in presenza di polietilene glicole (PEG), che fornisce un ambiente per la legatura efficiente a verificarsi. Le concatemers dsDNA possono essere utilizzati, a seguito purificazione per estrazione con fenolo / cloroformio, per simulare la risposta immunitaria innata in vitro da protocolli di trasfezione standard. Questo DNA può anche essere utilizzato per stimolare l'immunità innata in vivo mediante iniezione intradermica nel padiglione auricolare di un mouse, per esempio. Dastandardizzare il processo concatemerization e protocolli di stimolazione successivi, l'attivazione affidabile e riproducibile del sistema immunitario innato può essere prodotta.

Introduzione

Il DNA è una componente vitale di tutti gli organismi e le cellule eucarioti, che mantengono in compartimenti specifici. Una funzione del sistema immunitario innato è quello di individuare quando tale compartimentazione si rompe o quando il materiale estraneo viene introdotto nell'organismo attraverso una violazione delle barriere fisiche, esterni. Nel corpo umano ci sono una serie di proteine ​​che esistono per aiutare a degradare piccole quantità di DNA che possono sfuggire alla compartimentazione corretta; DNAsi I, II, e III abbattere DNA nel plasma, endosome, e citosol, rispettivamente. Tuttavia, è stato dimostrato che i topi privi DNAse II muoiono d....

Protocollo

1 Concatemerization

1. Risospendere primer Fw e Rv (vedere Tabella dei materiali per le sequenze dei primer) ad una concentrazione di 10 mg / mL in biologia molecolare di grado H ₂ O. Poi, mescolare 5 ml di Fw e 5 ml di Rv innesco in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
2. Miscela di primer Anneal mediante riscaldamento alla temperatura di ricottura corretta (75 ° C per i primers descritti) per 15 min. Lasciare in panchina per raffreddare a temperatura ambiente (RT). Preparare la PEG8000 del 60% durante questo incubazione sciogliendo in DDH ₂ O.
3. Aggiungere 50 ml di 60% PEG8000 (per ottenere una concentrazione finale d....

Risultati

I risultati seguenti indicano che il DNA concatemerized può essere generato con relativa facilità ed è in grado di stimolare una risposta immunitaria innata robusta nelle cellule e nei topi. Con l'uso di PEG8000, si vede chiaramente che la lunghezza del DNA generato è significativamente più lungo e ugualmente in grado di indurre la trascrizione di CXCL10. Come si vede dalle analisi su gel di agarosio, il concatemerization standard ha lunghezze di DNA di 800 paia di basi (bp), mentre per il campione con PEG8000.......

Discussione

I protocolli qui descritti sono utilizzati per generare dsDNA per stimolare la risposta immunitaria innata citosolico con risultati riproducibili in una vasta gamma di tipi cellulari che in vivo. Poiché il principale reagente substrato utilizzato è un oligonucleotide sintetico, vi è la flessibilità in questo sistema per l'utilizzo di sequenze di DNA alternative o modificazioni chimiche. E 'possibile, per esempio, per sostituire l'oligonucleotide filo avanti descritto in questo protocollo con uno che.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Primer diretto	Integrated DNA Technologies	n/a	TACAGATCTACTAGTGATCTATGA CTGATCTGTACATGATCTACA
Primer inverso	Tecnologie del DNA integrate	n/a	TGTAGATCATGTACAGATCAGT CATAGATCACTAGTAGATCTGTA
PEG8000	Sigma-Aldrich	P-4463
Acqua di grado di biologia molecolare	Sigma-Aldrich	W4502-1L
T4 polinucleotide chinasi	Promega	M4101
T4 DNA ligasi	Promega	M1801
Fenolo: cloroformio	Fisher Chemical	BPE1752p-400
Cloroformio	Fisher Chemical	C/4960/PB08
Etanolo	Sigma-Aldrich	32221-2.5L
tampone di caricamento del gel DNA	New England Biolabs	B7021S
Agarosio	Bioline	BIO-41025
Optimem	Life Technologies	11058021
TransIT-LT1	Mirus Bioscience	MIR 2300
Siringa	Hamilton Hamilton	80901 Modello 1705
30 G aghi	BD Bioscience	304000
SYBR Colorazione gel DNA sicura	Life Technologies	S33102
Rneasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134
Oligo (dT) primer	Thermo Scientific	SO131
dNTP mix	Fermentas	R0192
Super Script III trascrittasi inversa	Life Technologies	56575
Tampone di sintesi del cDNA del primo filamento	Life Technologies	y02321
SybrGreen qPCR Master mix veloce	Applied Biosystems	4385612
cxcl10 primer diretto murino	Integrated DNA Technologies	n/a	ACTGCATCCATATCGATGAC
cxcl10 primer inverso murino	Tecnologie del DNA integrate	n/a	TTCATCGTGGCAATGATCTC
il6 primer diretto murino	Integrated DNA Technologies	n/a	GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC
il6 primer diretto murino	Integrated DNA Technologies	n/a	GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC