La stimolazione dei citoplasmatici DNA Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Sommario

L'obiettivo del protocollo è quello di utilizzare metodi ottimali per stimolare i percorsi citoplasmatici rilevamento del DNA in cellule e in vivo. Questo risultato è ottenuto migliorando la generazione di lunga, il DNA a doppio filamento durante blunt-end legatura. Le cellule o topi sono poi transfettate con un reagente di trasfezione lipidico.

Abstract

Al fine di stimolare efficacemente una risposta immunitaria innata, il DNA deve essere di lunghezza e purezza sufficiente. Vi presentiamo un metodo in cui DNA a doppia elica (dsDNA), che ha le caratteristiche necessarie per stimolare il DNA citoplasmatico percorsi di rilevamento possono essere generati a basso costo e con facilità. Con la concatemerization di brevi oligonucleotidi sintetici (che manca motivi CpG), dsDNA possono essere generati per essere di lunghezza sufficiente per attivare il rilevamento del DNA citosolico percorso. Questo protocollo prevede la legatura punta smussata degli oligonucleotidi in presenza di polietilene glicole (PEG), che fornisce un ambiente per la legatura efficiente a verificarsi. Le concatemers dsDNA possono essere utilizzati, a seguito purificazione per estrazione con fenolo / cloroformio, per simulare la risposta immunitaria innata in vitro da protocolli di trasfezione standard. Questo DNA può anche essere utilizzato per stimolare l'immunità innata in vivo mediante iniezione intradermica nel padiglione auricolare di un mouse, per esempio. Dastandardizzare il processo concatemerization e protocolli di stimolazione successivi, l'attivazione affidabile e riproducibile del sistema immunitario innato può essere prodotta.

Introduzione

Il DNA è una componente vitale di tutti gli organismi e le cellule eucarioti, che mantengono in compartimenti specifici. Una funzione del sistema immunitario innato è quello di individuare quando tale compartimentazione si rompe o quando il materiale estraneo viene introdotto nell'organismo attraverso una violazione delle barriere fisiche, esterni. Nel corpo umano ci sono una serie di proteine ​​che esistono per aiutare a degradare piccole quantità di DNA che possono sfuggire alla compartimentazione corretta; DNAsi I, II, e III abbattere DNA nel plasma, endosome, e citosol, rispettivamente. Tuttavia, è stato dimostrato che i topi privi DNAse II muoiono da grave anemia causata da eccessiva produzione di interferoni ¹ suggeriscono che il sistema immunitario innato risponde a DNA extra-nucleare. Questa risposta si verifica anche nei topi, che sono del tutto carenti di capacità di segnalazione dei recettori toll-like. Numerosi studi hanno ormai dimostrato che stimolatore dei geni interferone (STING) ² e-TANK vincolante chinasi 1 (TBK1) ³ sono coinvolti nella rilevazione del DNA nel citoplasma e che questa via di segnalazione attiva interferon fattore di regolazione (IRF) -3 ^4. La successiva trascrizione IRF3-dipendente di citochine, chemochine, e geni interferone è caratteristico di una risposta immunitaria innata, o un agente patogeno o di pericolo associato modello molecolare (PAMP o umido) ^5.

Il desiderio di studiare intracellulari nucleici percorsi di rilevamento acido ha portato alla necessità di sviluppare metodi affidabili e riproducibili per stimolare le cellule con l'introduzione di DNA o RNA nelle cellule senza attivare altre risposte immunitarie innate. Un metodo con cui il STING / TBK1 / IRF3 percorso possono essere stimolati sia utilizzando cationici reagenti di trasfezione lipidico per fornire acido nucleico nel citoplasma, dove si può accedere da sensori di DNA come il DNA-PK, IFI16, e CGAs ^6-8.

Le caratteristiche del DNA che sono attualmente compresi per consentire effl'attivazione icient della risposta immunitaria innata citoplasmatica senza stimolazione di altre vie sono la sua lunghezza, massa, la purezza, e la mancanza di CpG motivi ^4,7,9. Oligonucleotidi sintetici sono altamente adatti allo scopo di generare una risposta immunitaria innata quanto permettono la sequenza di DNA di ottimizzare e preparato come una specie chimica pura. Un immuno-stimolante DNA (ISD) sequenza di 45 coppie di basi è stato identificato da Stetson et al. ⁴ come un adeguato, sequenza CpG-libero per questo scopo. Questa sequenza dsDNA è altrimenti casuale e non ha caratteristiche specifiche di là della sua mancanza di motivi CpG. Abbiamo trovato che concatemerizing l'oligonucleotide DSI in fili significativamente più lunghi aumenta l'ampiezza della stimolazione ^7. Generazione di ISD concatemerized è quindi utile per stimolare una risposta immunitaria innata citoplasmatica. Qui vi presentiamo i protocolli per la preparazione di questo reagente e come può essere utilizzato per attivare il percorso di rilevamento del DNA invitro e in vivo.

NOTA: Tutti gli studi sugli animali vengono eseguiti secondo protocolli istituzionali approvate e linee guida per la cura degli animali.

Protocollo

1 Concatemerization

1. Risospendere primer Fw e Rv (vedere Tabella dei materiali per le sequenze dei primer) ad una concentrazione di 10 mg / mL in biologia molecolare di grado H ₂ O. Poi, mescolare 5 ml di Fw e 5 ml di Rv innesco in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
2. Miscela di primer Anneal mediante riscaldamento alla temperatura di ricottura corretta (75 ° C per i primers descritti) per 15 min. Lasciare in panchina per raffreddare a temperatura ambiente (RT). Preparare la PEG8000 del 60% durante questo incubazione sciogliendo in DDH ₂ O.
3. Aggiungere 50 ml di 60% PEG8000 (per ottenere una concentrazione finale del 30%), 10 ml di 10x polinucleotide chinasi (PNK) di buffer, 27 ml di H ₂ O, e 3 ml di PNK alla miscela di primer. Incubare a 37 ° C per 2 ore.
4. Raffreddare a temperatura ambiente e aggiungere 11 ml di tampone di DNA ligasi. Quindi aggiungere 3 U di DNA ligasi e incubare a 37 ° C durante la notte.

2. DNA Purificatione analisi

1. Aggiungere 300 ml di H ₂ O per aumentare il volume del mix legatura. Nota: Procedere in una cappa aspirante a causa della tossicità del fenolo: vapori di cloroformio.
2. Aggiungere 1 volume (400 ml) di fenolo: cloroformio e mescolare agitando energicamente.
3. Centrifugare alla massima velocità per 1 minuto in una microcentrifuga da tavolo. Gli strati acquosi e solventi separerà con lo strato acquoso sulla parte superiore e uno strato bianco di proteina precipitata tra i due strati.
4. Trasferimento strato superiore in una nuova provetta da un'attenta pipettaggio (evitare di trasferire centrale, strato bianco)
5. Ripetere i punti 2.2 e 2.3 almeno due volte o fino a quando non vi è alcuna proteina precipitata dopo la centrifugazione.
6. Aggiungere 1 volume (400 ml) di cloroformio e ripetere i passaggi 2,3-2,4.
7. Aggiungere 2 volumi (800 microlitri) di etanolo al 100% prechilled e incubare a -20 ° C per almeno 1 ora o durante la notte. NOTA: questo passaggio precipita le concatemers DNA.
8. Spin down alla massima velocità e aspirare supernatant. Lavare una volta con l'aggiunta di 1 ml di etanolo al 70% e lasciare asciugare in cappa.
9. DNA Risospendere in 50 ml di endotossina DDH ₂ O. libero Nota: L'uso di reagenti endotossina libera è fondamentale per generare una risposta immunitaria innata specifica-DNA in cellule e in vivo.
10. Rimuovere un'aliquota 2 microlitri di DNA concatemerized in una nuova provetta e aggiungere 1 ml di tampone del gel del DNA di carico.
11. Sciogliere 1% agarosio in tampone TAE mediante riscaldamento alla massima potenza in un forno a microonde per 2 min (o tempo adeguato alla potenza del forno e volume).
12. Versare il gel in Impianto di colata, aggiungere 4 ml di colorante fluorescente chelante DNA, inserire un pettine, e lasciare a temperatura ambiente per circa 20 minuti per il gel per impostare.
13. Una volta impostato, rimuovere il gel pettine e posto nel serbatoio elettroforesi contenente tampone TAE. Carico 3 ml di campione di DNA o di dimensioni marcatori nei pozzetti.
14. Eseguire l'elettroforesi su gel per 30-40 min a 90 V con corrente costante. Visualize il DNA sotto luce ultravioletta per osservare concatemerization (Figura 1A).
15. Misurare la concentrazione di DNA nel resto del campione mediante spettroscopia assorbanza UV. Blank lo spettrometro con la stessa DDH ₂ O che è stato utilizzato per risospendere il DNA e misurare lo spettro di assorbanza 200-300 nm. NOTA: la concentrazione di DNA può essere calcolata utilizzando la legge di Beer-Lambert, A = e * c * l, dove A è l'assorbanza, via e il coefficiente di estinzione, e l la distanza del percorso della luce. Per misurare le concentrazioni di DNA l'assorbanza a 260 nm dovrebbe essere misurato e un coefficiente di estinzione di 0,027 (mg / ml) ^-1 cm ^-1 utilizzato. La luce distanza percorso, l, varierà a seconda dello spettrofotometro. Durante la misurazione della concentrazione, prendere nota del rapporto di assorbanza 260/280 nm come un'indicazione di purezza del DNA; è raccomandato un valore per questo rapporto di cui sopra 2.00.

3. trasfezione di dsDNA Concatemers in vitro

1. Cellule seme in un piatto di coltura di tessuti o piastra per essere il 70% confluenti al momento della stimolazione.
2. Calcolare la massa di DNA necessario per la stimolazione delle cellule utilizzando una concentrazione finale di 1-10 mg / ml. La massa necessaria di DNA noterà come X sotto. Per esempio se stimolando le cellule in un singolo pozzetto di una piastra da 6 pozzetti con 2 ml di terreno ad una concentrazione di DNA su 5 mcg / ml poi una massa di 2 * 5 = 10 mg di DNA è necessaria.
3. Aggiungere 50 * X ml di mezzo privo di siero in una provetta sterile di dimensioni adatte. Pipettare accuratamente nel centro del mezzo, senza toccare il lato del tubo, 2 * X microlitri di lipidi cationici reagente di trasfezione e lasciar riposare per 5 min.
4. Aggiungere X mg di DNA brevemente tubo e vortex. Lasciare a temperatura ambiente per almeno 20 min. Per la trasfezione in vitro aggiungere questa miscela direttamente alle cellule per stimolare citoplasmatici percorsi di rilevamento del DNA.

4 trasfezione di dsDNA Concatemers In Vivo

1. Preparare la miscela di trasfezione come descritto nella 3,1-3,5 con 1 mg di DNA, 2 ml di reagente di trasfezione lipidico, e 18 microlitri di siero medio gratuito per orecchio mouse per essere stimolato. Preparare una sterile 20 ml siringa Hamilton, tappo con una sterile 30 G aghi, e caricare con la miscela di trasfezione del DNA.
2. Anestetizzare un C57BL / 6 del mouse utilizzando 1-2% isoflurano. Confermare l'anestesia da perdita di movimento e frequenza respiratoria costante e da un pizzico reflex test, se necessario. Monitorare gli occhi dell'animale durante l'anestesia e utilizzare unguento come richiesto per evitare eccessiva secchezza.
3. Usando una tecnica sterile, iniettare con cura nel padiglione auricolare 10 ml di miscela di trasfezione in modo che un singolo 'bolla' di liquido è formato tra gli strati dermici dell'orecchio. Nota: Utilizzare un ditale in gomma sul pollice o indice, tendere l'orecchio su di esso, e iniettare ad angolo acuto al fine di garantire l'ago penetra solo il primo strato di pelle del padiglione auricolare.
4. Reindurre il mouse indietro nella gabbia e monitorare regolarmente recupero post-anestetico. Utilizzare una lampada di riscaldamento per evitare un eccessivo raffreddamento dei topi anestetizzati. Non lasciare incustoditi i topi prima di aver ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
5. Flash congelare l'intero padiglione auricolare in una provetta da microcentrifuga da immersione in azoto liquido per 2 min.

5. Trattamento delle stimolato DNA campioni e analisi mediante PCR quantitativa (qPCR)

1. Dalla coltura cellulare: medio aspirato con una pipetta e scartare rifiuti.
2. Aggiungere 1 ml di PBS sterile. Ripetere 5.1 e 5.2 due volte e passare al punto 5.3
3. Dal tessuto orecchio: macinare il tessuto sotto azoto liquido utilizzando pestello in ceramica sterili e malta, il trasferimento di tessuto a terra in una provetta con una spatola sterile, e passare al punto 5.4
4. Aggiungere 350 microlitri tampone di lisi e procedere con l'RNA commerciale protocollo kit di estrazione. Eluire RNA dall'estrazione kit di purificazionecolonna 40 microlitri DDH ₂ O. Nota: il kit di estrazione di RNA commerciale (vedi materiali / attrezzature da tavola) funziona molto bene; altre tecniche sono state testate con risultati scadente.
5. Quantificare RNA mediante spettroscopia UV come descritto per il DNA in precedenza (punto 2.13). Nota: il coefficiente di estinzione per l'RNA è 0,025 (mg / ml) ^-1 cm ^-1.
6. Aggiungere a una sterile PCR tubo 1 ml di oligo (dT) primer, 1 ul di dNTP 10 mM mix, e 250 mg di RNA. Portare al volume di 11 microlitri con DDH ₂ O. sterile
7. Incubare per 5 minuti a 65 ° C. Quindi aggiungere 4 ml First Strand Buffer, 1 ml 0.1 M ditiotreitolo, 0,25 ml trascrittasi inversa e 1,75 ml DDH ₂ O al tubo. Incubare a 50 ° C per 1 ora seguito da 72 ° C per 15 min. In alternativa, diluire il cDNA prodotto 1: 5 con DDH ₂ O.
8. Per la PCR quantitativa uso 2 microlitri di cDNA, 2 ml DDH ₂ O, 5 microlitri qPCR master mix, e 1ml ciascuna di 10 uM avanti e indietro le scorte di primer per amplificare gene (s) di scelta. Mescolare in una piastra a 96 pozzetti e analizzare utilizzando una macchina di PCR quantitativa (Figure 1B e 1C).

Risultati

I risultati seguenti indicano che il DNA concatemerized può essere generato con relativa facilità ed è in grado di stimolare una risposta immunitaria innata robusta nelle cellule e nei topi. Con l'uso di PEG8000, si vede chiaramente che la lunghezza del DNA generato è significativamente più lungo e ugualmente in grado di indurre la trascrizione di CXCL10. Come si vede dalle analisi su gel di agarosio, il concatemerization standard ha lunghezze di DNA di 800 paia di basi (bp), mentre per il campione con PEG8000...

Discussione

I protocolli qui descritti sono utilizzati per generare dsDNA per stimolare la risposta immunitaria innata citosolico con risultati riproducibili in una vasta gamma di tipi cellulari che in vivo. Poiché il principale reagente substrato utilizzato è un oligonucleotide sintetico, vi è la flessibilità in questo sistema per l'utilizzo di sequenze di DNA alternative o modificazioni chimiche. E 'possibile, per esempio, per sostituire l'oligonucleotide filo avanti descritto in questo protocollo con uno che...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Primer diretto	Integrated DNA Technologies	n/a	TACAGATCTACTAGTGATCTATGA CTGATCTGTACATGATCTACA
Primer inverso	Tecnologie del DNA integrate	n/a	TGTAGATCATGTACAGATCAGT CATAGATCACTAGTAGATCTGTA
PEG8000	Sigma-Aldrich	P-4463
Acqua di grado di biologia molecolare	Sigma-Aldrich	W4502-1L
T4 polinucleotide chinasi	Promega	M4101
T4 DNA ligasi	Promega	M1801
Fenolo: cloroformio	Fisher Chemical	BPE1752p-400
Cloroformio	Fisher Chemical	C/4960/PB08
Etanolo	Sigma-Aldrich	32221-2.5L
tampone di caricamento del gel DNA	New England Biolabs	B7021S
Agarosio	Bioline	BIO-41025
Optimem	Life Technologies	11058021
TransIT-LT1	Mirus Bioscience	MIR 2300
Siringa	Hamilton Hamilton	80901 Modello 1705
30 G aghi	BD Bioscience	304000
SYBR Colorazione gel DNA sicura	Life Technologies	S33102
Rneasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134
Oligo (dT) primer	Thermo Scientific	SO131
dNTP mix	Fermentas	R0192
Super Script III trascrittasi inversa	Life Technologies	56575
Tampone di sintesi del cDNA del primo filamento	Life Technologies	y02321
SybrGreen qPCR Master mix veloce	Applied Biosystems	4385612
cxcl10 primer diretto murino	Integrated DNA Technologies	n/a	ACTGCATCCATATCGATGAC
cxcl10 primer inverso murino	Tecnologie del DNA integrate	n/a	TTCATCGTGGCAATGATCTC
il6 primer diretto murino	Integrated DNA Technologies	n/a	GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC
il6 primer diretto murino	Integrated DNA Technologies	n/a	GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC