Compensativa Limb uso e comportamentale valutazione delle abilità di apprendimento Motor seguito Sensomotoria Cortex Infortunio in un modello murino di ictus ischemico

Sommario

I modelli murini sono diventati sempre più popolari negli studi di neuroscienze comportamentali. Man mano che i modelli avanzano, è importante sviluppare misure comportamentali sensibili specifiche per il topo. Questo protocollo descrive il Pasta Matrix Reaching Task, che è un compito motorio qualificato per l'uso in modelli murini di ictus.

Abstract

Modelli murini sono diventati sempre più popolari nel campo delle neuroscienze comportamentali, e in particolare negli studi di ictus sperimentale. Come modelli anticipo, è importante sviluppare misure sensibili comportamentali specifiche per il mouse. Il presente protocollo descrive un compito abile motore per l'uso in modelli murini di ictus. La Pasta Matrix Raggiungere funzioni di operazione come un test comportamentale versatile e sensibile che permette sperimentatori per raccogliere i dati di outcome precisi e manipolare l'uso degli arti per simulare fenomeni clinici umani, comprese le strategie compensative (ad esempio, appreso il mancato uso) e concentrati training riabilitativo. Quando combinato con strumenti neuroanatomici, questa operazione permette anche ai ricercatori di esplorare i meccanismi che supportano il recupero comportamentale della funzione (o la sua assenza) dopo ictus. Il compito è semplice e conveniente da configurare e condotta, che offre una varietà di formazione e di sperimentazione opzioni per numerose domande di ricerca concernenti furisultato nctional a seguito di infortunio. Anche se l'attività è stata applicata a modelli murini di ictus, può anche essere utile in studi di esito funzionale in altri modelli di pregiudizio estremità superiori.

Introduzione

Modelli murini sono diventati sempre più popolari per la ricerca sperimentale ictus dovuto in parte alla loro praticità e convenienza, nonché la disponibilità di linee transgeniche che sono adatti per l'imaging in vivo tra altre applicazioni. Con questo aumento di popolarità in modelli sperimentali, l'interesse per lo sviluppo delle valutazioni sensibili comportamentali di risultato funzionale dopo la lesione ha anche aumentato ^1-7. Lo sviluppo di protocolli di allenamento di animali che imitano sia la riabilitazione e strategie compensative utilizzato da ictus umane migliora la capacità di tradurre correttamente i risultati di studi su animali sperimentali da utilizzare nella clinica ^8. Formazione di abilità motore sulla Pasta Matrix Raggiungere Task (PMRT) è stata precedentemente stabilita come una valutazione del comportamento sensibile del risultato abilità motoria a seguito insulto ischemico della corteccia sensomotoria ^3.

Uno dell'interesse primarios in corsa ricerca riguarda il risanamento e lo sviluppo e la comprensione delle strategie comportamentali che promuovono un migliore recupero della funzione seguente insulto. Attualmente, strategie di riabilitazione negli esseri umani producono incompleta ⁸ recupero. Inoltre, terapisti della riabilitazione devono combattere strategie compensative che ha avuto un ictus si sviluppano durante il recupero che possono compromettere la loro capacità di recuperare pienamente in funzione della loro dell'arto interessato (s). Ad esempio, a seguito di un ictus unilaterale che pregiudica la funzione degli arti superiori, gli esseri umani tendono a sviluppare una dipendenza da loro arto meno colpite ^{9, 10.} Pur migliorando la capacità di una persona di funzionare nel breve termine, questo ha imparato non uso dell'arto interessato possono impedire la sua ultima possibilità di recupero, come dimostrato in modelli animali ^11-13. Questi risultati rilevati negli animali hanno contribuito a informare lo sviluppo e l'uso di terapia del movimento costrizione indotta negli esseri umani ^14. Modelli animali sono beneficial per migliorare le strategie di riabilitazione, consentendo ai ricercatori di esplorare i meccanismi neurobiologici che si pongono al servizio e promuovere il recupero della funzione. Oltre ad essere una valutazione efficace del comportamento della funzione post-ictus, il PMRT è stato istituito come una strategia riabilitativo efficace per promuovere un migliore risultato funzionale seguente sensomotorio ictus ^15. Il PMRT può anche essere usato in modo efficace mimica imparato non uso dell'arto interessato e quindi offrire comprensione manipolazioni comportamentali che possono migliorare il recupero funzionale nonostante le iniziali eccessivo affidamento sul lembo meno colpite ^13.

Costruzione del PMRT è stato descritto in precedenza ^3. Brevemente, la camera di raggiungere è composta da quattro pareti plexiglas (alto 20 cm 15 cm e largo 8,5 centimetri) con una parte superiore aperta e inferiore. C'è una fessura centrale (altezza 13 cm e contengono largo 5 mm) estendentesi dalla base inferiore della parete frontale della camera che servecome l'apertura raggiungimento (Figura 1A). La matrice pasta è un blocco di plastica resistente (lungo 8,5 cm, largo 5 cm e alta 1,5 cm) da 1 mm di diametro fori praticati completamente attraverso la profondità del blocco. Ci sono un totale di 260 fori, iniziando 2 mm dalla finestra raggiungimento di 2 mm tra ciascun foro (Figura 1B). La matrice pasta è progettato in modo che secchi, pezzi di pasta orientati verticalmente estendono su tutta la profondità del palcoscenico matrice con circa metà del pezzo di pasta esposta. Un pezzo di plastica rimovibile sovraccarico o cartoncino deve essere tagliato a misura e saldamente attaccata alla parte inferiore della matrice. Ciò impedisce che i pezzi di pasta di cadere fuori dalla matrice durante il trasporto e consente una facile rimozione dei pezzi di pasta rotti.

Il PMRT è un test comportamentale versatile e sensibile che permette sperimentatori per raccogliere i dati di outcome precisi e manipolare l'uso degli arti per imitare fenomeni clinici. Come o comportamentaleE SITO misura, la PMRT permette sperimentatori di raccogliere dati comportamentali che riflettono più accuratamente l'efficacia di una strategia riabilitativa di quanto non faccia la misura tradizionale di dimensioni dell'infarto ^{3, 16.} Come una manipolazione comportamentale, il PMRT permette sperimentatori di controllare l'uso degli arti superiori nei topi in Per simulare esperienze cliniche di riabilitazione (cioè di formazione dell'arto interessato) o appreso di non uso (cioè la formazione degli arti inferiori colpiti). Quando combinato con metodi neuroanatomici, il PMRT fornisce ai ricercatori l'opportunità di esplorare i meccanismi che supportano il recupero comportamentale di funzione o di plasticità disadattivi dopo l'uso dell'arto compensativo dopo l'ictus. Il PMRT potrebbe essere ulteriormente applicato ad altri modelli murini di lesioni cerebrali e compromissione degli arti superiori, come ad esempio lesioni cerebrali traumatiche. Un altro vantaggio del PMRT è la sua accessibilità. L'attrezzatura necessaria per l'attività può essere costruito abbastanza ragionevole in casa, la raccolta di dati fanon richiede una grande quantità di spazio o di risorse finanziarie, e il compito è abbastanza semplice per gli studenti universitari di raccogliere dati in modo affidabile. Inoltre, il PMRT è sensibile anche a piccole deficit comportamentali ^{3, 13.} Questo protocollo fornisce un modo semplice ed efficace per valutare l'apprendimento delle capacità motorie, promuovere il recupero comportamentale dopo la lesione, e mimici fenomeni non-uso appreso in un modello murino consolidata di ictus.

Protocollo

I seguenti metodi sono conformi con i protocolli approvati dalla Università del Texas a Austin e Illinois Wesleyan cura degli animali e uso Comitati. Si raccomanda che i ricercatori sia indossare guanti o prendere le opportune precauzioni (lavarsi le mani prima e dopo) quando si impegnano in formazione comportamentale con qualsiasi animale da laboratorio. I guanti devono essere indossati quando si maneggia animali in preparazione e durante l'intervento chirurgico.

1. Assuefazione e la restrizione alimentare

NOTA: il PMRT è un compito appetitiva, è utile per limitare la quantità e la tempistica di alimentare prima dell'inizio della formazione, al fine di motivare la risposta di raggiungere e prevenire sazietà durante gli allenamenti.

1. Topi posto su un programma di alimentazione limitata a partire almeno 1 settimana prima dell'inizio della formazione compito. Pesare ogni mouse prima dell'inizio della restrizione alimentare per stabilire i pesi liberi-alimentazione, che sono determinati come thI pesi di ciascun animale, il primo giorno di alimentazione ristretta.
   1. Feed topi volta al giorno, ogni topo ricevente ~ 2,5 g di roditore cibo standard al giorno (per esempio, se ci sono 4 topi alloggiati in una gabbia, la gabbia riceverà 10 g di alimento al giorno). Assicurarsi alimentazione avviene allo stesso tempo ogni giorno, preferibilmente al momento allenamenti giornaliero si prevede di concludere.
   2. Pesare animali regolarmente per garantire che nessun mouse perde più del 10% del loro peso libero al seno. NOTA: Regolare la quantità di cibo quotidiana di conseguenza per favorire un adeguato mantenimento del peso. I topi di solito aumentano di peso alla loro scadenza, anche con costanti topi restrizione alimentare rimangono sulla restrizione alimentare per la durata del PMRT formazione / valutazione.
2. Esporre animali piccoli pezzi di pasta (tagliato a 1,6 cm) nella loro gabbia casa diverse volte prima di formazione al fine di superare le risposte neophobic. NOTA: in genere 5-10 giorni di esposizione sono sufficienti, con circa 4 pezzi per il mouse disposizionided ad ogni poppata.
3. Tagliare pezzi di pasta di dimensioni (3,2 cm) con una lama di rasoio. NOTA: Si raccomanda che un eccesso di pezzi di pasta vengono tagliati prima di iniziare l'addestramento del giorno e pezzi inutilizzati conservati in un contenitore ermetico. Pasta Capellini è usato per riempire la matrice. Come diverse marche di pasta variano in consistenza e diametro, che potrebbe influenzare la stabilità della pasta nella matrice o la quantità di forza necessaria per i topi di rompere la pasta, è consigliabile DeCecco marchio paste essere utilizzato per tutta la formazione e test.
4. Mettere crudi pezzi di pasta capellini nella matrice pasta, riempiendo tutti i buchi disponibili nella matrice (Figura 1A).
5. Abituare topi alla camera di prova con una matrice di pasta piena posta di fronte (Figura 1A) e vari pezzi di pasta da mangiare sul fondo della camera di prova. Abituare i topi per 3 sedute di 5-10 min. NOTA: I topi non dovrebbero essere incoraggiati a raggiungere per la pasta durante habituazione di formazione. I topi di solito iniziano a mostrare interesse per la pasta che si trova al di fuori della camera di raggiungere entro annusando attraverso l'apertura. E 'possibile abituare due compagni di gabbia in un'unica camera se desiderato, ma i topi dovrebbe essere configurato e addestrato singolarmente. Tutte le superfici devono essere pulite con etanolo al 70% o una simile soluzione disinfettante sicuro prima e dopo ogni animale viene posta nell'apparecchio comportamentale.

2. Shaping Reach

1. Determinare arto preferito di ogni animale da plasmare portata in 3-5 prove per la formatura una volta al giorno. Permesso topi da raggiungere per 10 minuti per un totale di 10 volte, che si verifica per primo.
   1. Posizionare topi singolarmente nella camera di prova con una matrice di pasta pieno in fronte alla camera come nella formazione assuefazione (Figura 1A).
   2. Registrare il numero di portate con ogni arto, che indica il numero di portate aventi diritto e gli arti di sinistra separatamente. Definire una portata come estensionedell'arto attraverso l'apertura di raggiungere tale che il polso rompe il piano di sezione; non è necessario che la portata ad essere rivolto verso o prendere contatto con la pasta.
2. Contenere diversi pezzi di pasta appena all'interno della camera attraverso l'apertura raggiungimento di incoraggiare topi che sono riluttanti a raggiungere. Disegnare i pezzi di pasta quando il mouse mostra interesse (ad esempio sniffing, mordere), incoraggiandoli così a raggiungere dopo i pezzi di pasta in ritirata. Se i topi non mostrano inizialmente interesse per la pasta secca, quindi bagnare le punte dei pezzi di pasta in una piccola tazza di acqua calda per renderli più appetibili.
3. Determinare preferenza arto quando un mouse presenta un minimo del 70% dei loro raggiunge quotidiani un singolo arto. Non a un eccesso di forme animali, come questo può limitare la quantità di apprendimento osservati durante la fase di formazione dei compiti che raggiungono ^17. Iniziare la formazione PMRT una volta sono a forma di topo. NOTA: La formazione può essere avviato non appena il next giorno, ma è anche accettabile aspettare diversi giorni tra la modellatura e procedure di formazione.

Formazione 3. Raggiungere

1. Topi treno una volta al giorno prima di insulto al fine di stabilire la competenza sulla PMRT. NOTA: Ogni prova è costituito da un massimo di 15 min o 100 raggiunge contato dall'osservatore (successo e insuccesso), a seconda di quale si verifica prima. I topi sono addestrati per raggiungere solo con il loro arto preferito. I topi tollerano due prove al giorno, se un paradigma di formazione più intenso si desidera ^18.
   1. Topi posto nella camera di prova con una matrice mezzo pieno posta di fronte (Figura 1B). Topi treno per raggiungere solo con il loro arto preferito riempiendo solo lato della matrice controlaterale all'arto preferito da topi raggiungono attraverso la linea mediana del corpo. Lasciare la porzione della matrice corrispondente all'arto unpreferred Vacanti per scoraggiare i tentativi retrattili con tale parte (che non sarebbe successful perché non riescono a raggiungere la pasta) e favorire raggiungere solo con l'arto preferito.
2. Mettere una piccola quantità di pressione sulla pasta mentre è nella matrice per aiutare topi rompere con successo pezzi durante gli allenamenti primi. Non rompere i pezzi di pasta per il mouse. Ottenere ciò tenendo uno o due pezzi di pasta leggermente dietro e perpendicolare al bersaglio raggiungendo previsto. Questa piccola quantità di supporto aiuta a stabilizzare la pasta sottile, che è abbastanza flessibile e difficile per i topi da afferrare come sono inizialmente imparando il compito.
3. Registrare il numero totale di portate, il numero di portate di successo, e le posizioni di portate di successo. Raggiunge successo richiedono il mouse per raggiungere attraverso l'apertura, afferrare un pezzo di pasta, e rompere il pezzo di pasta per rimuoverlo dalla matrice. NOTA: i pezzi di pasta non devono essere sostituiti nella matrice fino a dopo il processo è terminato. All'inizio della formazione, i topi non si rompono molti pezzi di pasta.
4. Topi treno sulla PMRT di competenza, che è definita come almeno 3 giorni (e fino a 5 giorni) di prestazioni costanti (rottura almeno 9 pezzi di pasta con non più di 2 più o meno pezzi per giorni). Spesso ci vogliono tra 15-20 giorni per formare giovani topi adulti di competenza.

4. Formazione Arto meno colpite

1. Addestrare l'arto meno colpite (ad esempio, l'arto unpreferred pre-operatoria) che inizia quattro giorni dopo insulto ischemico alla corteccia motoria controlaterale all'arto raggiungimento preferito (vedi Figura 2 per chiarimenti su arti colpiti / e preferita less-affected/unpreferred) . Somministrare 15 min o di formazione professionale 100-portata sedute una volta al giorno.
   1. Rimuovere la prima colonna di pasta (cioè la colonna verticale più mediale si estende dall'apertura portata) per la prima settimana di formazione arto inferiore colpite al fine di garantire che raggiunge precoce con l'arto interessato non hanno successo.
   2. Topi posto nella camera di raggiungere con la matrice dimezzati posto davanti. Assicurarsi che la metà piena della matrice è opposto del pre-operatoria riempita mezzo, che costringerà i topi per raggiungere ora con meno colpite (unpreferred) arto.
2. Incoraggiare raggiungere con l'arto meno colpite, rafforzando l'estensione di tale parte attraverso l'apertura di raggiungere. Quando i topi estendere l'arto meno colpite nei primi giorni di luogo di formazione di un piccolo (1/2 pezzo) di pasta sul pavimento della camera di raggiungere, indipendentemente dal fatto che la portata è successo.
3. Conta solo quelle raggiunge fatte con l'arto meno colpite verso la portata totale 100. Non contare i tentativi furtivi con l'arto colpito verso il numero totale di portate.
4. Riportare la colonna verticale più mediale di pasta alla matrice dopo i primi 7 giorni di allenamento degli arti inferiori colpite.
5. Registrare il numero di portate, il numero di portate di successo, e le posizioni dei succraggiunge essful. NOTA: I dati possono essere analizzati per osservare le differenze nel raggiungimento modelli con l'arto meno colpite, ma non sono stati precedentemente riportati.

Analisi 5. Tendere

Determinare l'impatto dei meno colpiti uso dell'arto sul recupero della funzionalità dell'arto interessato valutando l'arto interessato il compito PMRT seguente formazione arto meno colpite. Tale valutazione avviene dopo il numero desiderato di meno colpiti giornate di formazione degli arti sono completa (in genere 14 giorni).

1. Posizionare la matrice di fronte alla camera, orientato in modo identico a procedure di formazione (cioè, con la metà della matrice controlaterale all'arto preferito riempito). NOTA: Questo costringe i topi di raggiungere con il loro affetto (e in precedenza preferito) arto.
2. Registrare il numero totale di portate, il numero di portate di successo, e le posizioni di portate di successo da confrontare con i livelli di prestazione pre-corsa. Non sondare le prestazioni dil'arto interessato durante l'allenamento degli arti inferiori colpiti da queste sonde arto interessato può funzionare come sessioni di formazione che potrebbero influire recupero dell'arto interessato.

Risultati

I risultati dell'analisi PMRT dovrebbero includere il numero di pezzi di pasta rotto e il modello di successo raggiunge. Risultati da topi con lesioni corticali sensorimotorie indicano che insulto ischemico colpisce sia il numero di portate di successo così come i modelli portata fisica ^{3, 19,} come mostrato nella Figura 3A. Cambi di pattern rappresentativi possono osservare nella Figura 3B. La capacità del PMRT di mimare gli effetti non uso apprese nei topi è dimostrata dalla...

Discussione

Il PMRT rappresenta un modo semplice, quantitativa per valutare abile prestazioni raggiungendo in topi. Anche se in termini di tempo, è possibile per gli studenti universitari in precedenza inesperti per essere addestrati per raccogliere dati affidabili e riproducibili con pochi allenamenti. Il compito è abbastanza sensibile per misurare anche lievi cambiamenti nel topo prestazioni delle capacità motorie seguenti insulto ischemico ^{3, 13, 15,} e un certo numero di studi citare deficit a lungo termine con una va...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Camera di raggiungimento			Le camere di raggiungimento sono realizzate internamente con
blocco			La scatola matrice di pasta è realizzata internamente utilizzando un blocco di plastica pesante
Pasta	Capellini DeCecco	La pasta capellini a marchio DeCecco può essere acquistata in un negozio di alimentari o tramite un rivenditore online come Amazon