Scheda di controllo motore e prestazioni equilibrio sono noti a peggiorare con l'età. Questo documento presenta una serie di test comportamentali non invasivi standard con l'aggiunta di un semplice stimolo rotante per sfidare i cambiamenti del sistema e mostrare vestibolari nelle prestazioni equilibrio in un modello murino di invecchiamento.
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Articolo metodologico
Behavioral Valutazione del sistema vestibolare invecchiamento mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
Età correlate calo delle prestazioni equilibrio è associato a deterioramento forza muscolare, la coordinazione motoria e la funzione vestibolare. Mentre un certo numero di studi mostrano variazioni di bilancio fenotipo con l'età nei roditori, molto pochi isolare il contributo vestibolare di bilanciare in virtù di condizioni normali o durante la senescenza. Usiamo due test comportamentali standard per caratterizzare le prestazioni saldo di topi in punti di età definiti sulla durata: la prova rotarod e la prova fascio di equilibrio inclinato. Importante, però, un rotore personalizzato costruito è utilizzato anche per stimolare il sistema vestibolare dei topi (senza indurre evidenti segni di cinetosi). Queste due prove sono state utilizzate per mostrare che i cambiamenti nella vestibolare prestazioni mediata-equilibrio sono presenti sulla durata murino. I risultati preliminari mostrano che sia la prova rotarod e test fascio di equilibrio modificati possono essere usati per identificare cambiamenti nelle prestazioni equilibrio durante l'invecchiamento come alternativa a più diffictecniche ULT e invasive come vestibolo-oculare (VOR) misurazioni.
Introduzione
Il nostro senso di equilibrio è forse una delle più ancora trascurato componenti vitali anche le attività motorie di base, tra cui camminare e tornitura. Equilibrio è influenzata da numerosi fattori tra cui la forza muscolare, coordinazione motoria e funzione vestibolare, ed è solo in presenza di neuropatie vestibolari o durante l'invecchiamento normale che l'importanza di un sistema di equilibrio pienamente funzionante è apprezzato. Disturbi del sistema vestibolare sono spesso associati a esperienze di vertigini o capogiri e squilibrio con conseguente aumento del rischio di cadute e conseguenti lesioni 1. Ciò è particolarmente critica nelle popolazioni anziane, dove le cadute sono una delle principali cause di infortuni 2.
Test di funzionalità vestibolari sono comunemente basati sui riflessi vestibolari, in particolare, il vestibolo-oculare (VOR) o riflesso vestibolo-collic (VCR). Il VOR e VCR sono essenziali per la stabilizzazione delle immagini sullola posizione retina e la testa durante i movimenti della testa e del corpo, rispettivamente. Comunemente, le misurazioni VOR richiedono l'impianto invasivo delle bobine di ricerca per misurare i movimenti oculari o video tracking dei movimenti oculari 3. Questo è impegnativo nei topi a causa delle piccole natura dell'occhio mouse e la difficoltà di individuare la pupilla per analisi video 3. In alternativa, il VCR è stato usato per misurare la stabilizzazione della testa in risposta ai movimenti del corpo in topi senza la necessità di chirurgia invasiva 4. Nonostante questo, alcuni studi si concentrano in particolare su come il sistema vestibolare esegue nel suo complesso e soprattutto come cambia durante l'invecchiamento.
Per valutare le prestazioni complessive equilibrio in modo semplice e non invasivo abbiamo modificato due test comportamentali comunemente usati. Le prove equilibrio fascio rotarod e inclinate valutare diversi aspetti della performance motoria nei roditori e negli studi precedenti sono stati utilizzati in una batteria di test per acquisire una completaprofilo della capacità del motore. Questa capacità può essere influenzata da malattia o modificazione genetica, ed è anche sensibile a processi associati con lo sviluppo normale e invecchiamento 5-7. Lavori precedenti utilizzando il rotarod ha dimostrato che la coordinazione motoria nei topi declina dopo 3 mesi di età 8. Inoltre, i ratti mostrano deficit di bilancio evidenti con l'aumentare dell'età del test fascio di equilibrio 9.
Questo articolo descrive l'uso dei test rotarod ed equilibrio fascio in collaborazione con uno stimolo vestibolare, al fine di sfidare il sistema vestibolare e caratterizzare il conseguente impatto sulle prestazioni equilibrio giovani e meno giovani topi. Mentre i metodi semplici e non invasivi descritti non sono concepiti come misure autonome di funzione vestibolare periferico, esse forniscono una misura comportamentale utile e semplice per confrontare cambiamenti cellulari e subcellulari in più fasi di lavorazione vestibolare durante il normale invecchiamento nei topi.
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Protocollo
1. Animali
- Mice (C57/BL6) di età 1, 9, e 13 mesi di età sono stati ottenuti da risorse Animal Centre (Perth, Australia). Questi topi sono stati alloggiati in gabbie standard del mouse nella struttura Bosch Roditore presso l'Università di Sydney su una di 12/12 ore di luce / buio ciclo con accesso a cibo e acqua ad libitum. Le procedure descritte di seguito sono state approvate dall'Università di Sydney comitato etico degli animali.
- Portare gabbie del mouse in sala prove prima di ogni prova per 10 minuti per consentire topi per acclimatare per l'ambiente di test.
2. Rotarod
- Sistemare il dispositivo di rotarod (Figura 1A):
- Installare i tasselli in ogni corsia della rotarod.
Nota: In questo caso ratto tasselli (70 millimetri di diametro) sono utilizzati al posto dei tasselli del mouse (32 mm di diametro) per scoraggiare i topi dal aggrappato al grano e l'esecuzione di "rotazioni passivi" 10. - Position piattaforme di atterraggio magnetici sul filo situata nella parte inferiore di ciascuna corsia della rotarod assicurandosi che non stanno inclinando a toccare il pavimento del rotarod e sono disposti il più vicino possibile alla parete destra magnetico di ogni corsia senza toccare.
Nota: Durante la prova sono necessari i topi rotarod a camminare in avanti per rimanere sulle spine rotanti e accelerazione. Quando il mouse non è più in grado di rimanere sul grano, cadono e spostano la piattaforma di atterraggio che attiva poi un sensore magnetico. Il tempo necessario per cadere dal tassello rotante, l'rpm tassello al tempo di caduta e la distanza percorsa viene calcolata automaticamente per ciascun topo e registrata sullo schermo di visualizzazione nella parte anteriore del rotarod. - Infilare 2 pannelli di plastica trasparente nella parte anteriore di ogni corsia rotarod con i pannelli più brevi in basso e pannelli lunghi sopra.
- Ingresso i parametri di test utilizzando la tastiera trova nella parte anteriore del rotarod. Segui steps 2.1.4.1 a 2.1.4.6 per i parametri di accelerazione prova rotarod e gradini 2.1.4.7 a 2.1.4.12 per i parametri di prova rotarod velocità fissa.
- Impostare la durata massima del test per 60 sec.
- Impostare il numero di corsie da utilizzare (o il numero di topi da testare).
- Impostare la velocità iniziale di prova di 5 rpm.
- Impostare la velocità massima della prova a 44 rpm.
- Impostare la velocità di rampa di prova di 60 sec.
- Impostare la dimensione dei tasselli scelti e il senso di rotazione per tasselli ratto rotazione in avanti.
- Impostare la durata massima della prova a 240 sec.
- Impostare il numero di corsie da utilizzare per uno come i topi vengono testati singolarmente.
- Impostare la velocità iniziale di prova di 15 rpm.
- Impostare la velocità massima della prova a 15 rpm.
- Impostare la velocità di rampa della prova a 0 sec.
- Impostare la dimensione del tassello scelto e il senso di rotazione di un perno rotante ratto in un forwadirezione rd.
Nota: Le impostazioni di cui sopra possono essere modificate per soddisfare le esigenze dei diversi esperimenti.
- Posizionare una telecamera di fronte rotarod per la prova rotarod velocità fissa, in modo che il comportamento del mouse durante prove possono essere registrati e le video utilizzato per una successiva analisi per determinare la durata del tempo i topi erano in grado di rimanere sul rotarod.
- Installare i tasselli in ogni corsia della rotarod.
- Seguire i passaggi da 2.2.1 a 2.2.4 per il test rotarod accelerazione:
- Posizionare un mouse su ogni tassello fermo per 5 minuti per permettere i topi di raggiungere la rotarod.
- Spingere delicatamente i topi affrontare retro del rotarod e avviare il test rotarod quando tutti i soggetti si trovano ad affrontare in questa direzione (vedere Figura 1B).
- Rientro tutti i topi nelle loro gabbie quando sono caduti dalle spine rotanti e lasciarli riposare per 10 minuti con accesso a cibo e acqua.
- Ripetere i passaggi da 2.2.1 a 2.2.3 per completare un totale di 8 prove assicurandosi di pulirei tasselli, vicoli e piattaforme di atterraggio del rotarod per l'urina e le feci, e spostare le piattaforme di atterraggio torna alla sua posizione iniziale betwen ogni prova.
Nota: le prime 3-5 prove vengono usati come prove di formazione per permettere ai topi di familiarizzarsi con il compito. Il tempo a cadere, la distanza percorsa e la fine rpm del tassello al momento della caduta per ogni prova successiva è registrata per un'analisi successiva (figura 2).
- Seguire i passaggi da 2.3.1 a 2.3.8 per il test rotarod velocità fissa:
- Posizionare un mouse su un tassello per 5 minuti per permettere di raggiungere la rotarod. Ritorno il mouse alla sua gabbia.
- Avviare la registrazione di video sulla fotocamera e premere il tasto di avvio sul rotarod. Poi posizionare il mouse sul tassello rotante assicurando che si affaccia sul retro del rotarod.
- Smettere di registrazione video della fotocamera quando il mouse cade dalle spine rotanti, e restituire il mouse per le sue gabbie per 10 minuti con accesso a cibo e acqua.
- Ripetere i punti 2.3.2 e 2.3.3 fino a un totale di 8 prove si acquisisce avendo cura di pulire i tasselli, vicoli e piattaforme di atterraggio del rotarod di feci e urine, e spostare le piattaforme di atterraggio nella sua posizione di partenza tra ogni prova .
- Accendere il rotore personalizzato costruito a 3 Hz per 20 secondi per permettere ai topi di familiarizzare con il suono. Arrestare il rotatore dopo 20 sec spegnendo il trapano e mettere le mani su entrambi i lati della ruota portante per impedirgli di continuare a ruotare oltre la iniziale 20 sec.
Nota: Il rotatore stessa è costituito da una ruota roditore esecuzione fissata ad un (Figura 3A) trapano. Al centro della ruota portante è una piccola camera con un coperchio a maglie in cui il mouse viene posizionato (Figura 3B). Il rotatore ruota in senso antiorario attorno all'asse verticale. L'entità dello stimolo è in linea con gli studi precedenti che mostrano stimolazioni rotanti da 0,2 a 3 Hz sono sufficienti per generaremangiato VOR e videoregistratore risposte 4,11,12. - Posizionare il mouse all'interno della camera al centro del rotatore e rimettere il coperchio.
- Accendere il rotatore alla sua minima di 3 Hz per 20 sec. Avviare il rotarod e iniziare la registrazione video della fotocamera durante questo tempo in preparazione per l'imminente processo. Spegnere il trapano alla fine del 20 sec e appoggiare le mani su entrambi i lati della ruota portante per fermarlo dalla filatura. Ripetere il controllo del mouse sul rotarod subito dopo trasferendo il più rapidamente possibile il tassello rotante.
- Smettere di registrazione video della fotocamera quando il mouse cade dal grano e ritorno il mouse per sua gabbia.
- Pulire i pannelli di plastica trasparente con un detergente delicato mix / acqua e tasselli cilindrici, vicoli e piattaforme di atterraggio metallo del rotarod con il 70% di etanolo, quando tutti i topi sono stati testati.
3. Trave con vestibolare Sfida
- Impostare il baApparecchiatura fascio lance come si vede nella Figura 4A.
Nota: L'apparecchio giogo della bilancia è stato adattato da un apparecchio descritto nel Carter et al (2001) 13.. Per questo test, i topi piedi dall'estremità inferiore della trave, che è 52,5 centimetri dal suolo, ad una scatola buia obiettivo (13 x 22 cm, con un porta 5 cm x 6) situato a 60 cm sopra il terreno (Figura 4A ). Mouse naturalmente cercano il buio e la protezione della casella obiettivo a favore della trave a vista e sono ulteriormente incoraggiati ad attraversare il fascio dalla leggera pendenza che sfrutta il loro meccanismo di fuga naturale per l'esecuzione in una direzione verso l'alto 14. La trave stessa è 1 m di lunghezza e ha una sezione trasversale circolare con un diametro di 14 mm. Una gamma di diametri misura fascio può essere utilizzato che permette lo sperimentatore per regolare la sensibilità del test o ospitare soggetti più grandi. Alla estremità inferiore del fascio di equilibrio una linea bianca indica la linea di partenza. Un'altra linea è statadisegnata 60 centimetri dalla linea di partenza, alla fine superiore della trave per indicare la linea del traguardo (Figura 4A).- Posizione 2 telecamere, una per lato del fascio di equilibrio, in corrispondenza dell'estremità inferiore del fascio di equilibrio (Figura 4B).
Nota: Queste telecamere dovrebbero essere angolati per catturare l'intera lunghezza della trave e garantire che le linee di partenza e di arrivo segnati sulla trave di equilibrio sono chiaramente visibili. Queste telecamere saranno utilizzati per registrare video il comportamento dei topi, e attraversa il fascio di equilibrio, con i video risultanti utilizzati per una successiva analisi. - Foderare il fondo della scatola porta con tovagliolo di carta, per consentire una facile pulizia di urina e feci dopo aver testato ogni mouse, e posizionare la cupola custodia dalla gabbia soggetti casa all'interno della scatola porta.
- Posizionare adeguata espanso o altro materiale di imbottitura sotto il fascio sollevata per proteggere qualsiasi soggetti che cadono dall'apparecchio. I topi che rientrano saranno raccolti immediatamente l'esperimentoer e presente all'interno della scatola di rinvio a riposo.
- Posizione 2 telecamere, una per lato del fascio di equilibrio, in corrispondenza dell'estremità inferiore del fascio di equilibrio (Figura 4B).
- Collocare un mouse nella scatola di rinvio 2 min in modo che diventi familiarità con questo ambiente. Coprire l'apertura al dialogo gol con una mano guantata per 5 sec se il mouse cerca di camminare sulla trave durante questo tempo per scoraggiare questo comportamento.
- Formare il mouse posizionandolo sulla trave appena fuori dell'apertura alla scatola di rinvio e permettendogli di camminare in area obiettivo. Continuare a formare il mouse posizionandolo sulla trave progressivamente più lontano dalla scatola porta fino a quando il mouse è in grado di camminare dalla linea di partenza alla casella gol senza assistenza ed esitazione minima. Lasciare il mouse per riposare nella scatola di rinvio 1 minuto dopo ogni esecuzione.
- Iniziare a provare il mouse quando la formazione è completa.
- Avviare la registrazione video su telecamere.
- Posizionare il mouse sulla linea di partenza del fascio e attendere che attraversa il fascio nella direzione della scatola di rinvio.
- Interrompere la registrazione video su caMeras quando il mouse raggiunge la casella.
- Lasciare il mouse per riposare nella scatola di rinvio 1 min. Rimuovere eventuali urina o feci che possono essere stati depositati nel corso del processo durante l'attesa.
- Ripetere i punti da 3.4.1 a 3.4.4 fino a un totale di 5 prove sono state completate.
- Accendere il rotore personalizzato costruito a 3 Hz per 20 secondi (come nel test rotarod velocità fissa) per permettere ai topi di familiarizzare con il suono. Arrestare il rotatore dopo 20 sec spegnendo il trapano e mettere le mani su entrambi i lati della ruota corsa per impedirgli di girare.
- Posizionare il mouse all'interno della camera al centro del rotatore e rimettere il coperchio.
- Accendere il rotatore alla sua minima di 3 Hz per 20 sec. Avviare la registrazione video delle telecamere durante questo tempo, in preparazione per l'imminente processo. Spegnere il trapano alla fine del 20 sec e appoggiare le mani su entrambi i lati della ruota portante per impedirgli di continuare a ruotare oltre la iniziale 20 sec. Transfer il mouse all'inizio del fascio di equilibrio più rapidamente possibile e attendere mentre il mouse attraversa il fascio alla scatola di rinvio.
- Interrompere la registrazione video su fotocamere quando il mouse raggiunge la casella obiettivo e ritorno il mouse per sua gabbia.
- Pulire l'apparato fascio di equilibrio con il 70% di etanolo e cambiare il tovagliolo di carta nella casella gol dopo ogni topo è stato testato.
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Risultati
Rotarod
La performance motoria dei topi è stato descritto come Time To Fall (TTF) registrato per ogni mouse su 8 prove. Utilizzando queste misurazioni di TTF, curve di formazione per ciascun topo possono essere tracciati. Figura 2 mostra esempi di prestazioni del motore di una 1 mesi mouse e uno di 9 mesi topo nel corso di 8 studi. Queste curve formazione mostrano un aumento TTF durante i primi 3-5 prove seguita da un successivo plateau. Misure di TTF registrati prima plateau s...
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Discussione
Fasi critiche all'interno del protocollo
Precedenti studi hanno dimostrato che è facile overtrain topi sia sul rotarod ed apparecchi trave e di conseguenza, l'acquisizione di misurazioni accurate può essere difficile 15. Ad esempio, sovrallenamento sulla rotarod può portare a topi intenzionalmente saltare fuori i tasselli durante i periodi di acclimatazione e di prova, mentre sovrallenamento alla trave può portare ad un arresto più frequenti (comportamento esplorativo) e viag...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare la Garnett Passe and Rodney Williams Memorial Foundation e il Bosch Institute Animal Behavioural Facility.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Rotarod | IITC Scienze della vita Inc. | #755 | "Tasselli per ratti" = diametro 70 mm. Evitare che l'etanolo entri in contatto con il perspex. |
| iPhone | Apple | Può utilizzare qualsiasi tipo di fotocamera. Velcro fissato alla superficie posteriore per il fissaggio al braccio articolato 3D. | |
| Braccio articolato 3D | Fisso/Baitella | Classic 3300-28 | Qualsiasi tipo di supporto verticale stabile sarebbe adeguato. Il velcro è fissato all'estremità apicale del braccio per il fissaggio dell'iPhone. |
| Trave mobile in legno: striscia di legno liscio lunga 1 m con una sezione circolare di 14 mm di diametro | Una gamma di diametri e forme di sezione trasversale può essere utilizzata per soddisfare i parametri sperimentali | ||
| Scatola di porte in legno (130 x 140 x 220 mm) realizzata con tavole | |||
| Supporto di supporto in travi di 41 x 41 mm: 2 travi verticali a 525 e 590 mm da terra rispettivamente alla partenza e alla fine della porta; trave orizzontale da 803 mm che corre lungo il terreno direttamente sotto la trave mobile; due travi lunghe 20 mm fungono da "piedini", unendo le travi orizzontali e verticali alle due estremità; un blocco di 21 x 21 x 36 mm tagliato all'estremità apicale della trave verticale "di partenza"; Un'apertura di 13 x 13 mm ritaglia il centro di questo blocco, formando un tunnel che corre perpendicolarmente alla trave mobile. | Rinforzare tutte le giunzioni con piccole staffe in acciaio. | ||
| Vernice nera (a base d'acqua) | Handycan | Acrilico Nero opaco | 2-3 mani per tutte le superfici in legno dell'apparato della trave di equilibrio |
| Finitura trasparente | Wattle Estapol | Poliuretano opaco | Mano singola per tutte le travi. Doppio strato per tutte le altre superfici dell'apparecchio della trave di equilibrio |
| Schiuma, materiale | di imballaggio Per attutire eventuali cadute dalla trave di equilibrio | ||
| 70% Etanolo, tovaglioli di carta Trave | pulita e scatola della porta tra ogni animale. | ||
| Garze/tovaglioli di | Per rivestire il pavimento della porta | ||
| casa del mouse (dalla gabbia di casa) |
Riferimenti
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