Articolo metodologico
Qui viene descritta una procedura per ottenere lunghi tratti di registrazione corrente da un canale ionico con la tecnica patch-clamp cell-attached. Questo metodo permette di osservare, in tempo reale, il modello di apertura-chiusura conformazioni di canale che stanno alla base del segnale biologico. Questi dati informano sulle proprietà dei canali nelle membrane biologiche inalterate.
Proteine canale Ion sono dispositivi universali per la comunicazione veloce attraverso le membrane biologiche. La firma temporale del flusso di ioni generano dipende dalle proprietà intrinseche di ciascuna proteina canale così come il meccanismo attraverso il quale è generato e controllato e rappresenta un'importante area di ricerca corrente. Informazioni sulle dinamiche operative delle proteine del canale ionico può essere ottenuta osservando lunghi tratti di corrente prodotte da una singola molecola. Qui descritto è un protocollo per ottenere patch-clamp registrazioni di corrente di un canale Cell-attached per una gated canale ionico ligando, il recettore NMDA, espresso eterologamente in cellule HEK293 o nativo in neuroni corticali. Sono fornite anche le istruzioni su come adattare il metodo per gli altri canali ionici di interesse presentando l'esempio del canale PIEZO1 meccano-sensibili. Questo metodo può fornire dati riguardanti le proprietà conduttanza del canale e la sequenza temporale di opeconformazioni n chiusi che compongono il meccanismo di attivazione del canale, contribuendo così a capire le loro funzioni in materia di salute e di malattia.
Comunicazione veloce attraverso le membrane biologiche si basa quasi esclusivamente su oligomeriche formanti pori proteine di membrana, comunemente indicato come canali. Queste proteine sono molto diverse in segnali di attivazione, meccanismi di gating, e le proprietà di conduttanza. Proteine canale cui pori sono selettivi per ioni sono classificati come canali ionici; la loro attivazione produce correnti ioniche attraverso la membrana, e le risposte possono essere registrati con alta risoluzione in tempo reale utilizzando tecniche elettrofisiologiche. I segnali di attivazione abbracciano una vasta gamma di input chimici e fisici, tra cui gradienti di concentra....
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1. Coltura cellulare e proteine Expression
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Ricombinante NMDA recettori
Recettori NMDA legano e rispondere all'azione concomitante di due co-agonisti: glutammato e glicina. Si assemblano come heterotetramers di due glicina vincolanti subunità GluN1 e vincolante subunità GluN2 due glutammato. Subunità GluN2 sono codificate da quattro geni (AD) e di questi le forme più ampiamente trascritti nel cervello sono GluN2A in adulti e GluN2B negli animali giovani. A causa della diversità dei sottotipi del recettore NMDA in .......
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Nel campo canale ionico, un area di ricerca è dedicata alla comprensione della sequenza di eventi che conduce al canale meccanismo di apertura o gating del canale. Per la maggior parte dei canali, questo processo è complesso e prevede diversi passaggi cinetici che non possono essere dedotti da un segnale multicanale macroscopico. Al contrario, gli esperimenti possono essere progettati in cui osservando la sequenza di eventi aperti / chiusi in record di singolo canale può produrre informazioni più dettagliate su gating m.......
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Gli autori di questo manoscritto dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Questo lavoro è stato supportato da F31NS086765 (KAC), F31NS076235 (MAP), e R01 NS052669 (GKP) e EIA9100012. Gli autori ringraziano Eileen Kasperek per la competenza e l'assistenza con la biologia molecolare e la cultura dei tessuti; e Jason Myers per la condivisione dei dati ottenuti dai primi neuroni corticali prefrontali.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Prodotti chimici | Sigma | Vari | |
| Vetro Borosillicato | Sutter | BF-150-86-10 | |
| Microscopio invertito a campo chiaro | Olympus | 1x51 | Nikon ha anche microscopi simili |
| Scatola | fluorescente X-cite | Serie 120 | |
| Guida di luce | liquida X-cite | OEX-LG15 | |
| Micromanipolatore | Sutter Instruments | MP-225 | |
| Oscilloscopio | Tektronix | TDS1001 | |
| Amplifier | Molecular Devices Axon | Axopatch 200B | |
| Tavolo | TMC | 63561 | |
| Scheda NIDAQ | National Instruments | 776844-01 | |
| Estrattore | Narishige | PC-10 | |
| Lucidatrice | Narishige | Microforge MF-830 | |
| Gabbia di Faraday | TMC | 8133306 | |
| Morsetto a pressione ad alta velocità | ALA Scientific Instruments | ALA HSPC | |
| Pompa a pressione/vuoto | ALA Scientific Instruments | ALA PV-PUMP | Per HSPC-1 |
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