Viene presentato un metodo per misurare la velocità del flusso sanguigno microcircolatorio nelle metastasi del cancro polmonare della superficie pleurica nei ratti in modo automatizzato, utilizzando la microscopia intravitale polmonare a torace chiuso. Questo modello ha il potenziale per essere utilizzato come strumento diffuso per eseguire ricerche fisiologiche sulle metastasi polmonari nei roditori.
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Articolo metodologico
Automated Misura di microcircolatorio Portata in polmonare Metastasi di Ratti
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Poiché il polmone è un importante organo bersaglio della malattia metastatica, i modelli animali per studiare la fisiologia delle metastasi polmonari sono di grande importanza. Tuttavia, ad oggi esistono pochissimi metodi per studiare le metastasi polmonari in modo dinamico a livello microcircolatorio, a causa della difficoltà di accedere al polmone con un microscopio. Qui, viene presentato un metodo di microscopia intravitale per visualizzare e quantificare funzionalmente la microcircolazione delle metastasi polmonari superficiali nei ratti, utilizzando una finestra polmonare a torace chiuso e l'analisi automatizzata della velocità e della direzione del flusso sanguigno. L'utilità di questo metodo è dimostrata per misurare l'aumento della velocità del flusso sanguigno in risposta all'intervento farmacologico e per visualizzare la ben nota vascolarizzazione tortuosa dei tumori solidi. Questa è la prima dimostrazione di microscopia intravitale su metastasi polmonari in un modello a torace chiuso. A causa della sua invasività ridotta al minimo, nonché della sua relativa facilità e praticità, questa tecnologia ha il potenziale per sperimentare un uso diffuso nei laboratori specializzati nella ricerca sui tumori polmonari.
Introduzione
Il polmone è uno degli organi bersaglio più importanti della malattia metastatica e, poiché questa condizione è difficile da trattare con successo con la chemioterapia e la radioterapia, una cura è ancora rara1,2. Caratteristiche fisiopatologiche e microcircolatorie specifiche dei tumori solidi primari e metastatici, come l'ipossia microregionale, la limitazione della diffusione e l'inefficiente vascolarizzazione tumorale, contribuiscono notevolmente alla loro resistenza al trattamento antitumorale3,4. A causa della scala microscopica e della natura dinamica di parametri come il flusso sanguigno microvascolare, la microscopia intravitale del tumore nell'animale vivente è diventata uno strumento di ricerca molto importante nel campo5. Mentre i modelli di microscopia intravitale sono stati applicati a tumori in diverse sedi di organi, incluso il polmone metastatico all'interno di una gabbia toracica aperta, non è stato ancora sviluppato alcun protocollo per la ricerca di metastasi polmonari in un ambiente toracico chiuso fisiologicamente conservante6,7. Tale sforzo è particolarmente ostacolato dalla necessità di accedere chirurgicamente alla gabbia toracica senza compromettere la funzione complessiva delpolmone 7-9. Recentemente, è stato introdotto un metodo per l'imaging del flusso sanguigno microcircolatorio polmonare in un ambiente a torace chiuso in ratti vivi, utilizzando la microscopia intravitale a fluorescenza10. Questo protocollo consente la quantificazione sistematica della velocità del flusso sanguigno da globuli rossi iniettati e marcati in fluorescenza, utilizzando l'analisi computerizzata, mantenendo l'animale fisiologicamente stabile e preservando l'integrità del polmone11. In questo studio, viene mostrato come questa tecnologia possa essere modificata per visualizzare e quantificare il flusso sanguigno microcircolatorio nelle metastasi polmonari inoculate con vena caudale sulla superficie pleurica nel ratto immunocompromesso. Questo modello è anche il primo a studiare i tumori polmonari metastatici in un contesto di microscopia intravitale a torace chiuso.
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Protocollo
NOTA: Tutte le procedure sugli animali relative descritte in questo protocollo sono stati precedentemente approvati dal Institutional Animal Care and Use Committee Duke University (DUIACUC).
1. Cancer Cell Culture e iniezione
- Coltivare cellule tumorali metastatiche fluorescente (ad esempio le cellule del cancro al seno MDAMB231-GFP umani, dono di Dr. Patricia Steeg, NCI, e le cellule del mouse sarcoma YFP-etichettati, dono del Dr. David Kirsch, Duke University Medical Center, Dipartimento di Radioterapia Oncologica) in appropriato terreno di coltura (per es Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina / streptavidina) a 37 ° C fino a circa il 90% confluenti.
- Trypsinize cellule, lavarli 2 volte con PBS, contare, e poi iniettarli nelle vene coda di isoflurano-anestetizzato 10 settimane ratti nudi femminili a 5 milioni di cellule per animale, usando una siringa con un ago 27 G. Anesthes livello chirurgiciia viene verificata dalla mancanza di reazione al pizzico punta.
2. Monitoraggio delle metastasi Uso microCT
- Esaminate ratti volta alla settimana usando un micro-CT / micro-irradiatore, per rilevare la presenza di metastasi sopra di circa 2 mm di diametro di diametro. Il micro-CT è incaricato come descritto in precedenza 12.
- Ratti soggetto a 3% isoflurano anestesia prima di imaging. Confermare profonda anestesia pizzico punta.
- Dopo insorgenza dell'anestesia, trasferire rapidamente i ratti alla culla di imaging nella camera di imaging e connettersi tramite un naso-cono per una miscela isoflurano-aria a 2,5-3%. Regolare la posizione del ratto in culla in modo che il suo torace è in posizione nel fascio di fotoni dello scanner microCT, utilizzando i comandi di posizione esterni e delimitatore laser sul supporto imaging. Assicurarsi che la porta della camera di imaging è chiusa, per proteggere l'investigatore dai raggi gamma.
- Controllare la posizione dell'animale utilizzando nuovamentela telecamera a colori. Eseguire un test di imaging CT a bassa risoluzione, e utilizzare l'immagine risultante per regolare il campo visivo alle dimensioni XYZ della cavità toracica.
- Immagine torace topo usando un filtro Al 2 mm 40 kVp, 2,5 mA, e 0.008 voxel a 7 FPS e rispedire l'animale nella sua gabbia. Imaging di un animale dovrebbe prendere non più di 15 o 20 minuti. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
- Conferma metastasi dalla comparsa di oggetti relativamente radiopachi che non può essere spiegato da vasi sanguigni intratoracica (Figura 1A)
Chirurgia 3. Finestra Camera
- Anestesia, segni vitali e cateterizzazione coda vena
- Selezionare gli animali con la presenza di malattia metastatica. Iniettare animale con un d intraperitonealeose di 50 mg / kg pentobarbital. Conferma a livello chirurgico anestesia pizzico punta prima di procedere.
Nota: i protocolli di anestesia dovrebbero essere abbinati al rispettivo apparato sperimentale. Pentobarbital stato scelto qui come anestetico ad azione prolungata, per indurre anestesia profonda per lunghe procedure, offrendo la possibilità di facile ri-somministrazione. Tuttavia, la perdita di animali da sovradosaggio è un problema comune con anestesia pentobarbital. Un'altra opzione che conserva riflessi autonomi in misura maggiore di pentobarbital è ketamina in combinazione con sedativi come la xilazina o medetomidina, che però consente solo per un singolo ciclo di ri-dosaggio. - Rasatura animali sul lato del corpo che ha la malattia metastatica, e nella zona del collo, utilizzando un clipper. Rimuovere tutti i restanti capelli sciolti dalla pelle. Dopo capelli sciolti viene rimosso, applicare una pomata veterinari per gli occhi, per evitare che si secchi.
NOTA: i topi nudi atimici possono avere capelli residuo requirimozione res prima di procedere con procedure chirurgiche. E 'molto importante rimuovere completamente tutti i capelli, come può interferire con le procedure chirurgiche e di imaging. - Fissare l'animale in posizione supina su una piastra di metallo che è posto su una piastra elettrica dell'acqua 37 ° C circolare. Le estremità anteriori e posteriori sono fissati sulla piastra con nastro.
NOTA: E 'utile per controllare e registrare i segni vitali, come i tassi di cuore e sangue arterioso ossigenazione utilizzando un pulsossimetro, durante le procedure chirurgiche e sperimentali.
- Selezionare gli animali con la presenza di malattia metastatica. Iniettare animale con un d intraperitonealeose di 50 mg / kg pentobarbital. Conferma a livello chirurgico anestesia pizzico punta prima di procedere.
- L'intubazione tracheale
- Per posizionare un catetere per la ventilazione dell'animale, prima una incisione cutanea cervicale trasversale, seguita dalla separazione mediana della muscolatura ventrale longitudinale alla trachea.
- Utilizzare ripetuta azione di apertura a chiusura con una pinza taglienti per creare un passaggio per la sutura attraverso il lato dorsale della trachea.
- Fai una piccola incisione nella trachea su tegli lato ventrale, non superiore semicircolare, circa tra il secondo e il terzo anello tracheale. Lasciare sufficientemente lunga porzione della trachea esposta sulla superficie dorsale, per consentire il fissaggio del catetere tracheale.
- Inserire una 2,5-3,0 mm "Y" cannula tracheale nella trachea, e stringere con una sutura 4-0 monofilamento. Verificare la cannula è collegata ad un ventilatore ciclato a pressione con una bottiglia collegata al condotto di scadenza che viene riempito con 6 cm di acqua, per mantenere la pressione polmonare positiva. Flusso gas deve essere al 100% di ossigeno, a meno che sperimentalmente desiderato altrimenti.
- Inserire un catetere con un ago G 25-27, e riempito di soluzione fisiologica eparinizzata in una delle vene coda di ratto, e fissare in posizione con nastro.
NOTA: Assicurare la pervietà del catetere vena della coda per tutta la procedura iniettando ripetutamente una piccola quantità di soluzione fisiologica eparinizzata nella vena della coda. Inoltre, intubazione oro-tracheale, cioè la guida di un trachealetubo attraverso la bocca dell'animale anestetizzato e passato laringe nella trachea, è una possibile alternativa alla procedura tracheotomia descritta qui. Tuttavia, questo metodo richiede formazione e dell'esperienza specifica, per evitare danni alla trachea, e anche per impedire la cannulazione accidentali dell'esofago.
- Applicazione della finestra polmonare
- Rimuovere la pelle dal lato del torace in cui si trova la malattia metastatica, creando una incisione, e poi staccare la pelle con dissezione smussata.
Nota: La pelle può essere eliminata e rimossa successivamente al distacco - Procedere sezionando i due strati di muscolatura sovrapposizione (pettorale, dentato, e gran dorsale), ma lasciando intatti i muscoli intercostali. Creare una perforazione nella cavità toracica di circa 1,5 cm di diametro, rimuovendo porzioni tipicamente due nervature adiacenti. Idealmente, individuare la perforazione della regione della sesta e settima ribs.
- Osteotomia:
- Per ridurre al minimo il sanguinamento e danni alla superficie del polmone, ermeticamente tenere la nervatura da tagliare con dentate pinza chirurgica durante il taglio. Usando forbici chirurgiche, tagliare il lato mediale della nervatura prima, con un angolo di circa 45 °, lasciando la parte appuntita della costola rimanente indica all'esterno.
- Successivamente, tagliare la parte laterale della costola in modo simile, lasciando ancora la parte appuntita della costola punta verso l'esterno, per evitare danni alla superficie del polmone.
- Ripetere la procedura per la nervatura adiacente, quindi tagliare i muscoli intercostali e togliere il pezzo asportato. Durante questa procedura, mantenere la pressione polmonare in modo che l'interazione meccanica tra la superficie polmonare e la gabbia toracica è minimizzato. Per fare ciò, opportunamente regolare la pressione ispirazione sul ventilatore.
- Inserimento della finestra:
- Inserire una finestra polmone misura, costituito da un coprioggetti che èattaccato ad una presa plexiglas (Figura 1B). Fissare la finestra alla presa mediante incollaggio, oppure applicando una piccola quantità di grasso per vuoto. Inserire la finestra in modo che le metastasi superficiali sono situati vicino al centro della finestra. Se necessario, regolare il foro inserito per portare la micrometastasi al centro della finestra allargando leggermente il foro al rispettivo lato.
NOTA: La malattia metastatica sulla superficie pleurica può essere identificato come puntini bianchi chiaramente riconoscibili o aree all'interno delle parti altrimenti rosa-a-salmone colorati sani della superficie polmonare che appaiono prevalentemente lungo le fessure. Mentre micrometastasi possono verificarsi in altri settori dell'esterno pleurico, le linee cellulari esaminati mostrano quasi sempre affioramento micrometastasi nell'area perforata, una volta metastasi può essere rilevato radiologicamente. - Dopo aver inserito la presa nella perforazione, e creando il contatto diretto con la pleura viscerale lung, suturare i bordi della cornice della finestra al muscolo intercostali circostante, utilizzando 4,0 sutura monofilamento (Figura 1C). Utilizzare un leggero aumento della pressione di inspirazione del ventilatore per aiutare aria residua di fuggire e per creare una tenuta.
Nota: Il tasso di respirazione di ratti può variare notevolmente, a seconda dello stato di anestesia, lo stato di eccitazione o ansia, concentrazione di ossigeno dell'aria inspirata (FiO2), ecc E 'consigliabile regolare la frequenza respiratoria tra 70 e 90 bpm. La pressione ispirazione deve essere regolata con cautela e non può essere impostato a più di ca. 8 centimetri H 2 O (0,6 mmHg), per evitare danni alla superficie del polmone.
- Inserire una finestra polmone misura, costituito da un coprioggetti che èattaccato ad una presa plexiglas (Figura 1B). Fissare la finestra alla presa mediante incollaggio, oppure applicando una piccola quantità di grasso per vuoto. Inserire la finestra in modo che le metastasi superficiali sono situati vicino al centro della finestra. Se necessario, regolare il foro inserito per portare la micrometastasi al centro della finestra allargando leggermente il foro al rispettivo lato.
- Posizionare l'animale in un dispositivo di immobilizzazione progettato su misura che è progettato per eliminare Z-direzionale movimento (Figura 1D) su una piastra di acciaio che è posizionato su un termostatica (elettrica) termocoperta, sotto un microscopio a fluorescenza. Controllare il corpo dell'animaletemperatura con un termistore rettale. Regolare le viti del dispositivo di immobilizzazione degli animali, e la pressione di inspirazione del ventilatore per ottenere il controllo ottimale di movimento laterale.
Nota: la respirazione naturale in mammiferi coinvolge tutte e tre le direzioni di movimento del polmone e l'estensione del torace: bilaterali, dorso-ventrale, e cranio-caudale. Per preservare il movimento respirazione naturale per quanto possibile, è importante minimizzare la compressione Z-direzionale nella misura necessaria. Poiché il sistema di ritenuta Z-dimensionale ha il potenziale per introdurre artefatti che possono influenzare il flusso di sangue e altri parametri, si consiglia di mantenere le condizioni di costante durante serie di misure ripetute dello stesso animale.
- Rimuovere la pelle dal lato del torace in cui si trova la malattia metastatica, creando una incisione, e poi staccare la pelle con dissezione smussata.
4. Imaging e misurazione del flusso sanguigno Microcircolatoria
- Raccogliere i globuli rossi tramite puntura cardiaca ed etichettarli con DII (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 perclorato =, 3 = tetrametil-indocarbocyanine), come descritto in precedenza 10.
- Iniettare 300 ml di globuli rossi marcati nella vena della coda del topo prima dell'intervento camera di finestra è fatta, per evitare effetti primo passaggio adesione alla finestra di vetro. Eliminare eventuali bolle d'aria nella siringa o del catetere, come introduzione di aria nella vena inibirà ulteriori iniezioni.
- Immagine flusso di sangue con una telecamera CCD microscopio a -40 ° C di temperatura di raffreddamento di chip, e circa 100X risoluzione complessiva (cioè con un obiettivo microscopio 10X, 10X e pre-camera oculare). Utilizzare set di filtri Rhodamine / TRITC normali (eccitazione 450-490 nm, emissione> 515 nm). Registrare il frame rate e pixel la risoluzione effettiva delle sequenze di immagini risultanti. Record di almeno 200 (idealmente circa 300) le immagini per stack, per garantire l'analisi di successo della velocità del flusso.
- Rifornire perdita di liquidi negli animali iniettando circa 1 ml di soluzione fisiologica ip ogni hr.
NOTA: Le impostazioni sperimentali che coinvolgono un intervento, ad esempio,un farmaco che modifica la velocità del flusso sanguigno in una metastasi del cancro polmonare, richiede misurazioni ripetute di velocità del flusso sanguigno nel tumore metastatico polmonare. Per questi esperimenti estesi, è importante ricostituire l'animale con sufficiente liquido. - Euthanize animali per infusione di 3 ml di 3N KCl nella vena della coda
- Valutare le pile di immagini utilizzando una pubblicazione, pubblicamente disponibile algoritmo computer basato su Matlab che creerà il flusso di velocità in scala di grigi ea colori codificati mappe per tutto il flusso di sangue tracce 10,11. Successivamente valutare le risultanti immagini in scala di grigi utilizzando software di analisi dell'immagine commerciale o pubblicamente disponibili, come ad esempio Immagine J, dopo thresholding off valori che indicano nessun movimento di cellule del sangue, cioè non vascolare attiva.
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Risultati
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Discussione
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il parere scientifico dei dottori Timothy McMahon e Siqing Shan è apprezzato. I relatori ringraziano i dottori David Kirsch e Patricia Steeg per il generoso dono rispettivamente delle cellule metastatiche del sarcoma di topo marcate in fluorescenza e delle cellule MDAMB-231 metastatiche. Questo lavoro è stato finanziato in parte dalla Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) degli Stati Uniti Prime Award Number N66001-10-C-2134 e in parte dal Dipartimento di Radioterapia Oncologica, Duke University Medical Center.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ratti nudi atimici | Charles River | Codice ceppo 316 | Ratti nudi atimici femmina di 10 settimane |
| micro-CT/micro-Irradiator | Raggi X di precisione Inc. | Xrad 225Cx | Utilizzare MicroCT per rilevare metastasi |
| DiI (1,1=-dioctadecil-3,3,3=,3=-tetrametil-indocarbocianina perclorato) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Mescolare 100 ul di globuli rossi impacchettati con 100 ul di 0,5 mg/ml di DiI in etanolo a 200 prove, 2 ml di soluzione di destrosio al 5% in acqua e riempire fino a un volume finale di 10 ml con soluzione salina |
| Ventilatore per roditori | Kent Scientific | TOPO Ventilatore | per piccoli animaliIl dispositivo è importante per mantenere la pressione polmonare positiva dopo l'applicazione dello pneumotorace |
| Microscopio a fluorescenza verticale Zeiss Axioskop | Zeiss | Axioskop | per imaging intravitale |
| Telecamera CCD Andor Telecamera CCD | Andor | iXonEM 885 | per l'imaging dal vivo del flusso sanguigno |
| Pulsossimetro | StarrLife | MouseOx | Pulsossimetro |
| Microscopio | a fluorescenzaMicroscopio a | fluorescenza | Axioskop |
Riferimenti
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