Introduzione di piccole molecole, allo sviluppo di Drosophila embrione offre un grande potenziale per la caratterizzazione dell'attività biologica di nuovi composti, farmaci e tossine, nonché per sondare percorsi di sviluppo fondamentali. I metodi qui descritti delineano misure che superano le barriere naturali di questo approccio, ampliando l'utilità del modello di embrione di Drosophila.
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Articolo metodologico
Un metodo di Permeabilization di
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'embrione di Drosophila è stato a lungo un potente modello di laboratorio per chiarire i meccanismi molecolari e genetici che controllano lo sviluppo. La facilità di manipolazioni genetiche con questo modello ha soppiantato approcci farmacologici che sono comuni in altri modelli animali e saggi cellulari. Qui descriviamo i recenti progressi in un protocollo che consente l'applicazione di piccole molecole per la mosca della frutta in via di sviluppo dell'embrione. Il metodo dettagli passi per superare l'impermeabilità del guscio, pur mantenendo la vitalità dell'embrione. Guscio d'uovo permeabilizzazione attraverso una vasta gamma di stadi di sviluppo si ottiene con l'applicazione di una precedentemente descritto d-limonene embrione permeabilizzazione solvente (EPS 1) e gli embrioni di invecchiamento a temperatura ridotta (18 ° C) prima di trattamenti. Inoltre, l'uso di un colorante rosso lontano (CY5) come indicatore di permeabilizzazione è descritto, che è compatibile con le diverse applicazioni che coinvolgono influenza rosso e verde di seriecoloranti orescent in preparazioni dal vivo e fissi. Questo protocollo è applicabile a studi utilizzando composti bioattivi per sondare meccanismi di sviluppo e per gli studi volti a valutare l'attività teratogena o farmacologica di uncharacterized piccole molecole.
Introduzione
L'embrione Drosophila continua ad essere un modello di primo ministro per studio dei meccanismi fondamentali dello sviluppo 2. Questo potente modello è supportato da una vasta gamma di strumenti genetici molecolari che permettono manipolazioni essenzialmente qualsiasi gene in qualsiasi punto nel tempo e all'interno di qualsiasi organo in via di sviluppo. Le dimensioni ridotte, rapido sviluppo, e ampia caratterizzazione della morfogenesi di Drosophila ne fanno un modello di scelta per schermi genetici, molti dei quali hanno scoperto percorsi di sviluppo fondamentali 3,4. Numerosi fenotipi in Drosophila sono stat....
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Protocollo
1. Preparazione delle Culture Fly, soluzioni e dispositivi Embryo Handling
- Preparare una cultura gabbia di Drosophila. Mettere 500 + accoppiamento in linea del ceppo desiderato in una gabbia di popolazione dotata di una piastra di uva-agar 10 centimetri e un po 'di lievito in pasta. Mantenere la cultura in un incubatore controllata di 25 ° C umidità. Nota: Culture Cage richiedono un giorno o due di condizionamento per ottenere modelli di embrione posa coerenti. Piastre di uva con lievito in pasta vengono cambiati una volta al mattino e una la sera durante il condizionamento.
- Preparare EPS. Le soluzioni caldi di tensio....
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Risultati
Dispositivi di manipolazione degli embrioni sono raffigurati nella figura 1 per aiutare a visualizzare i dispositivi "fatti in casa" per la manipolazione nei protocolli di cui sopra. Risultati visto in Figura 2 illustrano l'effetto robusto di allevamento embrioni a 18 ° C sulla loro capacità di essere permeabilizzate da EPS in fase avanzata di sviluppo. Questa condizione è applicata nella fase protocollo 2.1. Efficacia dell'acido carbossilico colorante CY5 per rivelare.......
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Discussione
Il metodo di cui sopra delinea un mezzo per ottenere embrioni di Drosophila vitali che sono accessibili ai piccoli trattamenti molecola attraverso una vasta gamma di sviluppo. Questo metodo presenta il romanzo e semplice constatazione che l'invecchiamento embrioni a 18 ° C permette di permeabilizzazione di embrioni in fase avanzata con la stessa efficacia, come visto in precedenza solo negli embrioni in fase iniziale. Inoltre, l'uso del colorante CY5 acido carbossilico lontano rosso come indicatore di p.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da NIH/NIEHS R03ES021581 (assegnato a M.D.R.) e dal Centro di Salute Ambientale dell'Università di Rochester (NIH/NIEHS P30 ES001247).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Gabbia per mosche | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | richiede un ordine speciale | http://www.stepan.com/ |
| Alcool etossilato [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | chiama per ordine speciale | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (grado di purezza ultra elevata) | Florida Chemical Co. | invito per un ordine speciale | http://www.floridachemical.com/ |
| Ipoclorito di sodio" | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS polvere | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 acido carbossilico | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rete di nylon Nitex | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Membrana di ossigeno disciolto (DO) | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25 mm circolare n.1 vetrino coprioggetto | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Miscela di piastre di uva e agar | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
Riferimenti
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J. Drosophila blastoderm patterning. Curr Opin Gene....
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Ristampe e permessi
