Olfattive pattern di attivazione del recettore codificano identità odore, ma la mancanza di dati pubblicati identificativi ligandi odoranti per i recettori olfattivi dei mammiferi ostacola lo sviluppo di un modello completo di codifica odore. Questo protocollo descrive un metodo per facilitare l'identificazione ad alta produttività di ligandi dei recettori olfattivi e quantificazione di attivazione del recettore.
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Articolo metodologico
High-throughput Analisi dei mammiferi olfattive Recettori: Misurazione del recettore Attivazione tramite Luciferase Activity
In questo articolo
Sommario
Abstract
Odoranti di creare modelli unici e sovrapposte di attivazione del recettore olfattivo, permettendo una famiglia di circa 1.000 murino e 400 recettori umani di riconoscere migliaia di odoranti. Ligandi odoranti sono stati pubblicati da meno di 6% di recettori umani 1-11. Questa mancanza di dati è dovuta in parte alle difficoltà funzionalmente esprimono questi recettori in sistemi eterologhi. Qui, descriviamo un metodo per esprimere la maggior parte della famiglia dei recettori olfattiva in cellule Hana3A, seguita da valutazione ad alta velocità di attivazione del recettore olfattivo utilizzando un saggio reporter di luciferasi. Questo test può essere utilizzato per (1) pannelli schermo di odoranti contro pannelli di recettori olfattivi; (2) confermare l'interazione odorizzante / recettore tramite curve dose-risposta; e (3) confrontare i livelli di attivazione del recettore tra le varianti del recettore. Nei nostri dati di esempio, 328 recettori olfattivi sono stati proiettati contro 26 odoranti. Coppie di odorizzante / recettori con diversi punteggi di risposta erano selezioneted e testato in dose-risposta. Questi dati indicano che uno schermo è un metodo efficace per arricchire per coppie odorizzante / recettore che passeranno un esperimento dose-risposta, cioè recettori che hanno una risposta bona fide a un odorizzante. Pertanto, questa high throughput saggio luciferasi è un metodo efficace per caratterizzare olfattiva recettori-un passo essenziale verso un modello di codifica odore nel sistema olfattivo dei mammiferi.
Introduzione
Il sistema olfattivo dei mammiferi ha la capacità di rispondere ad un vasto numero di stimoli odorosi, consentendo la rilevazione e la discriminazione di migliaia di odoranti. Recettori olfattivi (OR) sono i sensori molecolari espressi dai neuroni sensoriali olfattivi nell'epitelio olfattivo 12. Riconoscimento odore dei mammiferi avviene attraverso l'attivazione differenziale delle RUP di odoranti, e l'OR famiglia di geni è ampia, con circa 1.000 murino e 400 recettori umani 12-16. Analisi funzionali precedenti di RUP nei neuroni olfattivi e nelle cellule eterologhe hanno dimostrato che diversi odoranti sono riconosciuti da unico, ma....
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Protocollo
1. Coltura di cellule Hana3A
- Preparare supporti M10 completandolo mezzo minimo essenziale (MEM) con il 10% (v / v) di FBS.
- Cultura di manutenzione
- Mantenere le cellule in mezzi M10. NOTA: I vettori di espressione per RTP1L, RTP2, REEP1, e G αolf conferiscono resistenza puromicina alle cellule Hana3A, ma mantenendo le cellule con questo antibiotico non influenzano significativamente i risultati del test.
- Subculture con un rapporto di 01:08 a 10 centimetri piatti ogni 2-3 giorni.
- Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2.
2. Cellule placcatura per Transfezione
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Risultati
Uno schermo primario testato 328 RUP contro 26 odori ad una concentrazione di 100 mM. Questa concentrazione di odore è stato dimostrato per attivare efficacemente una grande proporzione di RUP con ligandi noti 10. In primo luogo, l'attività della luciferasi normalizzata è stata calcolata dividendo la lettura luciferasi lucciola dalla lettura Renilla luciferasi. Successivamente, i valori baselined sono stati calcolati sottraendo le letture luciferasi normalizzati per il controllo senza odore dalle.......
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Discussione
Identità odorizzante è codificato da olfattivi pattern di attivazione del recettore, ma pattern di attivazione del recettore, tra cui i recettori che vengono attivati e in che misura, sono noti da meno di 6% dei recettori olfattivi umani 1-11. Gli sforzi per caratterizzare i recettori olfattivi sono stati limitati dai loro metodi o applicabilità alta intensità di lavoro solo a un sottoinsieme della olfattivo 17,23,24,33,34 famiglia di recettori. Il sistema di espressione eterologo Hana3A supporta.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da DC013339 R01, R03 DC011373, e Ruth L. Kirschstein Servizio National Research Award T32 DC000014. Una parte del lavoro è stato eseguito utilizzando il Monell chemosensory Receptor segnalazione core, che è supportato, in parte, da un finanziamento della P30 DC011735 NIH-NIDCD core Grant. Gli autori ringraziano C. Sezille aiuto con la raccolta dei dati.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Celle Hana3A | Disponibili presso il Laboratorio Matsunami su richiesta | ||
| RTP1S-pCI | Disponibili presso il Laboratorio Matsunami su richiesta | ||
| M3-R-pCI | Disponibili presso il Laboratorio Matsunami su richiesta | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimo supporto essenziale, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (senza Ca2+ e Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS |
| Tripsina (0,05% tripsina EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96-well PDL piastra bianca/trasparente | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Reagente di trasfezione lipidica: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrato, lucciola luciferase quencher/Renilla luciferase substrato: Dual-Glo Assay | Promega E2980 | dual glo | |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2 |
| Software per lettore di micropiastre: Software di analisi dati Gen5 | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300 μ l GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5 μ l GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300 μ l GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5 μ l GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en& region=US">DMSO |
| Forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
Riferimenti
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (199....
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Ristampe e permessi
