Un Ex vivo Cultura sistema per studiare lo sviluppo della tiroide

Sommario

Questo protocollo descrive la dissezione dell'anlagen tiroideo embrionale di topo e la coltura di espianti su filtri semiporosi o su vetrini plastici per microscopia. Questo sistema è ideale per studiare gli eventi morfogenetici o di differenziazione che si verificano durante lo sviluppo tiroideo di embrioni wild type o knockout ed è suscettibile di esperimenti di guadagno e perdita di funzione.

Abstract

La tiroide è una ghiandola endocrina bilobated localizzata alla base del collo, producendo gli ormoni tiroidei T3, T4, e calcitonina. T3 e T4 sono prodotti da tireociti differenziati, organizzati in sfere chiusi chiamati follicoli, mentre calcitonina è sintetizzato dalle cellule C, intervallati tra i follicoli e una fitta rete di capillari sanguigni. Sebbene architettura tiroide adulto e funzioni sono state ampiamente descritte e studiato, la formazione delle unità "angio-follicolari", la distribuzione delle cellule C nel parenchima e le comunicazioni paracrini tra cellule epiteliali ed endoteliali è lungi dall'essere compresa.

Questo metodo descrive le fasi sequenziali di topo tiroide embrionale anlagen dissezione e la sua cultura sui filtri semiporoso o su scivoli di plastica microscopia. Entro un periodo di quattro giorni, questo sistema di coltura riassume fedelmente nello sviluppo della tiroide vivo. Infatti, (i) bilobation dell'organo verifica (per espianti E12.5), (ii) tireociti precursori organizzano in follicoli e polarizzano, (iii) tireociti e C-cellule si differenziano, e (iv) le cellule endoteliali presenti nel tessuto microdissezione proliferano, migrano nella lobi tiroidei, e strettamente associano con le cellule epiteliali, come fanno in vivo.

Tessuti tiroidei possono essere ottenute da wild type, knockout o embrioni transgenici fluorescenti. Inoltre, espianti coltura può essere manipolato per aggiunta di inibitori, bloccando anticorpi, fattori di crescita, o anche cellule o mezzo condizionato. Ex vivo sviluppo può essere analizzato in tempo reale, o in qualsiasi momento della coltura mediante immunoistochimica e RT-qPCR.

In conclusione, la cultura espianto tiroide combinato con a valle intera-mount o su sezioni di imaging e di espressione genica fornisce un potente sistema per manipolare e studiare morfogenetiche e differenziazione eventi della tiroide organogenesis.

Introduzione

La tiroide è una raccolta di sfere epiteliali indipendenti, chiamati follicoli, circondato da una fitta rete di capillari endoteliali. Questa organizzazione permette la funzione della tiroide: i capillari endoteliali forniscono tireociti con iodio, necessari per T3 e T4 sintesi degli ormoni, e distribuire questi ultimi a tutto il corpo. Sparsi tra i follicoli e dei capillari, C-cellule producono l'ormone calcitonina hypocalcemic ^1. Anche se l'architettura della tiroide adulti e le funzioni sono ben noti, i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella tiroide sviluppo embrionale (formazione del follicolo e differenziazione) sono lungi dall'essere compreso.

Durante l'embriogenesi, tireociti progenitore nasce come un ispessimento (anlage linea mediana) della parete ventrale del endoderma foregut al giorno embrionale (e) 8,5 nell'embrione topo, mentre cellule C progenitori origine a E11.5 come sporgenze a forma di gocciolina ( bo ultimobranchialmuore), della quarta tasche faringee ^2-6. La gemma linea mediana stacca quindi dal endoderma, si espande bilateralmente a fondere a E13.5 con gli organi ultimobranchial su ogni lato della trachea. Infine, tireociti organizzano in follicoli e C-cellule si differenziano.

Le conoscenze attuali sulla formazione tiroide proviene principalmente da analisi istologica dei tessuti fissi, ma gli eventi morfogenetici coinvolti nella formazione tiroide sono altamente dinamico e coinvolgere comunicazioni e le interazioni tra diversi tipi di cellule e con la matrice extracellulare. Lavoro recente ha dimostrato che progenitori tireocita producono alti livelli di VEGF per reclutare cellule endoteliali alla tiroide sviluppo, e, a sua volta, reclutati cellule endoteliali promuovere la formazione del follicolo e cellule C differenziazione ^7.

La maggior parte degli studi ex vivo sulla tiroide sono stati effettuati su cellule isolate adulte tiroide-derivato, coltivate in 2D coltura tissutale di plastica drocchie o in matrici 3D. L'utilizzo di questi tipi di culture, le cellule follicolari differenziate o rimanere polarizzata e organizzate come i follicoli o riacquisire un organismo 3D ^8-10. Tuttavia, queste cellule epiteliali puri, espiantati dal loro ambiente fisiologico, e coltivate in 2D, ignorano interazioni con matrice extracellulare, citochine, fattori di crescita e con altri tipi cellulari, quali le cellule endoteliali o nervi che normalmente incontrano in vivo. Un bel studio recentemente descritto un protocollo di differenziazione delle cellule staminali in follicoli tiroidei con un passo di coltura in 3D matrigel ^11. Tuttavia, queste culture 3D mancano contatto con altri tipi di cellule.

Sulla base delle esperienze precedenti su pancreas e ghiandole salivari cultura d'organo ^12-14, un metodo per la dissezione del mouse embrionali anlagen tiroide e coltivando gli espianti sui filtri semiporoso o su scivoli di plastica microscopia stato sviluppato.

Quandolavorare con embrioni E12.5, la doppia origine del abbozzi tiroide (il anlage linea mediana e due corpi laterali ultimobranchial) ha imposto la microdissezione di un grande frammento di tessuto. Questo conteneva la trachea, ma non l'esofago, ed esteso dalle arterie arco faringeo fino a soffiatura aritenoidea. Quando coltivate su filtri, la anlage linea mediana si estende lateralmente su ciascun lato della trachea, dove si fondono con gli organi ultimobranchial per formare i due lobi tiroidei, ancora collegati da uno stretto istmo.

Nella cultura, cellule epiteliali proliferano, organizzano in follicoli e si differenziano in tireociti e cellule C, a seconda della loro origine. Le cellule endoteliali contenute nel tessuto microdissezione anche proliferano e invadono i lobi tiroidei associare finalmente stretto contatto con la struttura follicolare epiteliale, indipendentemente flusso sanguigno o fattori circolanti. Come sviluppo degli espianti riassume fedelmente in vivo svilupparezione, questo sistema di coltura è ottimale per studiare morfogenetica e gli eventi che si verificano durante lo sviluppo differenziazione tiroidea.

Tessuti tiroidei possono essere ottenute da wild type, knockout o embrioni transgenici fluorescenti, e il sistema cultura è suscettibile di perdita e di guadagno-di-funzione esperimenti. Infine, time-lapse imaging di espianti tiroidei fluorescente su piatti di plastica microscopia potrebbe essere sfruttata per studiare meglio la cinetica e la continuità dei movimenti morfogenetici che si verificano in vivo. Time-lapse imaging è già stata utilizzata per studiare branching morfogenesi del pancreas ^15,16 o la gemma ureterale ^17.

Protocollo

I topi sono stati allevati e trattati secondo i principi della cura degli animali da laboratorio della commissione per il Benessere degli Animali University. Tutte le procedure e protocolli sono stati approvati dal comitato.

1. Rivestimento di Microscopia plastica Cultura Chambers

NOTA: Eseguire tutte le seguenti operazioni in condizioni di sterilità in una cappa a flusso laminare. I due tipi di rivestimento sono funzionalmente equivalenti.

1. Cappotto di plastica camere di coltura con fibronectina un giorno prima l'isolamento dei tessuti tiroidei:
   1. Diluire fibronectina sterile ad una concentrazione finale di 50 mg / ml in M199 mezzo supplementato con 100 U / ml di penicillina, 100 pg / ml streptomicina, 0,25 mg / ml fungizone e glutammina 2 mM ^12.
   2. Coprire i pozzetti con 200 ml di fibronectina diluito e incubare una notte in un 4 ° C frigorifero.
   3. Il giorno della dissezione, aspirare la fibronectina, lavare i pozzetti una volta con M199 e aggiungere un volume minimo di 200 ml di M199 addizionato con antibiotici, glutamina e siero di vitello fetale al 10%.
   4. Lasciare le camere rivestite in incubatrice fino al momento piastra espianti.
2. Cappotto di plastica camere di coltura con collagene di tipo I 2 ore prima l'isolamento dei tessuti tiroidei:
   1. Diluire tipo sterile collagene ad una concentrazione finale di 50 mg / ml in HCl 10 mM. NOTA: Mantenere soluzione stock di collagene sul ghiaccio.
   2. Coprire i pozzetti con 200 ml di tipo diluito collagene e incubare per 2 ore a temperatura ambiente (RT).
   3. Aspirare il collagene di tipo I soluzione, lavare i pozzetti una volta con M199 e aggiungere un volume minimo di 200 ml di M199 addizionato con antibiotici, glutamina e siero di vitello fetale al 10%.
   4. Lasciare le camere rivestite in incubatrice fino al momento piastra espianti.

2. Dissezione della tiroide Anlagen contenenti tessuti (E12.5) o tiroide Lobi (E13.5-E14.5)

NOTA: Utilizzare strumenti di dissezione pulite e piastre di Petri / coltura. I passi generali e incisioni descritte qui sotto sono le stesse per E12.5 e E14.5 embrioni.

1. Sacrifica tempestive incinta topi di sesso femminile al embrionale desiderata (e) giornata (dalle E12.5 a E14.5) e rimuovere l'utero con strumenti di dissezione.
2. Posizionare l'utero sezionato in una piastra 10 cm contenente HBSS.
3. Tenere una estremità dell'utero con una pinza e aprire l'utero con piccole forbici per liberare progressivamente tutti gli embrioni.
4. Separare gli embrioni dalla placenta con le forbici e trasferire gli embrioni con i loro annessi embrionali in una nuova piastra 10 cm contenente HBSS.
5. Rimuovere il sacco vitellino e sacco amniotico. NOTA: Da questo punto, lavorare sotto uno stereomicroscopio con transilluminazione dal basso; aumentare l'ingrandimento a passi di dissezione. Utilizzare aghi di tungsteno in capillari di vetro come strumenti di dissezione.
6. Utilizzando gli aghi comeun coltello e forchetta, rimuovere la parte superiore della testa, compresa la mascella superiore e le orecchie (Figura 1A, tagliare lungo a).
7. Tenere l'embrione sul dorso e rimuovere prima un ulteriore pezzo di tubo neurale (Figura 1A, tagliare lungo b), allora la parte inferiore dell'embrione, appena sotto gli arti anteriori e sopra il cuore (Figura 1B).
8. Trasferire la fetta embrione contenente la lingua (per orientare il tessuto) e regione del collo in una nuova piastra 10 cm contenente HBSS.
9. Rimuovere il tubo neurale e tessuti posteriori per l'esofago / trachea (Figura 1C, tagliare lungo a).
10. Delicatamente sezione fetta tessuto lungo entrambi i lati della linguetta (Figura 1C, tagliare lungo b e b ').
11. Individuare l'esofago e trachea, nel prolungamento della lingua, e sezionare la lingua, lasciando il arytenoid gonfiore (Figura 1D, tagliare lungo a), e il tessuto sul both lati dell'esofago / trachea (Figura 1D, tagliare lungo b e b ').
12. Rimuovere l'esofago, e collocare la trachea con il lato ventrale rivolto verso l'alto.
13. Sezionare i tessuti indesiderati quali il timo (Figura 1E) e tutti i tessuti situati lateralmente alle arterie arco faringeo. Per E13.5 E14.5 embrioni o, visualizzare i lobi tiroidei su ogni lato della trachea (Figura 1F; linee tratteggiate rosse) e sezionare ulteriormente i lobi dalla trachea.
14. Trasferire la regione E12.5 trachea isolata, o lobi tiroidei E13.5-E14.5 in una piastra di coltura 35 millimetri contenente pre-riscaldato a medio M199 addizionato con antibiotici, glutamina e siero di vitello fetale del 10%. Trasferire espianti con una punta di filtro prewetted su un P-200 micropipetta. Per espianti E12.5, tagliare l'estremità della punta per allargare l'apertura. NOTA: Ordinariamente, e se gli embrioni hanno lo stesso genotipo, eseguire i passaggi 6 e 7 per tutti gli embrioni, lan 9-11, e infine 12 e 13.

3. Placcatura e Cultura della tiroide espianti

1. Lavare gli espianti mediante trasferimento successivo in tre pozzetti di una piastra da 24 pozzetti contenenti 1 ml di terreno di coltura pre-riscaldato (= M199 addizionato con antibiotici, glutamina e siero di vitello fetale al 10%).
2. Placcatura dei lobi tiroidei sul rivestiti di microscopia camere di coltura di plastica:
   1. Aspirare il mezzo di coltura M199 dalle camere rivestite.
   2. Con cautela, trasferire i espianti tiroide nelle camere di coltura utilizzando un consigli micropipetta e filtro. Posizionare un espianto al centro di ogni camera.
   3. Rimuovere eccesso di terreno e posizionare la camera di coltura in un incubatore di coltura tissutale (37 ° C, 5% CO ₂₎ per 2 ore per consentire gli espianti attribuiscono alla matrice.
   4. Aggiungere delicatamente 200 a 300 ml di terreno di coltura pre-riscaldato a ciascun pozzetto.
   5. Incubare per la cultura a lungo termine nel tessuto culturale incubatore.
3. Placcatura of regione trachea o della tiroide lobi sui filtri semiporoso:
   1. Riempire il numero di pozzetti di una piastra da 24 pozzetti richiesto con 330 ml di terreno di coltura pre-riscaldato.
   2. I filtri (esempio 0,4 micron filtro Millipore) sul supporto, avendo cura di evitare intrappolamento di bolle d'aria sotto il filtro della cultura.
   3. Dolcemente con una micropipetta consigli e filtri, trasferire gli espianti tiroidei con un volume minimo di mezzo sul centro dei filtri (massimo 4/filter).
   4. Rimuovere l'eccesso di medio e distanziare gli espianti con un ago di tungsteno.
   5. Incubare per la cultura a lungo termine nel tessuto culturale incubatore. NOTA: Cambia terreno di coltura ogni altro giorno sotto la cappa a flusso laminare. Cultura gli espianti fino a 7 giorni.

4. Whole-mount immunofluorescenza Protocollo di colorazione per la tiroide espianti

Sloggiare espianti coltivati ​​su filtri (dopo il passo 2 sotto) utilizzando aghi di tungsteno opinza sottile e il trasferimento in una piastra a 24 pozzetti per tutte le fasi, ad eccezione di primaria (passo 5) e secondaria (passo 7) incubazioni anticorpi (piastra a 96 pozzetti). Per espianti aderenti coltivate in camere di plastica microscopia, eseguire tutti i passaggi nelle camere di coltura.

1. Aspirare M199 terreno di coltura e fissare l'espianto con gelida 4% paraformaldeide (PFA) per 20 min (500 microlitri nel piatto da 24 pozzetti e 300 microlitri di diapositive microscopia).
2. Lavare 2x 10 min in Tris Buffered Saline con Triton (TBST, 50 mM Tris HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100) a temperatura ambiente.
3. Elaborare gli espianti immediatamente o conservare a -20 ° C. NOTA: Per la conservazione a lungo termine a -20 ° C, disidratare gli espianti in metanolo aumentando gradualmente la concentrazione di metanolo in TBST per raggiungere il 100% di metanolo. Quando si è pronti per continuare con l'immunoistochimica (punto 4), reidratare gli espianti aggiungendo gradualmente TBST al metanolo.
4. Sostituire TBST con la soluzione di bloccaggio (10% normale Goat Serum in TBST) E incubare su un rocker mare sega per 30-60 minuti a temperatura ambiente.
5. Diluire l'anticorpo primario in soluzione bloccante (100-200 ml per condizioni). Trasferire gli espianti "filtro" da una piastra da 24 pozzetti ad una piastra a 96 pozzetti. Incubare espianti con gli anticorpi primari su un rocker mare-sega notte a 4 ° C.
6. Il giorno successivo, scartare la soluzione di anticorpo primario, di trasferire gli espianti "filtro" di nuovo in una piastra a 24 pozzetti e lavare almeno cinque volte con TBST su una sedia a dondolo mare sega per 45-60 minuti ciascuno a RT.
7. Diluire anticorpo secondario (per esempio capra anti-X-Alexa Fluor a diluizione 1:2.000) in TBST contenente 1% di siero normale di capra e incubare gli espianti con questa diluizione durante la notte su un bilanciere mare-sega a 4 ° C e al buio. Per contrasto nucleare, comprende 1 mg / ml di bis-Benzimide (Hoechst), insieme con la soluzione di anticorpo secondario.
8. Il giorno successivo, scartare la soluzione di anticorpo secondario e lavare 5x con TBST su un mare-segarocker per 45-60 minuti ciascuno a RT. Durante i lavaggi, mantenere gli espianti nel buio.
9. Eseguire un lavaggio supplementare in TBST delicatamente vorticoso notte a 4 ° C al buio.
10. Postfix gli espianti immunostained in PFA 4% a 4 ° C per 10 min.
11. Lavare 2x 10 min con TBST.
12. Trasferire gli espianti sia gradualmente in metanolo 100% per la conservazione a lungo termine a -20 ° C, o analizzare immediatamente. Per espianti coltivati ​​su filtri, e immunostained in una piastra da 24 pozzetti, trasferimento in una camera di microscopia (es LabTek o Ibidi) con TBST o meglio mezzo di montaggio fluorescente prima dell'analisi con un Multiphoton o microscopio confocale.

5. Estrazione di RNA da tiroide

Lavorare in un ambiente privo di RNasi. Pertanto, l'uso di acidi nucleici e nucleasi gratuito punte per pipette e pulire sia panchina e attrezzature da contaminanti e RNasi. Questo protocollo essendo basato su fenolo / cloroformio, eseguire il primo passos (1-7) sotto una cappa chimica.

1. Omogeneizzare un espianto tiroide o due lobi tiroidei con 300 ml di soluzione di estrazione di RNA utilizzando un pestello monouso per provetta da 1,5 ml. In tra i campioni, lavare il pestello in 2% SDS, poi acqua, poi etanolo.
2. Aggiungere altri 100 ml di soluzione di estrazione dell'RNA, vortice 10 sec e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
3. Vortex per 30 secondi e aggiungere 20 ng di tRNA per ciascun campione.
4. Vortex per 1 minuto e aggiungere 80 ml di cloroformio.
5. Vortex energicamente per 30 secondi ed incubare 15 minuti a temperatura ambiente.
6. Spin per 15 minuti a 19.000 xg in un frigorifero (4 ° C) centrifuga.
7. Trasferire accuratamente la fase acquosa superiore incolore in una nuova provetta contenente 20 mg di glicogeno come coprecipitant.
8. Vortex e aggiungere 200 ml di alcol al 100% isopropanolo.
9. Vortex energicamente per 15-30 secondi e lasciare RNA precipitato a -20 ° C per 2-3 ore oa -80 ° C per 1 ora.
10. Spin per 30 min a 19.000xga 4 ° C, ed eliminare il surnatante.
11. Lavare il pellet con 450 ml di freddo il 75% di etanolo e vortex per rimuovere il pellet.
12. Spin per 10 min a 19.000 xga 4 ° C, ed eliminare il surnatante.
13. Essiccare il pellet sotto il cofano per 5 min.
14. Risospendere il pellet con 10 ml di acqua RNase-free e incubare 10 minuti a temperatura ambiente.
15. Concentrazione di RNA Assay, conservare a -80 ° C o inverse trascrivono per analisi di espressione genica.

Risultati

Anlages tiroide (linea mediana e UB, insieme con i tessuti circostanti) e lobi tiroidei sono sezionati da embrioni di topo a E12.5 e e13.5/e14.5, rispettivamente (Figura 1). Dopo un giorno di coltura sul filtro, la anlage linea mediana è visibile (Figura 2A) come un tessuto allungata si estende sulla parte superiore della trachea. Esso forma progressivamente due lobi su ciascun lato della trachea. Se lobi tiroidei isolati (E13.5 o E14.5) sono coltivate, si espandono, subiscono morfogene...

Discussione

Questo documento descrive un metodo per la dissezione e la coltura espianti tiroidei (E12.5) o lobi (E14.5), al fine di studiare e comprendere meglio le complesse vicende che portano alla formazione della tiroide. Grazie alla duplice origine del anlagen tiroide (anlage linea mediana e due corpi laterali ultimobranchial), e le loro piccole dimensioni, un frammento di tessuto E12.5 rostrale localizzato alle arterie arco faringeo, e contenente la trachea, ma non l'esofago è microdissezione. Come illustrato, entro un pe...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
µ-slide 8 pozzetti, ibiTreat, coltura tissutale trattata, sterile	proxylab	80826
Collagene di tipo I, coda di ratto	Millipore	08-115
Fibronectina da plasma umano	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
Filo di tungsteno	Goodfellow	LS237450
inserto per piastra di coltura (diametro 12 mm)	Millipore	PICM01250
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516
E-caderina	BD Biosciences	610182	1/1.000
Ezrin	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
PECAM	BD Biosciences	550274	1/100
Hoechst	Sigma	B2261