Questo protocollo descrive la dissezione dell'anlagen tiroideo embrionale di topo e la coltura di espianti su filtri semiporosi o su vetrini plastici per microscopia. Questo sistema è ideale per studiare gli eventi morfogenetici o di differenziazione che si verificano durante lo sviluppo tiroideo di embrioni wild type o knockout ed è suscettibile di esperimenti di guadagno e perdita di funzione.
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Articolo metodologico
Un
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In questo articolo
Sommario
Abstract
La tiroide è una ghiandola endocrina bilobated localizzata alla base del collo, producendo gli ormoni tiroidei T3, T4, e calcitonina. T3 e T4 sono prodotti da tireociti differenziati, organizzati in sfere chiusi chiamati follicoli, mentre calcitonina è sintetizzato dalle cellule C, intervallati tra i follicoli e una fitta rete di capillari sanguigni. Sebbene architettura tiroide adulto e funzioni sono state ampiamente descritte e studiato, la formazione delle unità "angio-follicolari", la distribuzione delle cellule C nel parenchima e le comunicazioni paracrini tra cellule epiteliali ed endoteliali è lungi dall'essere compresa.
Questo metodo descrive le fasi sequenziali di topo tiroide embrionale anlagen dissezione e la sua cultura sui filtri semiporoso o su scivoli di plastica microscopia. Entro un periodo di quattro giorni, questo sistema di coltura riassume fedelmente nello sviluppo della tiroide vivo. Infatti, (i) bilobation dell'organo verifica (per espianti E12.5), (ii) tireociti precursori organizzano in follicoli e polarizzano, (iii) tireociti e C-cellule si differenziano, e (iv) le cellule endoteliali presenti nel tessuto microdissezione proliferano, migrano nella lobi tiroidei, e strettamente associano con le cellule epiteliali, come fanno in vivo.
Tessuti tiroidei possono essere ottenute da wild type, knockout o embrioni transgenici fluorescenti. Inoltre, espianti coltura può essere manipolato per aggiunta di inibitori, bloccando anticorpi, fattori di crescita, o anche cellule o mezzo condizionato. Ex vivo sviluppo può essere analizzato in tempo reale, o in qualsiasi momento della coltura mediante immunoistochimica e RT-qPCR.
In conclusione, la cultura espianto tiroide combinato con a valle intera-mount o su sezioni di imaging e di espressione genica fornisce un potente sistema per manipolare e studiare morfogenetiche e differenziazione eventi della tiroide organogenesis.
Introduzione
La tiroide è una raccolta di sfere epiteliali indipendenti, chiamati follicoli, circondato da una fitta rete di capillari endoteliali. Questa organizzazione permette la funzione della tiroide: i capillari endoteliali forniscono tireociti con iodio, necessari per T3 e T4 sintesi degli ormoni, e distribuire questi ultimi a tutto il corpo. Sparsi tra i follicoli e dei capillari, C-cellule producono l'ormone calcitonina hypocalcemic 1. Anche se l'architettura della tiroide adulti e le funzioni sono ben noti, i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella tiroide sviluppo embrionale (formazione del follicolo e differenziazione) sono lungi dall'....
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Protocollo
I topi sono stati allevati e trattati secondo i principi della cura degli animali da laboratorio della commissione per il Benessere degli Animali University. Tutte le procedure e protocolli sono stati approvati dal comitato.
1. Rivestimento di Microscopia plastica Cultura Chambers
NOTA: Eseguire tutte le seguenti operazioni in condizioni di sterilità in una cappa a flusso laminare. I due tipi di rivestimento sono funzionalmente equivalenti.
- Cappotto di plastica camere di coltura con fibronectina un giorno prima l'isolamento dei tessuti tiroidei:
- Diluire fibronectina sterile ad una conce....
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Risultati
Anlages tiroide (linea mediana e UB, insieme con i tessuti circostanti) e lobi tiroidei sono sezionati da embrioni di topo a E12.5 e e13.5/e14.5, rispettivamente (Figura 1). Dopo un giorno di coltura sul filtro, la anlage linea mediana è visibile (Figura 2A) come un tessuto allungata si estende sulla parte superiore della trachea. Esso forma progressivamente due lobi su ciascun lato della trachea. Se lobi tiroidei isolati (E13.5 o E14.5) sono coltivate, si espandono, subiscono morfogene.......
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Discussione
Questo documento descrive un metodo per la dissezione e la coltura espianti tiroidei (E12.5) o lobi (E14.5), al fine di studiare e comprendere meglio le complesse vicende che portano alla formazione della tiroide. Grazie alla duplice origine del anlagen tiroide (anlage linea mediana e due corpi laterali ultimobranchial), e le loro piccole dimensioni, un frammento di tessuto E12.5 rostrale localizzato alle arterie arco faringeo, e contenente la trachea, ma non l'esofago è microdissezione. Come illustrato, entro un pe.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Université catholique de Louvain (Action de recherché concertées) e del Fondo per la Ricerca Medica Scientifica (F.R.S.-FNRS, Belgio). A.-S.D. è un dottorando di ricerca presso Télévie, A.-C.H. ha ottenuto una borsa di studio dal Fonds pour la formation à la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture (Belgio), M.V. è sostenuto dal de Duve Institute e C.E.P. è un senior research associate del F.R.S.-FNRS (Belgio).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| µ-slide 8 pozzetti, ibiTreat, coltura tissutale trattata, sterile | proxylab | 80826 | |
| Collagene di tipo I, coda di ratto | Millipore | 08-115 | |
| Fibronectina da plasma umano | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| Filo di tungsteno | Goodfellow | LS237450 | |
| inserto per piastra di coltura (diametro 12 mm) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-caderina | BD Biosciences | 610182 | 1/1.000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | Sigma | B2261 |
Riferimenti
- Colin, I. M., Denef, J. -F., Lengelé, B., Many, M. -C., Gérard, A. -C. Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units. Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).
- Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M.
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Ristampe e permessi
