Saggi di adesione statica è un potente strumento che può essere utilizzato per modellare le interazioni tra linfociti T e altri tipi di cellule. Interazioni sono generati iniettando cellule T etichettati in pozzetti rivestiti con molecole di adesione, mentre un lettore di piastra viene utilizzato per quantificare il numero di cellule aderenti seguente lavaggi seriali.
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Articolo metodologico
Static Adesione saggio per lo Studio della integrina attivazione nei linfociti T
In questo articolo
Sommario
Abstract
È richiesto T linfociti adesione per molteplici funzioni delle cellule T, compresa la migrazione ai siti di infiammazione e formazione di sinapsi immunologica con cellule presentanti l'antigene. Cellule T compiere adesione regolata controllando le proprietà adesive delle integrine, una classe di molecole di adesione cellulare composti da coppie eterodimeri di proteine transmembrana che interagiscono con le molecole bersaglio sulle cellule partner o matrice extracellulare. Il più importante integrina cellule T è la funzione dei linfociti antigene associato (LFA) -1, composto da subunità αL e β2, il cui obiettivo è la molecola di adesione intracellulare (ICAM) -1. La capacità di una cellula T per controllare adesione deriva dalla capacità di regolare gli stati affinità dei singoli integrine. Inside-out di segnalazione descrive il processo attraverso il quale i segnali all'interno di una cella causano i domini esterni delle integrine ad assumere uno stato attivato. Gran parte della nostra conoscenza di questi fenomeni complessi si basa su meccanicisticastudi effettuati in semplificata in sistemi modello in vitro. Il test dei linfociti T adesione qui descritto è un ottimo strumento che consente alle cellule T di aderire a bersaglio molecole, in condizioni statiche, e poi utilizza un lettore di piastra fluorescente quantificare adesività. Questo test è stato utile per definire sostanze adesione-stimolatorio o inibitorio che agiscono sui linfociti, così come caratterizzare gli eventi di segnalazione coinvolte. Anche se qui descritta per LFA-1 - ICAM-1 di adesione mediata; questo dosaggio può essere facilmente adattato per consentire lo studio di altre interazioni adesive (ad esempio VLA-4 - fibronectina).
Introduzione
T linfociti adesione è un processo fondamentale nella risposta immunitaria 1. E 'richiesto per l'interazione delle cellule T con le cellule endoteliali decorare le pareti dei capillari, per antigene scansione cellule presentanti (APC) entro linfonodi, e per la formazione di sinapsi immunologiche (IS) con cellule bersaglio 2. Questi requisiti sono funzionalmente e cineticamente distinti. Il processo di linfociti stravaso si compone di chemiotassi, laminazione, ferma adesione e la trasmigrazione. La transizione dalla laminazione a rassodare adesione richiede cellule T per rispondere a un segnale recettore accoppiato a proteina G rapidament....
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Protocollo
1. Rivestimento del micropiastre Wells
Nota: L'obiettivo di questa fase è quello superfici cappotto polistirene con ICAM-1 per servire come ligandi per cellule T LFA-1.
- Preparare le seguenti soluzioni:
- Preparare la soluzione di rivestimento risospendendo ricombinante ICAM-1 con tampone fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) arricchito con calcio (1 mM CaCl 2) e magnesio (2 nM MgCl 2). Assicurarsi che la concentrazione finale di ICAM-1 è di 10 mcg / ml, realizzati da uno stock di soluzione 0,7 mg / ml e conse....
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Risultati
Di seguito è riportato un esempio di saggi di adesione usando cellule T primarie stimolate con diverse concentrazioni di anticorpi anti-CD3. È utile conoscere la fluorescenza delle cellule non lavate (cioè il carico totale). Cellule non stimolate servono come controllo negativo e cellule trattate PMA sono il controllo positivo per gli anticorpi anti-CD3. Cellule piastrate in pozzetti rivestiti servono come controllo per ICAM-1. In un tipico esperimento la percentuale di cellule trattate con PMA aderenti è tra i.......
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Discussione
Ci sono diversi saggi per studiare segnali di LFA-1 attivazione e T adesione cellulare 12. Citometria a flusso è utilizzato per misurare la LFA-1 affinità stati nelle cellule viventi utilizzando anticorpi monoclonali che si legano selettivamente a uno piegato o estesa LFA-1. Uno dei limiti di questo metodo è che non tiene conto avidità delle integrine. Saggi di migrazione sono strumenti utili ma che misurano la migrazione, e non l'adesione misero in un dato momento. Modelli murini per studiare la migrazio.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Hirschil Trust, Michael Saperstein medici studiosi fondi di ricerca, e la comunione NYU Whitehead sostenuto questo lavoro.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Lettore di piastre | BioTek | Synergy H1 Pipetta | |
| ibrida multicanale | Fisher | 21-377-829 | |
| Micropiastra a 96 pozzetti con fondo ottico | Corning Costar | 3603 | |
| Ricombinante ICAM-1 | R& D Systems | ADP4-050 | |
| Anticorpi anti-CD3 | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Sonde molecolari | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS contenente calcio e magnesio | Gibco | ||
| Linfociti periferici | ad es. topo o umano | ||
| Cloruro di magnesio | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Cloruro di calcio | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 Software | BioTek | Versione 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Provette da centrifuga da 15 e 50 ml | Fisher | 352099, 352070 | |
| Pipette Pasteur in plastica monouso Fisher | 13-711-7M | ||
| Palloni di coltura T-75 | Fisher | 50-754-1366 | |
| Kit di arricchimento delle cellule T RosetteSep | StemCell Technologies | 15061 |
Riferimenti
- Dustin, M. L., et al. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., et al. GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., et al....
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Ristampe e permessi
