Static Adesione saggio per lo Studio della integrina attivazione nei linfociti T

Summary

Saggi di adesione statica è un potente strumento che può essere utilizzato per modellare le interazioni tra linfociti T e altri tipi di cellule. Interazioni sono generati iniettando cellule T etichettati in pozzetti rivestiti con molecole di adesione, mentre un lettore di piastra viene utilizzato per quantificare il numero di cellule aderenti seguente lavaggi seriali.

Abstract

È richiesto T linfociti adesione per molteplici funzioni delle cellule T, compresa la migrazione ai siti di infiammazione e formazione di sinapsi immunologica con cellule presentanti l'antigene. Cellule T compiere adesione regolata controllando le proprietà adesive delle integrine, una classe di molecole di adesione cellulare composti da coppie eterodimeri di proteine ​​transmembrana che interagiscono con le molecole bersaglio sulle cellule partner o matrice extracellulare. Il più importante integrina cellule T è la funzione dei linfociti antigene associato (LFA) -1, composto da subunità αL e β2, il cui obiettivo è la molecola di adesione intracellulare (ICAM) -1. La capacità di una cellula T per controllare adesione deriva dalla capacità di regolare gli stati affinità dei singoli integrine. Inside-out di segnalazione descrive il processo attraverso il quale i segnali all'interno di una cella causano i domini esterni delle integrine ad assumere uno stato attivato. Gran parte della nostra conoscenza di questi fenomeni complessi si basa su meccanicisticastudi effettuati in semplificata in sistemi modello in vitro. Il test dei linfociti T adesione qui descritto è un ottimo strumento che consente alle cellule T di aderire a bersaglio molecole, in condizioni statiche, e poi utilizza un lettore di piastra fluorescente quantificare adesività. Questo test è stato utile per definire sostanze adesione-stimolatorio o inibitorio che agiscono sui linfociti, così come caratterizzare gli eventi di segnalazione coinvolte. Anche se qui descritta per LFA-1 - ICAM-1 di adesione mediata; questo dosaggio può essere facilmente adattato per consentire lo studio di altre interazioni adesive (ad esempio VLA-4 - fibronectina).

Introduction

T linfociti adesione è un processo fondamentale nella risposta immunitaria ^1. E 'richiesto per l'interazione delle cellule T con le cellule endoteliali decorare le pareti dei capillari, per antigene scansione cellule presentanti (APC) entro linfonodi, e per la formazione di sinapsi immunologiche (IS) con cellule bersaglio ^2. Questi requisiti sono funzionalmente e cineticamente distinti. Il processo di linfociti stravaso si compone di chemiotassi, laminazione, ferma adesione e la trasmigrazione. La transizione dalla laminazione a rassodare adesione richiede cellule T per rispondere a un segnale recettore accoppiato a proteina G rapidamente. Questa risposta produce un'interazione ligando integrina che rallenta e arresti la cella di rotolamento ^3. Un cambiamento immediato nel avidità delle integrine media questo processo. La migrazione richiede interazioni betweenTcells dinamici e cellule endoteliali, con la formazione di aderenze al 'front end' e la rottura delle aderenze alla 'coda'con un intervallo di circa un minuto tra formazione e la rottura ^4. La IS forma inminutes, ma deve rimanere intatta per ore ^6.

È interessante notare che, una molecola di adesione, la funzione dei linfociti membro della famiglia delle integrine antigene associato (LFA) - 1, è essenziale per tutti questi processi ^5. LFA-1 media l'adesione attraverso interazioni con diversi membri della superfamiglia delle immunoglobuline. Il ligando più studiato con la più alta affinità di LFA-1 è la molecola di adesione intercellulare (ICAM) -1. Linfociti circolanti non attivati ​​esprimono bassa affinità LFA-1 sulla superficie cellulare, e quindi sono in grado di aderire alle superfici ICAM-1-rivestita. LFA-1 affinità è variabile e regolata da diversi eventi di segnalazione come la proteina recettore accoppiato attivazione G, stimolazione di citochine, e segnali mediati da recettori delle cellule T (TCR). La risultante forma alta affinità di LFA-1 trasmette l'attivazione intracellulare allo spazio extracellulare tttraverso interazioni con ICAM-1. Questo percorso è definito dentro-fuori di segnalazione ^7. Analogamente, la segnalazione attraverso LFA-1 dallo spazio extracellulare è chiamato dall'esterno all'interno segnalazione.

Il intracellulare cascate di segnalazione coinvolte nel inside-out e outside-in di segnalazione sono un obiettivo importante della ricerca attuale. La piccola GTPasi Rap1 è recentemente emerso come il componente chiave di inside-out di segnalazione che è comune ad entrambi legatura TCR e citochine segnalazione ^8. Il ruolo critico di Rap1 in attivazione integrina è evidenziata dalla scoperta che la sovraespressione di Rap1 stimola integrina-dipendente adesione delle cellule T, mentre l'adesione delle cellule T è bloccato da espressione di dominante Rap1 negative ^9. Questi progressi nella nostra comprensione della regolazione integrina da Rap1 sono state compiute utilizzando strumenti in vitro. Tra questi è il saggio adesione statica qui descritto.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di studiare Tadesività e ICAM-1 superfici rivestite. Più specificamente, viene utilizzato per misurare obiettivamente e quantificare LFA-1 affinità verso i suoi contatore ligandi in cellule vive in tempo reale, in condizioni diverse. Questa tecnica utilizza pozzetti di polistirene rivestite con ICAM-1 per imitare le superfici cellulari che le cellule T interagiscono. Molti saggi di adesione delle cellule T statico precedentemente descritti potessero sperimentalmente complesso. Questi saggi spesso richiesti per le cellule T siano marcati radioattivamente, utilizzate cellule corneali bovina coltivate per creare una matrice extracellulare come substrato per l'adesione delle cellule T, o chiamati per non fisiologica stimolazione delle cellule T durante un periodo prolungato di promuovere l'adesione delle cellule T ^10. L'uso di misurazione fluorimetrica quantificare cellule T a seguito dell'incubazione adesione è un metodo più sensibile e preciso di quantificazione rispetto alla citometria a flusso e microscopia, come sono utilizzati in molti altri sistemi di dosaggio ^11. Inoltre, microscop singola cellaanalisi ic Geografica integrina non consente l'ampio, popolazione sulla base dell'analisi nello stesso modo come la misurazione fluorimetrica. Mentre LFA-1 anticorpi specifici dello stato di attivazione sono disponibili in commercio, questi anticorpi offrono una bassa sensibilità rispetto al metodo descritto qui. Il principale vantaggio rispetto alle tecniche alternative è la sua semplicità e la capacità di esaminare più condizioni sperimentali contemporaneamente. Quando si considera questo metodo per una specifica applicazione, si dovrà tener conto che le cellule T devono essere selezionati negativamente, appena isolate, e marcate con un marcatore fluorescente.

Protocol

1. Rivestimento del micropiastre Wells

Nota: L'obiettivo di questa fase è quello superfici cappotto polistirene con ICAM-1 per servire come ligandi per cellule T LFA-1.

1. Preparare le seguenti soluzioni:
   1. Preparare la soluzione di rivestimento risospendendo ricombinante ICAM-1 con tampone fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM KH ₂ PO _4, pH 7.4) arricchito con calcio (1 mM CaCl ₂₎ e magnesio (2 nM MgCl _2). Assicurarsi che la concentrazione finale di ICAM-1 è di 10 mcg / ml, realizzati da uno stock di soluzione 0,7 mg / ml e conservati in una -80 ° C freezer.
   2. Preparare la soluzione adesione arricchendo PBS con 0,5% umano (o bovina) albumina sierica (HSA / BSA), 2 mM MgCl _2, e 1 mM CaCl _2.
   3. Preparare la soluzione di lavaggio con l'aggiunta di 2 mM MgCl ₂ e 1 mM CaCl ₂ a PBS. Riscaldare tutte le soluzioni a 37° C prima dell'uso.
2. Lavare 24 pozzi con 50 ml di soluzione di lavaggio. Ciò comprende i pozzi non lavate, (PMA cellule trattate) positive, e negative (pozzi rivestiti) controlli. Per ogni condizione impostata almeno tre pozzi (triplice copia).
3. Aggiungere 50 ml di soluzione di rivestimento a ciascun pozzetto. Non aggiungere ai pozzetti di controllo non rivestiti. Incubare per un'ora dentro 37 ° C incubatore.
4. Aspirare la soluzione di rivestimento delicatamente, senza che questo venga a contatto del fondo dei pozzetti. Lavare una volta con 50 ml di soluzione di lavaggio.
5. Aggiungere 50 ml di soluzione di adesione e incubare la micropiastra per un hr dentro 37 ° C incubatore.
6. Aspirare delicatamente e lavare con una soluzione di lavaggio 50 microlitri. Utilizzare la piastra lo stesso giorno, tuttavia è possibile mantenere a 4 ° C durante la notte, e usarlo il giorno seguente.

2. T isolamento delle cellule da sangue

1. Aggiungi T arricchimento di cellule umane cocktail a 50 microlitri / ml of sangue intero (ad esempio per 3 ml di anticoagulante (eparina, EDTA o citrato) sangue intero, aggiungere 150 ml di cocktail). Mescolare bene.
2. Incubare 20 minuti a temperatura ambiente.
3. Per un tubo da centrifuga da 50 ml aggiungere 3 ml di sangue trattato e un volume uguale di PBS (senza calcio e magnesio) arricchito con 1% D-glucosio a temperatura ambiente. Mescolare delicatamente con una pipetta Pasteur.
4. Aggiungere 15 ml PLUS Ficoll-Paque al tubo da centrifuga.
5. Strato attentamente le 6 ml di diluito campione di sangue sul terreno di isolamento dei linfociti.
6. Centrifugare a 400 xg per 20 min a 20 ° C con pausa off.
7. Raccogliere lo strato superiore mediante una pipetta Pasteur pulito, lasciando lo strato linfociti indisturbato all'interfaccia. Lo strato superiore di plasma può essere conservato per un uso successivo. Usando una pipetta Pasteur pulito trasferire lo strato linfociti in una provetta da centrifuga pulita.
8. Aggiungere 3 volumi (9 ml) di PBS ai linfociti. Sospendere le cellule delicatamente drali ala dentro e fuori di una pipetta Pasteur.
9. Centrifugare a 400 xg per 5 min a 20 ° C.
10. Rimuovere il surnatante. I linfociti devono ora essere sospese in mezzo appropriato per l'applicazione. Trasferire le cellule in un pallone T-75 in 20 ml di coltura RPMI 1640 supporto contenente 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina.

3. Preparazione delle cellule

Nota: Il presupposto è per le cellule da etichettare con un reagente fluorescente. In questo protocollo utilizzare carbossi fluoresceina estere succinimidyl (CFSE), proteina fluorescente tuttavia verde (GFP), le cellule che esprimono sono un'alternativa accettabile.

1. Conte 2.4 x 10 ⁶ cellule T (1 x 10 ⁵ per ogni pozzetto) utilizzando un emocitometro.
2. Risospendere le cellule in coltura privo di siero (deprivazione di siero). Incubare le cellule per 2 ore a 37 ° C incubatore.
3. Centrifugare le cellule per 5 min (400 xg). Aspirare i media erisospendere in 1 ml di PBS.
4. Aggiungi CFSE a 1:1000 diluizione (azione fatta a 5 mm). Coprire dalla luce e incubare per 8 minuti a temperatura ambiente.
5. Arrestare la reazione aggiungendo 10 ml di 37 ° C PBS e centrifugare a 400 xg per 5 min.
6. Risospendere pellet cellulare con 1,2 ml di soluzione di adesione pre-riscaldato (1 x 10 ⁵ cellule per 50 microlitri).

4. Stimolazione delle cellule

Nota: Per avviare l'adesione, le cellule devono essere stimolate. Nel seguente esperimento le cellule vengono stimolate tramite il TCR utilizzando anticorpi anti-CD3 reticolazione, tuttavia solubile SDF-1 potrebbe servire come alternativa. A seconda della meta degli esperimenti, vari reagenti farmacologici potrebbero essere aggiunti prima o durante la stimolazione per studiare l'impatto sulla adesione cellulare. Forbol myristate acetato (PMA) è un estere phorbol che è strutturalmente simile al secondo glicerolo messaggero diacyl (DAG) e quindi attiva la chinasi multiplasa valle del TCR (principalmente proteina chinasi C); qui viene utilizzato come controllo positivo.

1. Riscaldare la micropiastra a 37 ° C.
2. Dividere le celle vuote in 8 provette da 1,5 ml (150 microlitri in ciascun tubo), un tubo per ogni condizione.
3. Trattare le cellule di conseguenza:
   1. Stimolare un tubo con PMA a 10 ng / ml per servire come controllo positivo. Mantenere tre tubi non trattata, per servire come controllo per la stimolazione ("nessuno stimolo"), il controllo di carico non lavati ("no wash"), e controllo per ICAM-1 coating ("patinata").
   2. Stimolare quattro tubi con differenti concentrazioni di anticorpi anti-CD3 (0,1, 1, 5, e 10 ug / ml). Continuare con il passaggio successivo, senza ritardi.
4. Aliquota 50 ml di miscela di cellule stimolate in ciascun pozzo vuoto. Il numero totale di cellule per pozzetto è 1 x 10 ^5.
5. Posizionare la micropiastra in C incubatore a 37 ° per 15 min.
   Nota: alcune linee di cellule T necessitano di stimoli più breve Tempo zione. Durante questo periodo, le cellule stabilirsi al fondo dei pozzetti e rispettare i ligandi bersaglio.

5. Dilavamento cellule non aderenti

Nota: Lo scopo di questa fase è quello di rimuovere le cellule che non erano in grado di formare contatti stretti con le superfici rivestite con ligando. Utilizzare una pipetta multicanale per questo passo per assicurare che le stesse forze fisiche vengono applicati a tutti i pozzetti. E 'importante mantenere i pozzetti di controllo indicati non lavati per assistere nel calcolo della percentuale di cellule aderenti.

1. Aggiungere 150 ml di soluzione di adesione caldo ad ogni pozzetti. Agitare la piastra delicatamente per alcuni secondi prima di rimuovere il terreno dai pozzetti. Non toccare il fondo dei pozzetti con le punte.
2. Ripetere questa operazione tre volte. Cambiare la direzione della pipetta durante la dispensazione del buffer in e out.

6. Determinazione della percentuale di cellule aderenti

_content "> Nota: In questo passaggio un lettore di piastra fluorescente è utilizzato per misurare l'intensità di fluorescenza in ogni pozzetto L'intensità è in diretta correlazione con il numero delle cellule aderenti..

1. Accendere il lettore di piastre. Aprire il software lettore di piastre facendo clic sull'icona di collegamento sul desktop.
   1. Dal menu "Attività" click "Nuovo" per creare un nuovo protocollo.
   2. Dal menu "Azioni" scegliere l'opzione "Leggi". Fare clic su "intensità di fluorescenza", e ha colpito la scheda "Ok".
   3. Dal menu a discesa selezionare "Eccitazione 485" e "d'onda di emissione 528". Hit la scheda "Ok".
   4. Nel menu delle opzioni "Optic", selezionare "Fine" e premere la scheda "Ok". Torna al menu "Azioni" e impostare la temperatura a 37 ° C e fare clic su "Ok".
   5. Inserire la micropiastra nel lettore piastra efare clic su "Esegui". Il risultato sarà esportato in Excel foglio di calcolo.
2. Calcolare la percentuale di cellule aderenti utilizzando la seguente formula: Percentuale di cellule aderenti = (intensità media fluorescente leggere nei pozzetti lavati) / (intensità media fluorescente leggere nelle cellule non lavate) x 100%.

Results

Di seguito è riportato un esempio di saggi di adesione usando cellule T primarie stimolate con diverse concentrazioni di anticorpi anti-CD3. È utile conoscere la fluorescenza delle cellule non lavate (cioè il carico totale). Cellule non stimolate servono come controllo negativo e cellule trattate PMA sono il controllo positivo per gli anticorpi anti-CD3. Cellule piastrate in pozzetti rivestiti servono come controllo per ICAM-1. In un tipico esperimento la percentuale di cellule trattate con PMA aderenti è tra i...

Discussion

Ci sono diversi saggi per studiare segnali di LFA-1 attivazione e T adesione cellulare ^12. Citometria a flusso è utilizzato per misurare la LFA-1 affinità stati nelle cellule viventi utilizzando anticorpi monoclonali che si legano selettivamente a uno piegato o estesa LFA-1. Uno dei limiti di questo metodo è che non tiene conto avidità delle integrine. Saggi di migrazione sono strumenti utili ma che misurano la migrazione, e non l'adesione misero in un dato momento. Modelli murini per studiare la migrazio...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lettore di piastre	BioTek	Synergy H1 Pipetta
ibrida multicanale	Fisher	21-377-829
Micropiastra a 96 pozzetti con fondo ottico	Corning Costar	3603
Ricombinante ICAM-1	R& D Systems	ADP4-050
Anticorpi anti-CD3	Ancell	144-020
PMA	Sigma-Aldrich	79346
BSA	Sigma-Aldrich	A2058
CFSE	Sonde molecolari	C1157
RPMI	Gibco	11875-093
DPBS contenente calcio e magnesio	Gibco
Linfociti periferici	ad es. topo o umano
Cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	499609
Open Gen 5 Software	BioTek	Versione 2.01
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00
Provette da centrifuga da 15 e 50 ml	Fisher	352099, 352070
Pipette Pasteur in plastica monouso Fisher		13-711-7M
Palloni di coltura T-75	Fisher	50-754-1366
Kit di arricchimento delle cellule T RosetteSep	StemCell Technologies	15061