Articolo metodologico

Misurare il osmotica dell'acqua Permeabilità Coefficiente (P F) Di celle sferiche: protoplasti impianto isolato come un esempio

DOI:

10.3791/51652

⸱

8 ottobre 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1The RH Smith Institute of Plant Sciences and Genetics in Agriculture, The Hebrew University of Jerusalem, 2Earth and Life Institute, Université catholique de Louvain, 3Institut des Sciences de la Vie, Université catholique de Louvain

In questo articolo

Sommario

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Misurare il coefficiente di permeabilità all'acqua osmotica (P f) delle cellule può aiutare a capire i meccanismi di regolazione delle acquaporine (AQPs). P determinazione F in protoplasti di cellule vegetali sferiche qui presentati coinvolge protoplasti isolamento e l'analisi numerica dei loro tasso iniziale di variazione di volume a seguito di una sfida osmotico costante durante il bagno di perfusione.

Abstract

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Studiare AQP meccanismi di regolazione è fondamentale per la comprensione delle relazioni idriche sia a livello cellulare e tutto il livello dell'impianto. Presentato qui è un metodo semplice e molto efficace per la determinazione del coefficiente di permeabilità all'acqua osmotica (P f) in protoplasti vegetali, applicabile in linea di principio anche ad altre cellule sferiche come oociti di rana. Il primo passo del saggio è l'isolamento di protoplasti dal tessuto vegetale di interesse mediante digestione enzimatica in una camera con una soluzione isotonica adeguata. La seconda fase consiste in un saggio sfida osmotica: protoplasti immobilizzati sul fondo della camera vengono sottoposti ad una partenza perfusione costante con una soluzione isotonica e seguiti da una soluzione ipotonica. Il gonfiore cella è il video registrato. Nella terza fase, le immagini vengono elaborate in linea per produrre variazioni di volume, e l'andamento temporale delle variazioni di volume è correlato con l'andamento temporale della variazione di osmolarezza del mezzo perfusione camera, utilizzando una curva di raccordo procedura scritta in Matlab (il 'PfFit'), per produrre P f.

Introduzione

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L'assorbimento di acqua e il flusso attraverso le membrane cellulari è un requisito fondamentale per l'esistenza dell'impianto sia a cellulare e tutto il livello dell'impianto. A livello cellulare, acquaporine (AQPs) giocano un ruolo chiave nella regolazione del coefficiente di permeabilità all'acqua osmotica (P f) della membrana cellulare 1-3.

Ad oggi, diversi metodi sono stati utilizzati per misurare il endogena P f di protoplasti da diversi organi vegetali (ad esempio radici, mesofillo, endodermis, ecc., Recensito da Chaumont et al. 4). Uno degli....

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Protocollo

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1 preparazione di soluzioni

  1. Preparare isotonica (600 mOsm) e ipotonica (500 mOsm) soluzioni contenenti KCl 10 mM, 1 mM CaCl 2, e 8 M 2 (N-morfolina) Acido -ethanesulphonic (MES), pH 5.7 e regolare osmolarità con gli importi adeguati di D-sorbitolo: 540 mm per l'isotonico e 440 mm per la soluzione ipotonica. Verificare l'osmolarità della soluzione (entro il 3% del valore nominale) utilizzando un osmometro.
  2. Preparare uno stock secco di 'mix enzimatico' contenente i seguenti enzimi: 0,55 g cellulasi, 0,1 g pectolyase, 0,33 g di polivinilpirrolidone K 30, 0,33 g di BSA (vedi tabella 1 qui di seguito), mesco....

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Risultati

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Per determinare la P f e confrontare l'attività di diversi AQPs, vengono utilizzati protoplasti da mesofillo foglia Arabidopsis. Questi protoplasti sono stati trovati ad avere bassi basale (sfondo) livelli P f 7 e può servire come un sistema funzionale espressione per consentire riproducibili misurazioni P f.

Protoplasti da una foglia maturo da un 6 settimane di età Arabidopsis pianta sono stati isolati e tre gene costruisce con i geni AQP da Arabi.......

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Discussione

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Descritto qui è una procedura semplice e molto efficace per misurare la P f di isolati protoplasti vegetali, applicabile in linea di principio anche ad altre cellule sferiche, ad es., Oociti di rana 11. Questo metodo si basa sulla misura della P f in risposta ad una sfida osmotica alla cella. A differenza di altri metodi basati su questo approccio, tuttavia, la variazione di soluzioni, cioè, della osmolarità, non è istantanea ma graduale, durante un bagno perfusione cos.......

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Dichiarazioni

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Fondo nazionale belga per fi Scienti c Research (FNRS), il Interuniversitario di attrazione polacchi programma-belga Politica della scienza e le "Comunità francese del Belgio-Actions de Recherches Concertées" per FC, dalla Fondazione Gerusalemme Israele Science ( ISF) a MM (Grant # 1311-1312), e NM (Grant # 1312-1312).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
KClChem-Impex International01247-1http://www.chemimpex.com
Qualsiasi fonte, grado anale
CaCl2Merck11718006http://www.merck.com
Qualsiasi fonte, acido anal. grado
2-(N-morfolina)-etansolfonico (MES)Sigma15152002http://www.sigmaaldrich.com
Qualsiasi fonte, grado anale
D-SorbitoloSigma18032003http://www.sigmaaldrich.com
Qualsiasi fonte, grado anale
CellulaseWorthington, Lakewood, NJ, USALS002603http://www.worthingtonbiochem.com
PectolyaseKarlan,                            Phonix, AZ, Stati Uniti8006http://www.karlan.com
Polivinil-pirrolidone K 30 (PVP)Sigma81420http://www.sigmaaldrich.com
Albumina sierica bovina (BSA)SigmaA9418-5Ghttp:// www.sigmaaldrich.com
Protamina solfatoSigmaP4380http://www.sigmaaldrich.com
Poli-L-lisinaSigmaP8920http://www.sigmaaldrich.com
Xilene cianoloSigmaX4126http://www.sigmaaldrich.com
Grasso per vuoto siliconico pesanteMerck 107921https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.? SecurePage=true& SEO_ErrorPageOccurred=vero& attachments=CoA
Microscopio invertito NikonEclipse TS100/TS100Fhttp://www.nikoninstruments.com
Pompa peristalticaBIO-RADEP-1 Econo  Pumphttp://www.bio-rad.com
Fotocamera digitale in scala di grigiScion CorporationCFW-1308Mhttp://www.scioncorp.com
Plugin CMU 1394 Camera Driver' per ImageJCarnegie Mellonhttp://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html
Software gratuito
ImageJNIHhttp://rsb.info.nih.gov/ij/
Software gratuito
Kit raccordi per pompa a gradiente EconoBIO-RAD731-9006http://www.bio-rad.com
Connettori, collettoreDirectMedhttp://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html? ACTION=S
infusione di burette (colonne)WelfordIF-BR-001
http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 TubingTYGONR-3603http://www.usplastic.com
3M imballaggio Scotch tape 1'', trasparenteViking Industrial, Regno UnitoVKMONO25http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#. UuvqOftdy_8
è probabile che qualsiasi nastro adesivo trasparente (nastro adesivo, ecc.) sia OK
Set per

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
  2. Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters.

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Funzione delle acquaporinesaggio di sfida ipotonicaanalisi della variazione di volumeisolamento enzimatico dei protoplasticonfigurazione del sistema di perfusioneanalisi con ImageJcurve fitting con MATLABespressione delle acquaporine

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