Articolo metodologico

La valutazione non invasiva della Cardiac Anomalie in Experimental Autoimmune miocardite da Risonanza Magnetica Imaging Microscopy nel mouse

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DOI:

10.3791/51654

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20 giugno 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Biological Systems Engineering, University of Nebraska-Lincoln

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio dimostra il successo dell'affermazione della risonanza magnetica come strumento non invasivo per valutare le anomalie cardiache nei topi affetti da miocardite autoimmune. I dati indicano che la tecnica può essere utilizzata per monitorare la progressione della malattia negli animali vivi.

Abstract

La miocardite è una infiammazione del miocardio, ma solo circa il 10% di questi spettacoli manifestazioni cliniche interessate della malattia. Per studiare gli eventi del sistema immunitario di lesioni del miocardio, vari modelli murini di miocardite sono stati ampiamente utilizzati. Questo studio ha coinvolto sperimentale miocardite autoimmune (EAM) indotto con miosina cardiaca catena pesante (MyHC)-α 334-352 in A / J topi; gli animali colpiti sviluppano miocardite linfocitica ma senza segni clinici evidenti. In questo modello, l'utilità di microscopia a risonanza magnetica (MRM) come modalità non invasiva per determinare le cardiaci cambiamenti strutturali e funzionali in animali immunizzati con MyHC-α 334-352 è mostrato. EAM e topi sani sono stati ripresi con un 9.4 T (400 MHz) 89 millimetri scanner foro centrale verticale dotato di una sonda di imaging a radiofrequenza 4 centimetri millepiedi e 100 g / cm gradienti triple assi. Immagini cardiache sono state acquisite da animali anestetizzati utilizzando una sequenza di impulsi cine-based gradient-echo, e l'animaLS sono stati monitorati dalla respirazione e pulsossimetria. L'analisi ha rivelato un aumento dello spessore della parete ventricolare in topi EAM, con una corrispondente diminuzione del diametro interno dei ventricoli, se confrontato con topi sani. I dati suggeriscono che i cambiamenti morfologici e funzionali nei cuori infiammati possono essere non invasiva monitorato da MRM di animali vivi. In conclusione, MRM offre un vantaggio di valutare la progressione e regressione delle lesioni miocardiche in malattie causate da agenti infettivi, così come la risposta alle terapie.

Introduzione

L'insufficienza cardiaca è la causa principale delle morti, e miocardite è una causa predominante di insufficienza cardiaca nei giovani adolescenti 1. La maggior parte dei pazienti affetti da miocardite rimangono asintomatici e la malattia viene spontaneamente risolti 2. Tuttavia, il 10-20% dei soggetti colpiti in grado di sviluppare malattie croniche, portando a cardiomiopatia dilatativa (DCM) 3. Vari modelli animali sono stati sviluppati per studiare la patogenesi immunitaria di miocardite. La malattia può essere indotta in miocardite-suscettibile A / J e topi Balb / c immunizzando gli animali con miosina cardiaca catena pesante (MyHC)-α o dei suoi frammenti peptidici immunodominanti o infettando con agenti patogeni come virus Coxsackie B3 4-9. Questo studio coinvolge MyHC-α miocardite 334-352 indotta in A / J topi. Nonostante mostrando infiltrazioni del miocardio, gli animali miocardite colpite appaiono clinicamente normali; diagnosi si basa sulla valutazione istologica di cuori per l'infiammazione 7 bisnd ecocardiografia 10.

Microscopia a risonanza magnetica (MRM) è un metodo comunemente utilizzato per ottenere imaging cardiovascolare ad alta risoluzione piani tridimensionali, che consenta di valutare dettagli funzionali al livello dei vasi sanguigni minute (fino a 10 micron di diametro), ma questo livello di potere risolvente è non realizzabili con la routine risonanza magnetica (MRI) procedura di scansione, in cui, la risoluzione viene generalmente ottenuta 1 mm 11-14. MRM offre un vantaggio in quanto permette l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione e anche per ricavare i parametri di prestazione nei momenti iniziali della malattia processo 14. Clinicamente, l'imaging MRM è stato ampiamente applicato per studiare i parametri funzionali del malato cuore, polmoni o cervello 15-17. In questo studio, è mostrato l'uso di una tecnica MRM come strumento non invasivo per verificare anomalie cardiache in A / J topi affetti da miocardite autoimmune. Specificamente, tegli Imaging MRM permette la quantificazione dei parametri funzionali quali ventricolare sinistra (LV) volume telediastolico e frazione di eiezione (EF) con ragionevole precisione 18. Le definizioni dei rispettivi parametri sono: fine LV volume telediastolico, volume di sangue nel ventricolo sinistro a fine ciclo diastolica e frazione di eiezione, stroke volume / volume telediastolico. L'analisi dei dati viene effettuata utilizzando il software liberamente disponibile segmento sviluppato per l'elaborazione immagini cardiovascolari DICOM acquisiti da scanner a risonanza magnetica 19. I dati hanno rivelato un aumento dello spessore della parete LV negli animali myocarditic, corrispondente ad una diminuzione del volume telediastolico LV, gittata sistolica e frazione di eiezione, rispetto a questi parametri funzionali in topi sani.

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Protocollo

DICHIARAZIONE ETICA:

Tutte le procedure di polizia sono state condotte in conformità con le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvati dalla University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE.

1. Induzione di autoimmune sperimentale miocardite

  1. Preparare la soluzione sciogliendo peptide MyHC-α 334-352 in 1x PBS ad una concentrazione finale di 2 ml mg/1.5.
  2. Preparare la tossina della pertosse (PT) aggiungendo 1 ml di PBS sterile 1x in una fiala contenente 50 mg di PT liofilizzate per ottenere una concentrazione magazzino di 50 ng / ml. Prendere 20 ml di brodo in una provetta sterile da 1,5 ml e aggiungere 980 ml di sterile 1x PBS per ottenere una concentrazione di lavoro di 1 ng / ml.
  3. Preparare adiuvante completo di Freund (CFA) con l'aggiunta di 40 mg di Mycobacterium tuberculosis H37Rv (MTB) estratto a 10 ml di CFA per ottenere una concentrazione finale5 mg / ml.
  4. Preparare l'emulsione peptide-CFA. NOTA: Per l'induzione EAM, l'emulsione peptide-CFA è stato somministrato a 150 ml contenenti 100 mg di MyHC-α 334-352 per animale. Ad esempio, per immunizzare topi dieci usano 1,5 ml di emulsione peptide-CFA contenente 1 mg di MyHC-α 334-352.
    1. Per preparare 1,5 ml di emulsione, un'aliquota 750 microlitri di MyHC-α 334-352 soluzione di peptide in una provetta da 1,5 ml, e CFA integrati con MTB in un'altra provetta da 1,5 ml. Usando una siringa luer-lok 3 ml, aspirare la soluzione peptide prima, seguita dalla estratto CFA / MTB.
    2. Collegare la siringa al rubinetto a 3 vie e collegare l'altra uscita del rubinetto ad un vuoto siringa 3 ml. Regolare la pervietà del rubinetto in modo che la miscela peptidica-CFA scorre da una siringa all'altra con ragionevolmente buona resistenza.
    3. Mescolare spingendo il contenuto da una siringa all'altra ripetutamente per ~ 1 min e poi posizionare l'intero gruppo sul ghiaccio per ~ 3 min. Ripetere questaprocedura un minimo di 10x.
    4. Determinare la consistenza dell'emulsione ponendo attenzione una piccola goccia su ancora acqua in un becher da 100 ml in vetro. La gocciolina non dovrebbe disperdere in acqua. Se è così, continuare a mescolare fino ad ottenere la consistenza desiderata.
    5. Trasferire il contenuto di emulsione da 3 ml siringhe in 1 ml siringhe Luer-Lok sostituendo una delle due siringhe da 3 ml collegati al rubinetto con la siringa da 1 ml, e inserire un ago 27 G ½ alla siringa 1 ml.
  5. Iniettare 150 ml di emulsione peptide-CFA in dosi per via sottocutanea divisi nelle due regioni inguinali di sei-otto settimane di età femminile A / J topi (~ 75 ml ciascuna).
  6. Somministrare 100 ml di sospensione PT (100 ng) per via intraperitoneale a ciascun animale al giorno 0 e il giorno 2 post-immunizzazione.
  7. Ripetere la procedura immunizzazione al giorno 7 somministrando 150 ml di emulsione peptide-CFA in dosi parziali sottocutanea in entrambi i lati di tegli sterno (~ 75 ml ciascuna). Preparare questa emulsione fresca come sopra. Poi, il giorno 21, sottoporre gli animali a immagini MRM, vedere il punto 3.

2. Manipolazione di animali

  1. Posizionare ciascun topo in una camera di induzione anestetica contenente 2% isoflurano miscela di aria con una piastra elettrica posta sotto per mantenere il calore, e trasferire l'animale a un titolare animale appositamente progettato (Figura 1).
  2. Immobilizzare l'animale in posizione prona sul supporto animale così il muso si inserisce il cono per mantenere l'anestesia (Figura 1). Fissare la testa del topo con un morso-bar attaccato ai denti anteriori del mouse.
  3. Accendere il riscaldamento soffio d'aria con il suo tubo di scarico inserita nel foro verticale dello scanner per mantenere la temperatura corporea degli animali durante l'esperimento.
  4. Mantenere l'anestesia a 0,5 al 2% isoflurano con un flusso di 2 ml / min durante l'intera sessione di imaging. Confermareanestesia con il metodo pinch punta, previsto nessun movimento.
  5. Impostare un sensore pneumatico cuscino, coda di topo / caviglia cardiofrequenzimetro a fibra ottica ossimetria, e la sonda di temperatura rettale per controllare la respirazione, il battito cardiaco e la temperatura corporea, rispettivamente (Figura 1). Nota: gating cardiaco viene eseguita mediante ossimetria Pulse, che permette il monitoraggio non invasivo della saturazione arteriosa di ossigeno nel sangue. Il sensore pulsossimetria deve essere attaccato alla caviglia sinistra, e il piede deve essere fissato con un anello di filo e nastro per mantenere la caviglia nel sensore. Imaging MRM si ottiene gating la respirazione e segnali cardiaci senza l'uso di mezzi di contrasto.

3. Acquisizione Immagine

  1. Dopo aver preparato la (Figura 1) animale, posizionare il mouse al centro dello scanner MRM con cuore posizionato al centro del campo di vista (FOV), dove il campo magnetico è massima omogeneità. NOTA: A wide-bore(89 mm) 9.4 T magnete verticale-foro dotato di gradienti triplice asse di 100 g / cm e 4 cm radiofrequenza (RF) bobina di imaging deve essere utilizzato per ottenere ad alta risoluzione tridimensionale (3D) immagini. Nota: Assicurati di forniture non-magnetici quando si utilizza uno scanner MRI.
  2. Eseguire l'interfaccia di imaging e selezionare "Nuovo studio" dal menu "Opzioni di studio". Digitare "mtune" al bar dei comandi ed eseguirlo per tirare su il "Tune GUI". Quindi selezionare "Start Probe Tune" e fare clic sul pulsante "Autoscale". Il Tune GUI cambierà per mostrare il RFsignal. Utilizzare la melodia / coi remoti manopole alla fine della bobina per sintonizzare la bobina RF alla frequenza di risonanza protonica (400 MHz). Sulla scheda "Start" vai alla pagina "Scansione preliminare" per eseguire la calibrazione della frequenza e della potenza cliccando sui relativi pulsanti. Premi il pulsante XYZ (rapida) sul '"scheda di" Shim studio' linguetta per tirare su la pagina di spessoramento.Vai alla pagina di spessore, selezionare tutte le iterazioni, e premere il pulsante shim per eseguire l'auto spessoramento.
  3. Selezionare una sequenza esploratore dalla scheda "Studio" dell'interfaccia di imaging per localizzare il cuore del mouse. Sulla scheda "Acquire" cambiare il FOV a 35 mm 2 e mantenere le impostazioni predefinite della macchina. Fare clic su Start per eseguire la sequenza; regolare la posizione del supporto animale se il cuore non è al centro del FOV, sintonizzare la bobina RF e avere nuovamente le immagini scout.
  4. Fare clic sul pulsante "GEMS" sequenza sulla scheda "Studio", quindi inserire i parametri di acquisizione sulla scheda "Acquire" corrispondente ottenere due piani ortogonali lungo l'asse corto e lungo l'asse del cuore 20,21. NOTA: I parametri tipici di acquisizione per la scansione gradient-echo sono: spessore di strato, 1 mm; tempo di ripetizione (TR), 200 msec; tempo di eco (TE), 2.67 msec (minimo); flip angle, 25 °; dimensione della matrice inplane, 128 x 128; FOV, 22 millimetri2; numero di acquisizioni, 4; e un tempo approssimativo di acquisizione di 1 min e 30 sec.
  5. Sulla scheda "Adv", selezionare la sequenza "CINE" per raccogliere i asse corto cine immagini RM ossimetria-gated impulsi al fine di misurare i parametri anatomici e funzionali LV. Regolare la posizione e l'angolo delle fette di imaging basata sulla vista asse lungo del cuore con il mouse hovering e trascinamento. Inserire i seguenti parametri di imaging nella scheda "Acquisisci" per ottenere il gradiente echo sequenza cine: TR, 500 msec; TE, 5 msec; FOV 22 mm 2; matrice di acquisizione, 256 x 256; spessore di strato, 1 mm; numero di acquisizioni, 8; numero di fotogrammi, 6; e un tempo di acquisizione di ~ 17 min. Fare clic su Start per avviare l'acquisizione.
  6. Convertire le immagini acquisite in formato DICOM utilizzando la scheda "I / O" del software di imaging e trasferire i file corrispondenti al centro dati per l'elaborazione.
  7. Al termine della procedura di imaging, tuttiow i topi di recuperare dall'anestesia all'interno del filtro-top gabbie. Non lasciare incustoditi i topi fino a che riprendano conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale e conservarle per ulteriori studi, se necessario.

4. Analisi dei dati del Cardiac Magnetic Resonance Imaging Microscopy

  1. Utilizzare il software di settore per analizzare i parametri anatomici e funzionali del LV 19. Con il caricamento delle immagini cine formato DICOM nel software utilizzando il "Image File Open (s)" sottomenu del menu "File". Sulla GUI selezionare 'MRGE' come la tecnica di imaging, 'Cine' come il tipo di immagine e 'asse corto medio-ventricolare' come piano di vista dell'immagine.
  2. Specificare le cornici di tempo da utilizzare per end-diastole e sistole-end attraverso il "Set temporale corrente per porre fine diastole" e "Set temporale corrente per porre fine sistole", rispettivamente sottomenu del menu "Modifica".
  3. In primo luogo fate clic sul pulsante di comando "LV" e poi il "EPI" pulsanti di comando sul pannello in basso a destra "ENDO" e per disegnare manualmente il endocardio ventricolo sinistro ed epicardio, rispettivamente. Rimuovere i muscoli papillari premendo il pulsante di comando corrispondente, allo scopo di aumentare la precisione dei calcoli.
  4. Leggere i parametri quantificati LV come volume diastolico, il volume sistolica, gittata sistolica e frazione di eiezione sul pannello in alto a destra. Fare clic sul pulsante di comando "Varie" e poi il pulsante di comando "Misura pinza" per misurare i parametri LV quali lo spessore della parete, e il diametro ventricolare 22.
  5. Fare clic sul sottomenu "Salva Sia Immagine Pile e segmentazione" del menu "File" per salvare le immagini, comprese le segmentazioni, in formato '. Mat' per rielaborare le immagini, se necessario.

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Risultati

In questa relazione, viene mostrato l'utilità della tecnica MRM come una modalità non invasiva per determinare i cambiamenti strutturali e funzionali nei cuori di animali affetti da EAM. La miocardite è stata indotta in A / J topi immunizzando gli animali con MyHC-α 334-352 in CFA 7, e gli animali sono stati sottoposti ad esperimenti MRM al giorno 21 post-vaccinazione. La rappresentazione MRM è stata effettuata su animali vivi in ​​anestesia isoflurano a 9.4 T (400 MHz per i protoni), utilizzando un magne...

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Discussione

Questo studio descrive la procedura MRM e la sua utilità come strumento non invasivo per verificare anomalie cardiache in topi affetti da miocardite autoimmune. Poiché le caratteristiche istologiche di EAM assomigliano miocardite postinfettiva degli esseri umani, modelli murini sono comunemente impiegati per delineare i meccanismi immunitari di lesioni miocardiche 23-25. Tuttavia, gli animali affetti da miocardite appaiono clinicamente normali, e la diagnosi è fatta sulla base di istologia al termine degli es...

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Dichiarazioni

Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (HL114669). CM ha ricevuto una borsa di ricerca post-dottorato assegnata dalla Myocarditis Foundation, NJ.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)Neopeptide, Cambridge, MANegozio a 4 ° C
CFASigma Aldrich, St Louis, MO5881Negozio a 4 ° C
MTB H37Rv estrattoDifco Laboratories, Detroit, MI231141Store a 4 ° C
PTElenco Biologicals Laboratories, Campbell, CA181Negozio a 4 ° C
1x PBSCorning, Manassas, VA21-040-CVStore a 4 ° C
IsofluranoPiramal Healthcare, Mumbai, IndiaNDC66794-013-25
Topi femmina A/JJackson Laboratories, Bar Harbor, ME646
Luer-lok sterile 1 ml di sirringaBD, Franklin Lakes, NJ309628
Luer-lok sterile 3 ml di sirringaBD, Franklin Lakes, NJ309657
Ago sterile, 18 GBD, Franklin Lakes, NJ
Ago sterile, 27 1/2 GBD, Franklin Lakes, NJ305109
Rubinetto a 3 vieSmiths Medical ASD, Inc. Dublin, OHMX5311L
bende di garza KerlixCovidien, Mansfield, MA6720
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34155
Protouch StockinetteMedline Industries, Mundelein, IL30-1001
Forbici e pinze chirurgiche steriliINOX tool Corporation
Micro fornoGE Healthcare, 
Sistema di terapia del caldo e del freddo ThermiPAQ Theramics Corporation, Springfield, IL
Lampada riscaldante per rettiliEnergy Savers Unlimited, Inc. Carson, CA
Nastri trasporatori 3MTarget Corporation, MN
Up and Up Unguento antibiotico polimixina B solfato/bacitracina/neomicina solfatoTarget Corporation, MN
North Safety DeciDamp-2PVC tappi per le orecchie in schiumaNorth Safety Prodotti, Smithfield, RI
Applicatore con punta in cotone, 6' ’ gambo di legno Jorgensen Laboratories, Inc. Loveland, CO
Camera di induzione per anestesia Summit Anesthesia Solutions, Ann Harbor, MI
Sistema di supporto per anestesia Summit per la regolazione del flusso di anestesia.Summit Anesthesia Solutions, Ann Harbor, MI
Supporto per animali appositamente progettatoAgilent Technologies, Santa Clara, CA
Bickford  Omnicon F/Aria  unità di filtraggio del gas per anestesia A.M. Bickford, Inc. Wales Center, NY
Modulo pulsossimetro, sistema di monitoraggio e gating per piccoli animali compatibile con la risonanza magnetica.Strumenti per piccoli animali, Inc. Stony Brook, NY
Bombola di ossigeno Matheson-Tri Gas, zona centro-settentrionale, Lincoln, NE
Regolatore del gas Western Medica, West Lake, OH
Modulo di interruzione del segnale, sistema di monitoraggio e gating per piccoli animali compatibile con la risonanza magneticaSmall Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY
Scanner MR con foro centrale verticale da 9,4 T (400 MHz) da 89 mmAgilent Technologies, Santa Clara, CA
Bobina RF per micro-imaging da 4 cmAgilent Technologies, Santa Clara, CA
Monitor PC SAMSmall Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY
Software di analisi delle immagini mediche quantitativehttp://segment.heiberg.se;   Segmento v1.8 R1430,  Medviso, regione di Oresunds, Svezia
Software MatlabThe Mathworks, Inc. Natick, MA
Computer-Sistema operativo Unix
305195 Rotoli di

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