Articolo metodologico

La glutammina Flux Imaging Utilizzando sensori geneticamente codificato

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DOI:

10.3791/51657

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31 luglio 2014

 , 
1Virginia Tech

In questo articolo

Sommario

In questo articolo verrà illustrato come monitorare le dinamiche di glutammina in cellule vive usando FRET. I sensori geneticamente codificate permettono il monitoraggio in tempo reale delle molecole biologiche con una risoluzione subcellulare. Disegno sperimentale, i dettagli tecnici delle impostazioni sperimentali e considerazioni per le analisi post-sperimentali saranno discussi per i sensori di glutammina geneticamente codificati.

Abstract

I sensori geneticamente codificate permettono il monitoraggio in tempo reale delle molecole biologiche con una risoluzione subcellulare. Una enorme varietà di tali sensori per molecole biologiche si sono resi disponibili negli ultimi 15 anni, alcuni dei quali divenne strumenti indispensabili che vengono utilizzati di routine in molti laboratori.

Una delle interessanti applicazioni di sensori geneticamente codificati è l'uso di questi sensori nelle indagini processi di trasporto cellulari. Proprietà dei trasportatori come cinetica e specificità di substrato possono essere studiati a livello cellulare, fornendo possibilità di cellula di tipo analisi specifiche delle attività di trasporto. In questo articolo, vedremo dimostrare come la dinamica dei trasportatori possono essere osservate con sensore di glutammina geneticamente codificato come un esempio. Disegno sperimentale, i dettagli tecnici delle impostazioni sperimentali e considerazioni per le analisi post-sperimentali saranno discussi.

Introduzione

A causa di notevoli progressi nelle tecnologie che consente l'esame del trascrittoma e proteoma a livello cellulare, ora è diventato chiaro che la biochimica e la conseguente flusso di metaboliti e ioni sono altamente tipo cellulare specifico. Ad esempio, nel fegato di mammiferi, degradazione glutammina sequenziale e sintesi vengono effettuate simultaneamente dalle cellule periportale e cellule perivenose rispettivamente, alimentando ammonio al ciclo dell'urea nel primo tipo di cellula consumando eccesso di ammoniaca in quest'ultimo 1-3. In alcuni casi, una significativa eterogeneità biochimica viene rilevato anche in un unico "tipo cellulare" 4, 5. Oltre a questa particolarità spaziale, i livelli cellulari di metaboliti e ioni sono altamente dinamici (per esempio, molecole di segnalazione come Ca 2 + e nucleotidi ciclici). I modelli spazio-temporali dei metaboliti e ioni giocano spesso un ruolo critico nella trasduzione del segnale. MONITORAGGIO dinamiche cellulari di metaboliti e ioni, tuttavia, pongono sfida unica. In molti casi la variazione delle concentrazioni sono rapido e transitorio, esemplificato dal caso di molecole di segnalazione come Ca 2 +, che decade entro ~ 20 msec in spine dendritiche 6. Inoltre, compartimentazione di vie biochimiche all'interno e tra le cellule rende difficile quantificare le dinamiche di metaboliti e ioni con estrazione e cromatografia su colonna / tecniche di spettrometria di massa.

Sensori geneticamente codificate molecole biologiche sono ora ampiamente utilizzati a causa della alta risoluzione spazio-temporale che permette lo sperimentatore di studiare dinamica molecolare di breve durata e / o compartimenti (recensiti 7, 8). Questi sensori geneticamente codificati possono grossolanamente essere suddivisi in due categorie; sensori basati sull'intensità e sensori ratiometic. Sensori basati intensità, in genere costituiti da un dominio di legame e l'influenzaproteina orescent (PQ), e il legame al dominio di legame soluto cambia l'intensità fluorescente. Sensori Ratiometic, d'altra parte, spesso sfruttano Foster Resonance Energy Transfer (FRET) tra due PQ che fungono da coppia FRET. Questi sensori sono costituiti da un dominio di legame e due PQ, e il legame soluto induce la variazione di efficienza FRET tra i due PQ. Un gran numero di sensori per biologicamente importanti metaboliti e ioni sono stati sviluppati negli ultimi dieci anni 8, 9.

Una delle eccitante possibilità offerta da tali sensori geneticamente codificati è il loro uso nell'analisi ad alta risoluzione di processi di trasporto di membrana, che in precedenza non era facile individuare a livello cellulare. Sensori geneticamente codificati facilitano l'analisi dei meccanismi di trasporto come specificità di substrato e pH dipendenza 10, 11. Inoltre, in combinazione con i res geneticheONTI come la biblioteca di RNAi costruisce per organismi modello, è ora possibile effettuare ricerche genome-wide per i processi di trasporto innovativi che utilizzano sensori geneticamente codificati. Infatti, l'uso di organismi geneticamente codificato cavo del sensore alla scoperta dei trasportatori in precedenza non caratterizzate in più casi 12, 13.

Recentemente, il nostro laboratorio ha sviluppato una serie di sensori basati su FRET per la glutammina. Abbiamo dimostrato che i livelli di glutammina cellulare può essere osservata con tali sensori FRET glutammina 10. Questi sensori sono costituiti da un donatore FRET (mTFP1) inserito in un batterica proteina legante glutammina glnH, e un accettore FRET (venus) al C-terminali di glnH (Figura 1). FRET efficienza di questi sensori diminuire in seguito al legame di glutammina, con conseguente diminuzione del rapporto di intensità accettore / donatore. Belle regolazione dei processi di trasporto glutammina è importante nei processi biologici quali neurotransmissione 14, 15 e la manutenzione di ciclo dell'urea nel fegato 1, 16, 17.

Qui vi mostriamo la metodologia di analisi delle attività di trasporto con sensori FRET per la glutammina, con un ampio campo di microscopio a fluorescenza set-up. Lo scopo degli esperimenti mostrato qui di rilevare attività trasportatore in una singola cella ed esaminare specificità di substrato di un trasportatore transitoriamente espressa.

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Protocollo

1. Preparazione del campione

Nota: In molti casi gli esperimenti di perfusione lavare via una porzione significativa di cellule, che può diventare un problema frustrante. Sebbene non necessario per tutte le linee cellulari, superfici di vetro coperchio rivestimento con poli-L-lisina (aggiungere 1,0 ml/25 cm 2 di soluzione 0,01% in superficie, incubare> 5 min, lavare due volte con acqua di grado coltura cellulare, e secco l'armadio biosicurezza) migliora l'adesione cellulare. Inoltre, essere consapevoli del livello di biosicurezza (BSL) della linea cellulare utilizzata, e seguire la procedura operativa standard approvato dall'ufficio di salute e sicurezza ambientale locale. In questo esperimento, le cellule COS7 stati usati a causa della bassa attività di trasporto glutammina endogena (vedi Figura 4).

  1. Seme cellule COS7 a ~ 70-80% di confluenza in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + siero di vitello cosmica 10% e 100 U / ml di penicillina / streptomicina, sia su sterili 25 millimetri vetrini coprioggetto posti in coltura da 6 pozzettipiatto o 8 pozzetti vetrini con fondo di vetro. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità per 24 ore.
  2. Scambiare il mezzo di crescita per DMEM siero di vitello cosmici +10% (antibiotici), secondo il protocollo del produttore. Grow O / N a 37 ° C, 5% CO 2 al 100% di umidità.
  3. Aggiungere 0,4 mg ciascuna di DNA plasmidico codificante il sensore glutammina (pcDNA3.1, portando sensore FLIPQTV3.0 sotto promotore CMV 10) e il ASCT2 mCherry-tag 10 a 50 ml terreni privi di siero (OPTI-MEM) e mescolare delicatamente.
  4. Aggiungere 1 ml di reagente di trasfezione a 50 ml terreni privi di siero. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
  5. Mescolare le due soluzioni contenenti DNA (fase 1.3) e reagente di trasfezione (passo 1.4) e incubare per 20 min.
  6. Aggiungere delicatamente il reagente di trasfezione sulla parte superiore delle cellule e mescolare delicatamente a dondolo camera. Incubare per 24 ore a 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità.
  7. Dopo 24 ore, scambiare il mezzo di DMEM + 10% Cosmic Calf Serum(CCS) + 100 unità di penicillina / streptomicina.
  8. Le cellule vengono esposte 48-72 ore dopo la trasfezione.

2. Esperimento perfusione

Nota: Per le cellule COS7 utilizzati in questo esperimento, i media di perfusione e la camera sono stati mantenuti a temperatura ambiente e la concentrazione di CO 2. Tuttavia, se le cellule in uso richiedono una temperatura più alta e CO 2 di controllo della concentrazione per la sopravvivenza, palco microscopio riscaldamento e / o una camera ambientale dovrebbe essere usato.

  1. Preparare perfusione tampone AF (Vedere elenco dei materiali). Fissare rubinetti a 50 ml siringhe, chiudere i rubinetti poi riempirli con le soluzioni di perfusione. Aprire il rubinetto per un breve periodo ad occupare lo spazio di testa del rubinetto con il tampone.
  2. Accendere il 8 canali, sistema di perfusione a gravità con una matita perfusione, e quindi selezionare "Modalità manuale" sotto Selezionare l'opzione Function. Posizionare un contenitore di rifiuti sotto la matita perfusione.
  3. Manualmenteattivare le porte premendo i numeri corrispondenti e riempire i tubi con siringa da 10 ml contenente acqua, e poi chiudere la porta. Una volta che le porte sono riempite con acqua, impostare le siringhe contenenti tamponi AF sulla porta 1-6 del sistema di perfusione, e quindi aprire i rubinetti. Aprire nuovamente le porte per sostituire l'acqua nel tubo con gli ammortizzatori. La portata deve essere di circa 0,8 ml / min.
  4. Premere annullare una volta sul controller perfusione per tornare al menu "Select Function". Alterna l'opzione "Modifica Programmi", quindi digitare nel protocollo di perfusione indicato nella Tabella 1. Salvare il programma di perfusione.
  5. Prendete le cellule fuori dell'incubatore. Lavare due volte con il buffer di perfusione, e quindi impostare le celle sul palco. Collegare il sistema di perfusione alla camera. Se viene utilizzata una camera aperta, impostare un'altra pompa che rimuove la soluzione di perfusione dalla camera.
  6. Aprire il software Slidebook. Inizia una nuova diapositiva.
    Nota: L'seguente procedura è specifica per software Slidebook, ma altri software come MetaFluor e Nis-elemento può essere utilizzato anche per il tipo di rappresentazione qui descritto. Teoricamente esperimenti possono essere eseguiti utilizzando qualsiasi software che permette l'imaging time-course, e le sequenze di immagini possono essere analizzati post-sperimentale utilizzando software come ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) o Fiji (http:/ / fiji.sc / Fiji). Tuttavia, il software che consente il monitoraggio in tempo reale di rapporto accettore / donatore è molto utile.
  7. Montare il vetrino sul palco microscopio a fluorescenza. Trova le cellule co-esprimono il sensore e ASCT-mCherry utilizzando appositi set di filtri (vedi elenco dei materiali) con la funzione "FOCUS". Regolare il guadagno facendo clic sulla scheda "Camera" e facendo scorrere la barra di scorrimento sotto "guadagno". Inoltre, regolare l'impostazione filtro a densità neutra dal menu a discesa filtro a densità neutra. Nota: Se il cubo del filtro non include un filtro occhio, non usare i pezzi oculari da Short-lunghezza d'onda di luce di eccitazione è dannoso per gli occhi. Usare lo schermo del computer per individuare le celle invece.
  8. Acquisire immagini di cellule with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (I filtri sono specificati nell'Elenco dei materiali). Fare clic su "Acquisizione Immagine", quindi nella finestra di acquisizione, specificare i filtri che stanno per essere utilizzati. Fare clic sul pulsante "TEST" per regolare il tempo di esposizione digitando il tempo di esposizione desiderato nella casella accanto alle impostazioni del filtro. Nota: Tutti e tre i canali devono essere esposti per la stessa lunghezza. Quando si regolano i parametri di imaging, prendere il cambiamento efficienza FRET previsto e piega aumentare in considerazione: per esempio, se l'efficienza FRET si prevede di salire due volte durante l'esperimento, i parametri di imaging devono essere regolatiin modo che l'intensità di donatori ex Acceptor em Allo stato di riposo deve essere <50% del valore massimo che può essere registrato dallo strumento, in modo che il canale non si saturi durante l'esperimento. Segnale dalle cellule marcate dovrebbe essere almeno tre volte superiore a quello della regione di sfondo.
  9. Prelievo di una regione di interesse utilizzando lo strumento regioni del software. In alternativa, una funzione software per selezionare i pixel sopra certa intensità può essere utilizzato, e quindi convertito in regioni. Per effettuare questa operazione, fare clic su Maschera - Segment, quindi spostare la barra di scorrimento per evidenziare le aree desiderate.
  10. Selezionare "time lapse" nella casella Tipo di acquisizione, quindi specificare l'intervallo (10 sec in questo esperimento) e punti di tempo per l'esperimento.
  11. Disegnare una regione in uno spazio senza alcuna cellule fluorescenti. Questa area è utilizzata per la sottrazione del fondo. Fare clic destro regione disegnata, e quindi impostare come sfondo. Nota: Idealmente, le cellule che non sonot esprimendo i sensori deve essere utilizzata come area di sfondo in considerazione sia la autofluorescenza e la fioritura sfondo rilevato dalla fotocamera. Se le suddette cellule sono disponibili nel campo visivo, almeno una regione senza le celle deve essere utilizzato per spiegare la fluorescenza di fondo.
  12. Selezionare il programma desiderato sotto "Select Function - Eseguire programmi" l'opzione. Alternare al programma memorizzato (vedere la fase 2.3), e poi ha colpito INVIO sul controller perfusione. Ora il programma viene caricato, e premendo un tasto qualsiasi inizierà la perfusione.
  13. Garantire perfusione e l'esperimento di imaging avviare Allo stesso tempo facendo clic sul pulsante "Start" nella finestra di acquisizione al tempo stesso come la pressione di un tasto sul controller perfusione.
    Nota: Si consiglia di registrare il tempo di valutazione in cui sono state scambiate le soluzioni (questo può essere fatto utilizzando funzione "Note", che si trova all'interno della scheda di acquisizione).
  14. Eseguire la stessa perfusione protocollo USIng cellule esprimenti un sensore che dovrebbe essere saturi o non associati a condizione sperimentale.
    Nota: Qui, FLIPQTV3.0_1.5μ, che è saturo condizione sperimentale, viene usato come controllo, Figura 6 Tali esperimenti di controllo sono necessari per confermare che il cambiamento efficienza FRET è dovuta alla variazione effettiva del substrato e non. a causa del cambiamento di altri parametri quali pH cellulare.

3. Post-esperimento di analisi

  1. Esaminare se si è verificato deriva campione durante l'esperimento. Disegnare regioni di interesse (ROI) s sull'immagine scattata a timepoint 0, quindi spostare la barra di scorrimento nella parte superiore della finestra di imaging e verificare se le cellule cadono le ROI nelle immagini scattate nel corso della sperimentazione.
  2. Se sì, allora utilizzare la funzione di tracking per correggere la deriva in primo luogo, la creazione di maschere intorno alle cellule selezionando Mask - Segment, quindi far scorrere la linea che specifica il taglio di HIGhlight le regioni contenente cellule. Traccia le regioni cliccando Mask - tracciamento di particelle - il monitoraggio di base delle particelle.
  3. Ri-disegnare il ROI e lo sfondo regione quando necessario.
  4. Esportare l'intensità media dei ROI nel corso dell'esperimento. Fare clic su Statistiche - Esporta - Dati Rapporto / timelapse.
  5. Quando l'efficienza FRET e la quantificazione della concentrazione del substrato non è necessario, tracciare l'andamento temporale del rapporto di intensità (Donor ex Acceptor em, / donatori ex donatori em) come proxy della dinamica del substrato. Per determinare la concentrazione citosolica, calcolare il massimo e minimo cambiamento rapporto (ossia alla saturazione e assenza del substrato, rispettivamente), Ar max - Ar min, mediante regressione non lineare di Δratio (Ar) con la seguente equazione:
    Ar = [S] / (K d + [S]) x (Ar max - min Ar) + Ar min
    dove [S] è la concentrazione del substrato nel citosol. Utilizzando i Ar max - min valori Ar ottenuti, la saturazione (S) del sensore in un dato Ar è calcolato come
    S = (Ar - Ar min) / (Ar max - min Ar)
    S può inoltre essere convertito in concentrazione del substrato [S] con la seguente equazione:
    S = [S] / (K d + [S])
    Nota: l'intensità del canale em Acceptor ex Acceptor dovrebbe essere anche tracciato di esaminare se la condizione sperimentale influenzato la fluorescenza del accettore direttamente.
  6. Quando si osserva una deriva della linea di base a causa di fotometabolismo, eseguire una correzione al basale. Per fare questo, tracciare le intensità di donatore e accettore nel tempo (Figura 5A). Poi identificare i punti temporali utilizzati per ªe basale, secondo il ritardo nel sistema di perfusione e l'attività di trasporto del particolare cellula (Figura 5B).
  7. Calcolare un raccordo polinomio che meglio descrive la linea di base. Poi, normalizzare l'intensità grezzo da ogni tempo di valutazione al basale (Figura 5C). Calcolare il rapporto di intensità (Donor ex Acceptor em, / donatori ex donatori em) dalle intensità donatore e accettore normalizzati.

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Risultati

Tipici esperimenti time-corso sono rappresentati in Figura 2. In questi esperimenti, FRET sensori di glutammina con affinità di 8 mm (FLIPQTV3.0_8m, Figura 2A e 2B) e 100 micron (μ FlipQTV3.0_100 C e D) sono stati co-espressi con un obbligatorio scambiatore amminoacido ASCT2 18 in cellule COS7 10. Afflusso di glutammina viene rilevato come variazione rapporti di intensità di fluorescenza tra il donatore (mTFP1) e l'accettore (venus) (Fi...

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Discussione

Il successo di esperimenti di imaging dipende da alcuni fattori critici. Uno di questi fattori è l'affinità di sensori utilizzati, come discusso sopra. Concentrazione assoluta del substrato nel compartimento subcellulare di interesse, tuttavia, è spesso sconosciuta. Pertanto si consiglia di provare diversi sensori con affinità sfalsati per trovare quello che funziona meglio sotto la condizione sperimentale desiderato. Ad esempio, nel nostro caso abbiamo trasfettato cellule COS7 con sensori di glutammina con 1.5μ, 10...

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Dichiarazioni

Non c'è nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere 1R21NS064412, concessione NSF 1.052.048 e Jeffress Memorial Trust concessione J-908.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Microscopio a fluorescenza invertitaOlympusIX81F-3-5Sarebbe appropriato anche un microscopio a fluorescenza invertito equivalente di altri fornitori.
Filtro di eccitazione (mTFP1)Omega Optical3RD450-460Larghezza di banda 450-460 nm
Filtro di eccitazione (Venere)ChromaET500/20Larghezza di banda 490-510 nm
Filtro di emissione (mTFP1)ChromaHQ495/30mLarghezza di banda 475-505 nm
Filtro di emissione (Venere)ChromaET535/30mLarghezza di banda 520-550 nm
Specchio dicroico (canali FRET)Chroma470dcxrpassaggio lungo, taglio a 470 nm
(canale YFP)Chroma89002bsPassaggi a 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm
mSet di filtri CherryChroma49008Eccitazione 540-580 nm, dicroico a passaggio lungo con taglio a 585 nm, filtro di emissione 595-695 nm
Sorgente luminosaOlympusU-LH100L-3-5Sorgente luminosa a LED o alogena che produce un'intensità luminosa stabile, le lampade al mercurio non sono consigliate
Telecamera CCDQimagingRolera-MGi EMCCD
Obiettivo a fluorescenza apocromaticaOlympus
, ValveBank IIAutoMate Scientific[01-08]Funzionerebbero anche altri sistemi di perfusione che consentono un rapido scambio di soluzioni
Camere a flusso laminareC& L InstrumentsVC-MPC-TWAltre camere a flusso larmenare funzionerebbero.
Vetrino a cameraLab-Tek154534Per esperimenti a camera aperta
Pompa di perfusioneThermo Scientific74-046-12131Per esperimenti a camera aperta
Software che supporta le misure raziometricheIntellegenent Imaging InnovationSlidebook 5.5
Cabina di biosicurezza a flusso laminareESCOLA-3A2
Isotemp CO2 IncubatoreThermo Scientific13-255-25
MEM di Dulbecco (DMEM)HycloneSH30243.01
Siero cosmico di vitelloHycloneSH3008703
Penicillina/streptomicinaHycloneSV30010
Terreno privo di siero per la trasfezione (OPTI-MEM I)Invitrogen31985Utilizzato con Lipofectamine 2000
Soluzione di poli-L-lisinaSigmaP4707
25 mm vetrini circolari in vetroThermo Scientific12-545-102Nel caso in cui si utilizzi VC-MPC-TW
Lipofectamine 2000Invitrogen11668027Possono essere utilizzati anche altri reagenti di trasfezione.
Soluzione A (tampone di Hank)9,7 g di sale HANK (Sigma H1387), 0,35 g di NaHCO3, 5,96 g di HEPES a 1 L, pH regolato a 7,35 con NaOH
Soluzione BSoluzione A + 0,04 mM Gln
Soluzione CSoluzione A + 0,2 mM Gln
Soluzione DSoluzione A + 1 mM Gln
Soluzione ESoluzione A + 5 mM Gln
Soluzione FSoluzione A + 5 mM Ala
Specchio dicroico a Sistema di perfusione

Riferimenti

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