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Articolo metodologico

Imaging cellulare dal vivo di primaria ratto neonato Cardiomyocytes seguito Adenoviral e lentivirali trasduzione Uso confocale Spinning Disk Microscopia

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DOI:

10.3791/51666

⸱

24 giugno 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max-Planck-Institute for Molecular Biomedicine and Institute of Cell Biology, 2Department of Internal Medicine, Yale Cardiovascular Research Center and Section of Cardiovascular Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo di imaging di cellule vive utilizzando cardiomiociti neonatali primari di ratto dopo trasduzione lentivirale e adenovirale utilizzando la microscopia confocale a disco rotante. Ciò consente osservazioni dettagliate dei processi cellulari nei cardiomiociti viventi.

Abstract

Primario cardiomiociti neonatali di ratto sono utili in base nella ricerca cardiovascolare vitro perché possono essere facilmente isolati in gran numero in una singola procedura. Grazie ai progressi nella tecnologia del microscopio è relativamente facile per catturare immagini di cellule in vivo allo scopo di indagare eventi cellulari in tempo reale con una minima preoccupazione per quanto riguarda fototossicità alle cellule. Questo protocollo descrive come prendere le immagini timelapse cellule vive di ratto primaria cardiomiociti neonatali utilizzando un microscopio confocale disco rotante che segue la trasduzione lentivirale e adenoviral di modulare le proprietà della cella. L'applicazione di due diversi tipi di virus rende più facile per raggiungere un adeguato livello dei tassi di trasduzione e di espressione di due geni diversi. Immagini di cellule vive bene focalizzate possono essere ottenuti utilizzando il sistema autofocus del microscopio, che mantiene a fuoco stabile per lunghi periodi di tempo. Applicando questo metodo, le funzioni di ingegnere esogenamenteproteine ​​di ed espressi in cellule primarie in coltura possono essere analizzati. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per esaminare la funzione dei geni attraverso l'uso di siRNA nonché di modulatori chimici.

Introduzione

Ratto cardiomiociti neonatali primari sono stati a lungo utilizzati per indagare la funzione dei cardiomiociti in vitro 1. Sono facili da isolare da cuccioli di ratto da diversi metodi ben consolidati 2-4. Il metodo più comune impiega collagenasi o tripsina per digerire tessuto connettivo del cuore prima isolamento cellulare. I ricercatori hanno anche sviluppato metodi per isolare cardiomiociti da roditori adulti 5-8 così come topi neonati 9,10.

Questo protocollo descrive un metodo per isolare cardiomiociti da cuccioli di ratto neonatale, impiegando una procedura in due fasi digestione enzimatica. Tripsina prima utilizzazione O / N a 4 ° C, e poi collagenasi purificata a 37 ° C. L'incubazione del tessuto cardiaco con tripsina O / N a 4 ° C riduce i passi necessari per cellule raccolto rispetto ai metodi mediante incubazioni sequenziali in soluzione enzimatica caldo 2. Inoltre, utilizzando co purificatallagenase piuttosto che gli enzimi greggio, la variabilità da lotto a lotto può essere eliminato, fornendo così una maggiore riproducibilità.

Studi funzionali di una particolare proteina spesso utilizzano un sistema di espressione della proteina utilizzando un adenovirus 11-13 e / o un lentivirus 14-16. [Nota cautelativa] La produzione virale e la manipolazione devono essere eseguite secondo le linee guida NIH.

L'adenovirus non si integra nel genoma dell'ospite. Ha una altissima efficienza di trasduzione nella maggior parte dei tipi cellulari, tra cui cellule in divisione e le cellule che non si dividono, così come le cellule primarie e linee cellulari stabilizzate. Questo rende l'adenovirus un vettore affidabile per l'espressione genica. Alti livelli della proteina codificata dal vettore adenovirus sviluppano in 48 hr seguente trasduzione, e possono durare per diverse settimane 17. Tuttavia, uno svantaggio di utilizzare un adenovirus per l'espressione proteica è che lo sviluppo di un ade ricombinantenovirus è sia complicato e richiede tempo. Questo inconveniente spiega in parte perché molti ricercatori sono state girando a lentivirus per l'espressione del gene ricombinante. A differenza dei costrutti adenovirali, generando un costrutto lentivirale è semplice e veloce. Sebbene lentivirus hanno generalmente inferiori efficienze di trasduzione di adenovirus, in entrambe le cellule in divisione e non si dividono, esse integrarsi nel genoma dell'ospite. Di conseguenza, l'espressione del gene trasdotto è più stabile per lentivirus che per adenovirus.

Grazie ai progressi tecnologici nel campo della microscopia, è molto più facile per catturare immagini di cellule in vivo di cellule esprimenti proteine ​​ricombinanti. Questo vale anche a velocità di tasso di video di acquisizione. Questo permette al ricercatore di determinare come particolari alterazioni nella proteina di interesse impatto funzionalmente cella in tempo reale. Il microscopio confocale disco rotante ha diverse caratteristiche chiave che rendono una tecnica ottimale per livl'imaging cellulare e 18,19. Il disco rotante Yokogawa consente molto più rapida acquisizione delle immagini, mentre allo stesso tempo utilizzano energia laser molto meno di scansione punto microscopi confocali. Entrambe queste particolarità sono dovute al disco rotante, che contiene numerosi fori confocali attraverso cui il laser passa contemporaneamente ai campioni. Durante l'acquisizione, il disco stesso gira velocemente e 18-20. Utilizzando il sistema autofocus del microscopio, messa a fuoco stabile viene mantenuta per lunghi periodi di tempo. Questo permette ai ricercatori di scattare immagini di cellule vive ben focalizzati. Immagini acquisite vengono riprodotti come file di filmato. Le immagini sono analizzate utilizzando il software di analisi delle immagini, come ImageJ 21,22, FIJI 23, o altri software disponibili in commercio.

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Protocollo

1. Isolamento di ratto cardiomiociti neonatali

  1. Utilizzare mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) e medio minimo essenziale (MEM) addizionato con siero fetale bovino (FBS) e penicillina / streptomicina (P / S) come mezzo di coltura. Aggiungere bromodeossiuridina (BrdU) al mezzo per prevenire la crescita di fibroblasti per i primi 2 giorni dopo l'isolamento.
Medio Base FBS BrdU (mm) P / S (U / ml)
selezione DMEM 10% 0 20
Il primo giorno DMEM 10% 0.1 10
Il giorno successivo DMEM / MEM 5% 0.1 10
Ulteriore cultura DMEM / MEM 5% 0 10

Tabella 1:. Medio per cardiomiociti neonatali di ratto Utilizzare questo supporto per la coltura di cardiomiociti neonatali di ratto. DMEM / MEM è 1:1 mix di DMEM e MEM medium.

  1. Isolamento dei cardiomiociti, 1 ª giornata (Stima tempo necessario, circa 1 ora)
    NOTA: Per il lavoro con i roditori neonatali, fare riferimento alle linee guida universitari locali e le regole stabilite dai programmi di cura degli animali, e di aderire ai protocolli di animali istituzionalmente riconosciuti. Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono state approvate dal Comitato Istituzionale cura degli animali e uso del Resource Center Animal Yale.
    1. Preparare i reagenti e strumenti: soluzione salina bilanciata di calcio e magnesio libero di Hank (CMF HBSS), 30 ml x 2, 10 ml x 2, sul ghiaccio; 1 mg tripsina, ricostituito con 2 ml di CMF HBSS, su ghiaccio; strumenti in autoclave; 70% di etanolo (EtOH) in 250 ml becher; quattro sterilizzati 10 centimetri piatti di plastica, tre per l'isolamento di cuori e uno per tripsinizzazione.
    2. Ordine 1 Litter di 1-a-2-giorni di età cuccioli di ratto (circa 10 PUP) con la loro madre da un distributore animale sperimentale.
    3. Day1, Trasferimento cuccioli di piccola gabbia e eutanasia diga con un cocktail di ketamina / xylazina (ketamina, 200ml/10g e xilazina 20ml/10g) overdose.
    4. Prendere un cucciolo e sterilizzare tutto il suo corpo con il 70% EtOH. Decapitare prole con forbici chirurgiche affilate e ben tenute su un piatto di plastica 10 centimetri sterilizzato in un luogo isolato dagli altri cuccioli.
      NOTA: Per raccogliere i campioni più velocemente possibile, è preferibile usare il metodo più rapido ed efficiente per annullare la vita del roditore. Decapitazione se correttamente utilizzato da professionisti qualificati con attrezzature in buone condizioni può provocare meno paura e ansia per l'animale ed essere più rapido e pratico rispetto ad altre forme di eutanasia. Essa è coerente con le raccomandazioni dei medici veterinari Linee guida dell'Associazione Americana per l'eutanasia degli animali.
    5. Rimuovere battendo luiarte con strumenti sterilizzati, e mettere il cuore in 30 ml di ghiaccio raffreddato CMF HBSS in tubo da 50 ml. NOTA: Rimuovere i cuori più velocemente possibile e metterli immediatamente in ghiaccio. Dopo aver rimosso il cuore dal corpo, tutte le procedure devono essere eseguite su ghiaccio.
    6. Raccogliere 5 cuori in 30 ml di ghiaccio raffreddato CMF HBSS e le restanti cinque cuori in altri 30 ml di ghiaccio raffreddato CMF HBSS. Agitare il tubo per sciacquare i cuori. NOTA: Dopo questo passo, effettuare le procedure in una cappa a flusso laminare.
    7. Eliminare il surnatante e trasferire i cuori di una nuova sterilizzato piatto di plastica 10 centimetri sul ghiaccio. NOTA: Fare attenzione a non aspirare cuori con l'aspiratore.
    8. Rimuovere grandi navi e / o tessuti indesiderati. Aggiungere 10 ml di ghiaccio raffreddato CMF HBSS al piatto per sciacquare i cuori.
    9. Trasferire tutti i cuori in una nuova sterilizzato piatto di plastica 10 centimetri sul ghiaccio. Tritare i cuori con le forbici a meno di 1 mm 3 su ghiaccio.
    10. Aggiungere 9 ml di freddo CMF HBSS. Aggiungere 1 ml di freddo tripsina ricostituzionestituito con CMF HBSS (finale 50 ug / ml).
    11. Sigillare il piatto con parafilm e coprire con un foglio di alluminio, poi metterlo in camera fredda (4 ˚ C) durante la notte.
  2. Isolamento dei cardiomiociti, 2 ª giornata (Stima tempo necessario, circa 4 ore)
    1. Preparare i reagenti e strumenti: 50 ml conica tubo x 2; 2 inibitore della tripsina mg, ricostituito con 1 ml di CMF HBSS, su ghiaccio; 1500 unità collagenasi, ricostituito con 5 ml di Leibovitz L-15, a temperatura ambiente (RT); Leibovitz L-15, ricostituito con 1 litro di acqua sterilizzata e filtrare attraverso un filtro da 0,22 micron, 8 ml a temperatura ambiente; 10 mg / ml (32.6 mM) BrdU in acqua; P / S; DMEM + 10% FBS; MEM; due 10 centimetri di plastica di coltura cellulare piatti; Piatti 3,5 centimetri con fondo di vetro.
    2. Day2, Preparazione di piatti di gelatina rivestito. Aggiungere 1 ml di soluzione di gelatina 0,1% per rivestire un piatto fondo di 3,5 centimetri di vetro per un esperimento di imaging. Incubare piatti a 37 ˚ C per diverse ore, poi aspirare e scartare la soluzione di gelatina prima dell'uso.
      NOTE: Un piatto fondo di 3,5 centimetri bicchiere è adatto per un esperimento di imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza. Per estrarre proteine ​​da cardiomiociti primari per rilevare l'espressione della proteina mediante western blotting (WB), possono essere utilizzati rivestite piatti di coltura di cellule di plastica 0,1% di gelatina.
    3. Trasferire tutto tessuto cardiaco digerito con tripsina notte con tampone in una provetta da 50 ml su ghiaccio nella cappa sterile. Aggiungere 1 ml di inibitore della tripsina in CMF HBSS (finale 182 ug / ml). Chiudere il coperchio del tubo conico da 50 ml ermeticamente per evitare la contaminazione.
    4. Incubare la provetta per circa 30 minuti in un incubatore a 37 ˚ C per riscaldare il tessuto e buffer per 30-37 ˚ C. Aggiungere 5 ml di collagenasi in Leibovitz L-15 (finale di 94 unità / ml). Incubare a 37 ˚ C per 45 min con dolce agitazione (170-200 rpm shaker nel 37 ˚ C incubatore).
      NOTA: Questa fase può essere effettuata al di fuori della cappa a flusso laminare. Tutti i passi successivi devono essere effettuate a temperatura ambiente.
    5. Disinfettare la superficie esterna di un tubo conico da 50 ml con il 70% EtOH e metterenella cappa sterile.
    6. Tessuti triturare con auto pipetta con pipettaggio a 3 ml / sec di velocità di 20 volte. Lasciare residui di tessuto di stabilirsi per 3 minuti e filtrare il surnatante con una um filtro cella 70.
      NOTA: Un normale formato 10 ml pipetta può essere utilizzato per la triturazione.
    7. Aggiungere 5 ml della Leibovitz L-15 per i grumi di tessuto rimanenti e triturare e filtrare nuovamente il surnatante. Lavare filtro cella con 2 ml di Leibovitz L-15.
    8. Posizionare soluzione di cellule filtrata in una cappa per 20 - 60 min per permettere collagenasi di digerire il collagene parzialmente degradata.
    9. Cellule sedimenti a 100 x g per 5 min. Risospendere le cellule in 20 ml di DMEM contenente 10% FBS ed alta concentrazione P / S (20 U / ml).
    10. Cellule pre-piastra su due 10 centimetri di plastica piatti di coltura di cellule per 1 ora in CO 2 incubatore a 37 ˚ C per la selezione dei cardiomiociti. NOTA: I fibroblasti attaccano più facilmente al fondo del piatto di cardiomiociti.
    11. While attesa, preparare DMEM contenente 10% FBS, P / S (10 U / ml) e 0,1 mM BrdU. Aggiungere 1 ml di 10 mg / ml BrdU per 325 ml di DMEM contenente 10% FBS e P / S.
    12. Agitare delicatamente piatti e raccogliere i cardiomiociti contenente surnatante da due 10 centimetri piatti.
      NOTA: La maggior parte dei cardiomiociti saranno ancora galleggiando nel surnatante dopo 1 ora di incubazione. Per evitare di contaminare con fibroblasti che sono leggermente attaccati al piatto, non raccogliere il surnatante pipettando.
    13. Facoltativo> Contare le celle nel surnatante con e senza lo 0,2% trypan blu per verificare la vitalità cellulare.
    14. Cellule sedimenti a 100 x g per 5 min. Risospendere le cellule in DMEM contenente 10% FBS, P / S (10 U / ml) e 0,1 mM BrdU. Cellule Piatto a 2 x 10 5 cellule / piatto in 3,5 centimetri di vetro piatti peggiori gelatina rivestite per l'osservazione al microscopio. NOTA: Non disturbare le cellule dopo la placcatura per almeno 24 ore in CO 2 incubatore a 37 ˚ C.
    15. Giorno 3, ChaESN media 24 ore dopo la placcatura di DMEM / MEM contenente il 5% FBS, P / S e 0,1 BrdU mm.
    16. Giorno 4, Cambiare media 48 ore dopo la placcatura di DMEM / MEM contenente il 5% FBS e P / S.
      NOTA: Cambiare medio ogni 2-3 giorni con DMEM / MEM contenente il 5% FBS e P / S.

2. Trasduzione lentivirali

  1. Confezionamento di plasmidi lentivirali
    NOTA: Si prega di fare riferimento ad altre fonti per ulteriori informazioni approfondite su questo argomento 24-26. Ci vorranno circa 3 giorni per preparare la soluzione lentivirale. E 'meglio usare la soluzione lentivirali fresco per ottenere una maggiore efficienza di trasduzione. Avviare il confezionamento di plasmidi lentivirali e l'isolamento di cardiomiociti neonatali di ratto in parallelo. Invece di utilizzare polietilenimmina (PEI) 27 per il confezionamento di plasmidi lentivirali, un reagente di trasfezione disponibile in commercio può essere utilizzato. Seguire le istruzioni del produttore.
    1. Preparare i reagenti e strumenti; HEKCellule 293T, 10 centimetri di plastica piatti di coltura cellulare, soluzioni plasmidi lentivirali (pMDLg / pRRE, PRSV-Rev, pMD2.G, trasferimento di vettori lentivirali, 1,0 mg / ml), 1 g / l PEI, terreno privo di siero, 20 mM clorochina in acqua, il 10% di candeggina, 1% SDS nel 70% EtOH
    2. Giorno 0, Piatto 2-2,5 cellule x 10 6 HEK 293T per 10 cm sfornano il giorno prima trasfezione.
      NOTA: 30-60% di confluenza a transfezione è ottimale.
    3. Giorno 1, Preparazione di una soluzione di trasfezione PEI. Aggiungere 30 ul di 1 g / l PEI a 960 ul terreno privo di siero in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 4 plasmidi nella soluzione di trasfezione PEI nel tubo da 1,5 ml, e mescolare con maschiatura.
    Nome del plasmide Appunto Dimensioni (kbp) volume aggiunto (ml) Importo finale in 10 centimetri piatto (mg) Concentrazione finale di 10 centimetri piatto (pm)
    Trasferimento di vettori lentivirali codifica gene da confezionare 9-13 3,6-5,2 3,6-5,2 60
    pMDLg / pRRE esprime HIV-1 gag / POL 8.8 1.76 1.76 30
    PRSV-Rev esprime HIV-1 REV 4.1 0.82 0.82 30
    pMD2.G esprime VSV G 5.8 1.16 1.16 30

    Tabella 2:. La quantità di plasmidi per l'imballaggio lentivirali Utilizzare questi importi plasmide per trasfettare cellule HEK293 in 10 piatti cm. Importo finale del trasferimento di vettori lentivirali per ogni piatto può variare in base alle sue dimensioni, mantenere la concentrazione finale per ogni piatto a 60 pM. Peso molecolare medio di una coppia di basi di DNA a doppio filamento è 660 dalton.

    1. Scartare vecchio mezzoda 10 cm piatto di cellule HEK 293T, e delicatamente aggiungere 9 ml di nuovo medium (DMEM + 10% FBS, senza P / S).
    2. Aggiungete il composto di PEI-DNA delicatamente goccia a goccia sul piatto e mescolare delicatamente per mescolare con il mezzo. Aggiungere 10 ul di clorochina 20 mm (finale 20 uM) a 10 ml di media. NOTA: La clorochina è pensato per ridurre la degradazione dei complessi trasfezione contenenti plasmidi mediante parziale neutralizzazione del pH nei compartimenti lisosomiali 28.
    3. Incubare in CO 2 incubatore a 37 ˚ C per 6 ore. Quindi, rimuovere terreno contenente la miscela PEI-DNA e aggiungere 10 ml di nuovo (DMEM + 10% FBS + 20 mM 4 - acido (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES), pH7.4 + P / S) . NOTA: Dopo l'incubazione, virus sarà prodotta nel mezzo. Pipette e / o suggerimenti aspirante Pasteur devono essere decontaminati del 10% di candeggina. Decontaminare sempre la superficie cappa di sicurezza biologica e le attrezzature potenzialmente contaminate con il 70% EtOH indipendentemente dal fatto che surnatante è stato versatoo non. Se si è verificato fuoriuscite di decontaminazione completa con 1% SDS nel 70% EtOH è necessario.
    4. Giorno 2-3, incubare in CO 2 incubatore a 37 ˚ C per 48-72 ore. Giorno 4, raccogli soluzione lentivirali (la Sezione 2.2).
      NOTA: Piano può essere modificato in 48 ore dopo la trasfezione. Raccolta surnatante virus 48 ore e 72 ore per due volte può raggiungere per ottenere soluzioni antivirus titolo più elevati.
  2. Raccolta di soluzione lentivirali e trasduzione
    1. Preparare reagenti e strumenti: 15 ml provette coniche, 1 M HEPES, pH7.4 (0,22 um filtrato)
    2. Giorno 4, Collect surnatante contenente particelle lentivirali (soluzione lentivirali) con 10 ml sterilizzati siringa Luer-Lok, quindi filtrare il surnatante con 0,45 um filtrare in un tubo da 15 ml. Aggiungere 1/100 volume di 1 M HEPES pH7.4 alla soluzione lentivirali filtrata (finale 10 mm).
      NOTA: Per il filtraggio, utilizzare solo asso di cellulosatate o polietersulfone (PES) (basso legame di proteine) filtri. Non utilizzare filtri di nitrocellulosa. Nitrocellulosa lega proteine ​​di superficie sulla busta lentivirale e distrugge il virus.
    3. Rimuovere medio da 3,5 centimetri piatti a base di cardiomiociti neonatali di ratto, ottenuti nell'ultimo passaggio della Sezione 1.2, aggiungere 1 ml di soluzione lentivirali filtrata al piatto 3,5 centimetri.
    4. Aggiungere hexadimethrine bromuro (concentrazione finale 4-6 ug / ml).
      NOTA: Hexadimethrine bromuro può aumentare lentivirali efficienza di trasduzione. Concentrazione di hexadimethrine bromuro deve essere ottimizzato.
    5. Incubare piatto per 6 ore in CO 2 incubatore a 37 ˚ C per lentivirali trasduzione, poi cambiare medio nuova DMEM / MEM contenente il 5% FBS e P / S. Incubare piatto in CO 2 incubatore a 37 ˚ C per 3 giorni.
      NOTA: L'integrazione del gene esogeno nel genoma dell'ospite da lentivirus è considerato essere completato entro 72 ore.
    7. Giorno 7, usare le cellule dal punto 2.2.5 per il passo successivo. NOTA: Espressione della proteina dal plasmide lentivirale può essere confermata mediante WB o immunocitochimica (ICH) dopo 48-72 ore di trasduzione per determinare il livello di espressione relativa (Figura 1a e 1b).
  3. Concentrazione della soluzione lentivirali
    NOTA: E 'meglio usare la soluzione lentivirale fresco al fine di conseguire più elevati di efficienza di trasduzione, nel caso la soluzione lentivirale titolo non è abbastanza alta, la soluzione lentivirale può essere concentrata in polietilene glicole (PEG), la precipitazione 29.
    1. Preparazione della soluzione 4x PEG (32% PEG6000, cloruro di sodio 400 mm (NaCl), 40 mM HEPES pH7.4)
      1. Per 125 ml di soluzione 4x PEG, pesare 40 g di PEG6000, poi scioglierlo in 60 ml di acqua.
        NOTA: NOTA: (. Cioè peso molecolare medio di PEG6000 è 6.000) Il numero dopo PEG è il peso molecolare medio
        NOTA: 2.3.1.2) aggiungere lentamente 10 ml5 M NaCl. Lentamente aggiungere 5 ml di 1 M HEPES pH7.4. Regolare il pH a 7,4 con idrossido di sodio 2 M.
        NOTA: 2.3.1.3) Aggiungere acqua a 125 ml. Sterilizzare soluzione di PEG 4x con membrana di filtrazione con un filtro da 0,22 um e conservarlo a 4 ˚ C.
    2. Concentrazione lentivirus
      1. Filtro lentivirale trasduzione surnatante in una nuova provetta da 50 ml con un filtro da 0,45 um.
        NOTA: 2.3.2.2) Aggiungere la soluzione 4x PEG rapporto 1:3 (soluzione di PEG: surnatante = 1,3). Conservare a 4 ˚ C per 16-48 ore.
        NOTA: 2.3.2.3) Centrifugare a 2.600 x g a 4 ˚ C per 30 min. Scartare il surnatante e centrifugare a 2.600 x g a 4 ˚ C per 5 min.
        NOTA: 2.3.2.4) Scartare con attenzione il surnatante per non disturbare il pellet. Risospendere pellet in terreno privo di siero con 1/2 a 1/25 del volume del volume surnatante originale.
        NOTA: 2.3.2.5) Utilizzare direttamente o congelamento con azoto liquido poi conservare a -80 ˚ C

3. Trasduzione Adenoviral

NOTA: Si prega di fare riferimento ad altre fonti di metodi per la costruzione e propagazione di costrutti adenovirali 13. Pipette e / o suggerimenti aspirante Pasteur devono essere decontaminati del 10% di candeggina. Decontaminare sempre la superficie cappa di sicurezza biologica e potenzialmente contaminati apparecchiature con il 70% EtOH indipendentemente dal fatto che surnatante è stato versato. Se si è verificato fuoriuscite di decontaminazione completa con 1% SDS nel 70% EtOH è necessario.

  1. Titolazione Adenoviral del 50% della dose infettante la coltura tissutale (TCID 50)
    NOTA: Prima di trasduzione, è necessario per titolare la soluzione stock adenovirale. TCID 50 è uno dei migliori metodi per titolare la soluzione virale. Poiché il metodo restituisce un titolo da una capacità infettiva di cellule HEK 293T, calcolato TCID50 riflette infectability effettiva del adenovirus magazzino. Il PFU (formazione di placca units) è proporzionale alla TCID 50 con un fattore di circa 0,56 30.
    1. Preparare le cellule e gli strumenti: cellule HEK 293T, 10 centimetri piatti di coltura cellulare, piastra a 96 pozzetti di coltura cellulare a fondo piatto, 8-multicanale pipetta
    2. Preparare 70-90% di cellule 293T confluenti HEK in un piatto 10 centimetri.
    3. Eseguire una pre-diluizione 1/10 4 dello stock virus. Aggiungere 50 ul di DMEM + 10% FBS a ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare da 96 pozzetti a fondo piatto. Aggiungere 25 ul del virus magazzino pre-diluito in prima fila, dalla A alla H.
    4. Mescolare bene e trasferire 25 ul dalla prima fila di pozzi per la seconda fila con un multi pipetta a 8 canali. Ripetere il terzo diluizione della soluzione virale a ogni riga di pozzi fino ad includere la riga 11 e scartare lo scorso 25 ul.
    5. Triturare HEK cellule 293T in 10 ml di DMEM + 10% FBS. Aggiungere 50 ul di soluzione di cellule in ogni pozzetto dalle righe da 1 a 12.
    6. Incubare le cellule a 37 ˚ C in incubatore a CO2 per 11-13 giorni. Aggiungere 50 ul di DMEM + 10% FBS dopo 4-5 giorni e 7-8 giorni di placcatura.
    7. Misurare gli effetti citopatici in ciascun pozzetto a 11-13 giorni dopo l'infezione.
    corsia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    Fila A d d d d d d d d d
    Row B d d d d d d d d d
    Row C d d d d d d d d d
    Row D d d d d d d d
    E Row d d d d d d d d d d d
    Fila F d d d d d d d
    Fila G d d d d d d d d
    Fila H d d d d d d d d d d d
    il numero di pozzetti positivi per riga 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0
    il rapporto dei pozzetti positivi per riga 1 1 1 1 1 1 1 0.75 0.63 0.25 0.25 0
    d Visualizzazione oltre il 50% degli effetti citopatici
    Visualizzazione di sotto del 50% o nessun effetto citopatico

    Corsia 1, 3 diluizione 1 x10 4; corsia 2, 3 diluizione 2 x10 4; ...; corsia 11, diluizione 3 2 x10 11; corsia 12, il controllo.
    S = la somma dei rapporti di pozzetti positivi per fila
    = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0,75 0,63 0,25 0,25 0 = 8,875
    TCID 50 = 3 x 10 x 4 x 3 (8,875-,5) = 2,97 x 10 8
    TCID 50 / ml = 5,94 x 10 9

    Tabella 3: Esempio di una infetto ben 96 piastre dopo 10 giorni di incubazione Misurare gli effetti citopatici in ciascun pozzetto e sommare i rapporti di pozzetti positivi per riga..

    1. Calcolare il titolo secondo la formula di Kaerber 31.
    2. TCID 50 = (diluizione della prima corsia) x (diluizione) (S-0.5)
    3. S = la somma dei rapporti di pozzetti positivi per fila
      NOTA: Per questo protocollo, TCID 50 = (30000) x (3) (S-0.5). Perché il 50 ul di soluzione virale è utilizzato in questo protocollo, dividere TCID 50 da 0,05 a calcolare TCID 50 / ml.
  2. Trasduzione adenovirale
    1. Calcolo della quantità necessaria di soluzione adenovirale dal suo titolo (PFU / ml, particella virale / ml o TCID 50 / ml). Utilizzare la formula per calcolare MOI (molteplicità di infezione).
    2. em> [Inserire Tabella 4 qui]
    3. Aggiungere importo calcolato della soluzione antivirus per mezzo privo di siero (cfr. tabella 5). Mescolare bene e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
    4. em> [Inserire tabella 5 qui]
    5. Day7, Take piatto ottenuto durante l'ultima fase della Sezione 2.2, e sostituirlo media con 750 ul di nuovo DMEM / MEM contenente il 5% FBS e P / S.
      NOTA: Riduzione del volume medioa trasduzione a circa il 50% del volume iniziale è fondamentale per alta efficienza di trasduzione.
    6. Aggiungere la soluzione virus diluito piatto. Incubare piatto per 4-8 ore in CO 2 incubatore a 37 ˚ C. Poi, sostituirlo con terreno fresco.
    7. Incubare piatto per 24-48 ore in CO 2 incubatore a 37 ˚ C. Al giorno 8-9, utilizzare le cellule per l'esperimento live-cell imaging. NOTA: Espressione proteica dal plasmide adenovirale può essere confermata mediante WB o ICH dopo 24-48 ore di trasduzione per determinare il livello di espressione relativa proteina (Figura 1C e 1d).

4. Imaging cellulare dal vivo

  1. Acquisizione delle immagini utilizzando un microscopio confocale disco rotante con una camera a temperatura controllata ed un sistema ambientale CO 2 (opzionale)
    1. Ruotare il sistema di controllo della temperatura su almeno 1 ora prima dell'acquisizione, in modo che tutti i dispositivi equilibrare a 37 ˚ C prima dell'inizio di acquisizione. Accendere confocal spinning sistema di microscopia disco (PC per il funzionamento, microscopio, spinning unità disco, fotocamera CCD, laser, sorgente luminosa fluorescente, sorgente di luce normale, palcoscenico motorizzato e persiane automatiche).
      NOTA: Più di 1 ora è necessario per raggiungere la temperatura di equilibrio completo di tutti i dispositivi.
    2. Cambiare media 3,5 centimetri con fondo di vetro piatti a supporto desiderato per l'acquisizione, se necessario. Porre la capsula sul palco del microscopio confocale disco rotante in una camera a temperatura controllata.
      NOTA: A causa di aberrazione sferica per l'osservazione ottimale utilizzo microscopio di un piatto fondo di 3,5 centimetri di vetro con n ° 1,5 coperchio in vetro (circa 0,16-0,19 mm di spessore) è l'ideale. Se l'obiettivo utilizzato ha un collare di correzione, immagini ottenute con vetrini coprioggetto spessore dello 0,17 mm possono essere corretti. Inoltre, fenolo rosso ha una leggera fluorescenza. A volte è preferibile utilizzare un terreno privo di rosso fenolo, come DMEM senza rosso fenolo. Se non ci sono dispositivi per controllare CO 2 sul palco microscopio, è meglio utilizzare un CO 2 medie o medio tamponato da HEPES per il lungo termine time-lapse imaging indipendente.
    3. Selezionare il percorso ottico verso gli oculari.
    4. Ruotare l'otturatore della sorgente luminosa in campo chiaro su. Regolare il fuoco alle cellule sotto il microscopio attraverso gli oculari. Ruotare l'otturatore per il campo chiaro sorgente di luce spenta.
    5. Ruotare l'otturatore per la sorgente di luce fluorescente. Trova le cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti sotto il microscopio attraverso gli oculari. Ruotare l'otturatore per il fluorescente sorgente.
    6. Facoltativo> Premere il tasto di attivazione per il sistema di messa a fuoco perfetta davanti al microscopio per accendere il sistema di messa a fuoco perfetta al fine di mantenere costante attenzione durante l'acquisizione time-lapse.
    7. Modificare il percorso della luce al microscopio confocale disco rotante. Regolare le impostazioni per l'acquisizione in modo appropriato tramite il software operativo, controllando immagini displaYED sullo schermo. (Es. fuoco, potenza del laser, tempo di esposizione, CCD guadagno della telecamera e off-set)
    8. Impostare le impostazioni per l'acquisizione di immagini a fluorescenza utilizzando il software operativo. Esempio: selezionare "Modifica canali utilizzando percorsi di luce" e "Channel 1: EGFP" per acquisire segnale fluorescente da EGFP per un canale.
    9. Impostare la frequenza tra i punti temporali configurando le impostazioni di time-lapse, al fine di scattare immagini time-lapse utilizzando il software operativo. Esempio: Per acquisire un time-point ogni 5 minuti, selezionare "Minuti per Time-point" dal menu a discesa e immettere 5 nel campo di testo.
      NOTA: Selezionare "Velocità massima" per fare un film a velocità reale. Se l'espressione della proteina fluorescente è basso, la fluorescenza può candeggiare rapidamente durante l'acquisizione time-lapse. In tal caso, è preferibile ridurre il numero di acquisizione punti temporali.
    10. Avviare l'acquisizione time-lapse cliccando sul pulsante "statasto rt "per acquisire una sequenza di immagini.
      NOTA: E 'meglio non utilizzare la funzione di acquisizione più punti. Essa può causare la perdita di messa a fuoco o movimento del campo dell'imaging durante il time-lapse imaging.
  2. Analisi di immagini acquisite
    NOTA: Acquisite le immagini possono essere riprodotte come file di filmato e analizzati utilizzando il software di analisi.
    1. Selezionare le immagini acquisite da inserire in un film. Se necessario, le regioni di taglio di interesse da immagini e selezionare interessanti punti temporali per ridurre le dimensioni del file del filmato utilizzando il software operativo.
    2. Esportare le immagini come file video in formato AVI o MOV. Selezionare un formato filmato dal menu a discesa "Formato" e la tempistica necessaria per il film finito, quindi fare clic su "Esporta". NOTA: time-lapse immagini acquisite in una sola volta punto ogni 5 minuti possono essere riprodotti come un film a 10 fotogrammi al secondo, che è 3.000 volte più veloce rispetto alla velocità effettiva.

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Risultati

Per illustrare la tecnica, un EGFP lentivirus codifica (proteina fluorescente verde)-tag Cx43 (Connexin43) o un Cx43 mutato 32 è stato usato per esprimere le proteine ​​EGFP-tag nelle cellule, e una codifica adenovirus FGFR1DN (recettore del fattore di crescita dei fibroblasti 1 negativo dominante ) è stato utilizzato per arrestare la segnalazione FGF nella cella 33-35. Tre giorni dopo l'isolamento di cardiomiociti, i cardiomiociti isolati state trasdotte con lentivirus per esprimere proteine ​...

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Discussione

Cardiomiociti primari isolati da ratti neonati sono stati a lungo utilizzati per studiare le funzioni dei cardiomiociti in vitro. Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento di cardiomiociti neonatali di cuccioli di ratto utilizzando un metodo di digestione enzimatica in due fasi, prima digestione con tripsina O / N a 4 ° C e poi collagenasi purificata. Un vantaggio di impiegare il passo collagenasi purificata è che lo stesso grado di enzima viene utilizzato per tutte isolamenti. Pertanto, la qual...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare il Dr. Alengo Nyamay'antu e la Dr. Ilse Timmerman per i loro consigli sul confezionamento dei lentivirali. Questo lavoro è supportato da una sovvenzione per lo sviluppo degli scienziati dell'American Heart Association 10SDG4170137.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 Forbici per la decapitazioneWPI501749Autoclave prima dell'uso
1 Forbici fini per l'isolamento del cuore e il taglioWPI14393Autoclave prima dell'uso
2 Pinze fini (Dumont n. 5)Autoclave SigmaF6521prima dell'uso
3 Piatti di plastica sterilizzati da 10 cmSigmaCLS430165Per isolamento cardiaco
3,5 cm Fondo in vetro piastre di colturaMatTekP35G-1.5-20-CPer la placcatura finale dei cardiomiociti per il futuro imaging di cellule vive. Le micro-piastre di ibidi sono un'alternativa accettabile.
Piastre di coltura con fondo in vetro da 3,5 cmMatTekP35G-0,17-14-CPer TIRF o immagine ad alta risoluzione
Soluzione di etanolo, 70% (v/v) in acquaSigmaE7148
2% GelatinaSigmaG1393
1 Piatto di plastica sterilizzato da 10 cmSigmaCLS430165Per tripsinizzazione
Foglio di alluminioQualsiasi marca
ParafilmSigmaP7543
Due piastre per colture cellulari in plastica da 10 cmSigmaCLS430165Per la selezione
AutopipettaDrummond Scientific4-000-300Per la triturazione
Contatore
Cellometro, contatore cellulare automatizzatonexcelomPer controllare e contare le cellule
Microscopio ed ematocitometroQualsiasi marcaPer controllare e contare le cellule
Soluzione di tripano blu, 0,4%invitrogeno15250-061
CO2 incubatoreSanyoMCO-19AIC
Agitatore orbitale di incubazioneSigmaZ673129Per agitare il tessuto cardiaco con collagenasi a 37 gradi; C a 170-200 giri/min
10 mg/ml soluzione di BrdUBD Pharmingen550891
DMEM, invitrogeno ad alto contenuto di glucosio41965039Miscelare il terreno come indicato nel protocollo e riscaldare prima dell'uso
MEMinvitrogen31095029Miscelare il terreno come indicato nel protocollo e riscaldare prima dell'uso
Siero fetale bovinoinvitrogeno26140079
Penicillina-streptomicina (10.000 U/ml) invitrogen15140-122
Sezione 2 Trasduzione
3 Impacchettamento plasmidi
pMDLg/pRREAddgene12251
pRSV-RevAddgene12253
pMD2.GAddgene12259
Il vettore di trasferimento lentivirale, pLVX-IRES-PuroClontech632183
Opti-MEM (terreno senza siero)invitrogen31985070
Reagente
polietilenimmina" Max", (MW 40.000) - PEI lineare ad alta potenza (equivalente a Mw 25.000 in forma base libera) Polysciences24765-2Può essere sostituito con X-tremeGENE 9 di Roche
X-tremeGENE 9Roche6365779001sostituto del PEI come reagente di trasfezione
ClorochinaSigmaC6628Sciogliere in acqua e fare 100 mM di soluzione madre. L'inibizione dell'acidificazione endosomiale può essere ottenuta con 10-100 μ M Clorochina.
HEPESSigmaH3375
Siringa Luer-Lok da 10 ml, sterilizzataBD309604
0,45 μ m filtersSigmaF8677Utilizzare solo filtri in acetato di cellulosa o polietersulfone (PES) (a basso legame proteico). Non utilizzare filtri alla nitrocellulosa. La nitrocellulosa lega le proteine di superficie sull'involucro lentivirale e distrugge il virus.
Bromuro di esadimetrinaSigmaH9268Sciogliere in acqua e fare 8 mg/ml di soluzione madre, quindi filtrarla per sterilizzare.
Polietilenglicole 6.000Sigma81260
Cloruro di sodioSigmaS9888
Idrossido di sodioSigmaS5881
Sezione 3 Trasduzione
Cellule HEK 293TATCCCRL-11268
Alcune piastre per colture cellulari da 10 cmSigmaCLS430165
Micropiastra a 96 pozzetti con coperchio, fondo piatto, coltura tissutale, sterileBD Falcon353072Per titolazione
Pipetta multicanale, 10-100 &; l, 8 canalieppendorf3122 000.035
Sezione 4 Imaging
Microspopy confocale a disco rotantePerkinElmerL7267000
Una camera a temperatura controllataQualsiasi marcaPer mantenere la temperatura a 37 ° C
A Sistema ambientale CO2Qualsiasi marcaOpzionale per mantenere la concentrazione ottimale di CO<2 per mantenere la concentrazione ottimale
COsub>2 Mezzo indipendente, senza glutamminainvitrogen18045-054   Per l'imaging time-lapse a lungo termine
DMEM, glicemia alta, HEPES, senza rosso fenoloinvitrogen21063-029Per l'imaging time-lapse a lungo termine
cellularelentiviraledi trasfezioneadenoviraledi cellule vive di

Riferimenti

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