Questo protocollo descrive un metodo di imaging di cellule vive utilizzando cardiomiociti neonatali primari di ratto dopo trasduzione lentivirale e adenovirale utilizzando la microscopia confocale a disco rotante. Ciò consente osservazioni dettagliate dei processi cellulari nei cardiomiociti viventi.
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Articolo metodologico
Imaging cellulare dal vivo di primaria ratto neonato Cardiomyocytes seguito Adenoviral e lentivirali trasduzione Uso confocale Spinning Disk Microscopia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Primario cardiomiociti neonatali di ratto sono utili in base nella ricerca cardiovascolare vitro perché possono essere facilmente isolati in gran numero in una singola procedura. Grazie ai progressi nella tecnologia del microscopio è relativamente facile per catturare immagini di cellule in vivo allo scopo di indagare eventi cellulari in tempo reale con una minima preoccupazione per quanto riguarda fototossicità alle cellule. Questo protocollo descrive come prendere le immagini timelapse cellule vive di ratto primaria cardiomiociti neonatali utilizzando un microscopio confocale disco rotante che segue la trasduzione lentivirale e adenoviral di modulare le proprietà della cella. L'applicazione di due diversi tipi di virus rende più facile per raggiungere un adeguato livello dei tassi di trasduzione e di espressione di due geni diversi. Immagini di cellule vive bene focalizzate possono essere ottenuti utilizzando il sistema autofocus del microscopio, che mantiene a fuoco stabile per lunghi periodi di tempo. Applicando questo metodo, le funzioni di ingegnere esogenamenteproteine di ed espressi in cellule primarie in coltura possono essere analizzati. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per esaminare la funzione dei geni attraverso l'uso di siRNA nonché di modulatori chimici.
Introduzione
Ratto cardiomiociti neonatali primari sono stati a lungo utilizzati per indagare la funzione dei cardiomiociti in vitro 1. Sono facili da isolare da cuccioli di ratto da diversi metodi ben consolidati 2-4. Il metodo più comune impiega collagenasi o tripsina per digerire tessuto connettivo del cuore prima isolamento cellulare. I ricercatori hanno anche sviluppato metodi per isolare cardiomiociti da roditori adulti 5-8 così come topi neonati 9,10.
Questo protocollo descrive un metodo per isolare cardiomiociti da cuccioli di ratto neonatale, impiegando una procedura in due fasi digestione ....
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Protocollo
1. Isolamento di ratto cardiomiociti neonatali
- Utilizzare mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) e medio minimo essenziale (MEM) addizionato con siero fetale bovino (FBS) e penicillina / streptomicina (P / S) come mezzo di coltura. Aggiungere bromodeossiuridina (BrdU) al mezzo per prevenire la crescita di fibroblasti per i primi 2 giorni dopo l'isolamento.
| Medio Base | FBS | BrdU (mm) | P / S (U / ml) | |
| selezione | DMEM | 10% | 0 | 20 |
| Il primo giorno | DMEM |
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Risultati
Per illustrare la tecnica, un EGFP lentivirus codifica (proteina fluorescente verde)-tag Cx43 (Connexin43) o un Cx43 mutato 32 è stato usato per esprimere le proteine EGFP-tag nelle cellule, e una codifica adenovirus FGFR1DN (recettore del fattore di crescita dei fibroblasti 1 negativo dominante ) è stato utilizzato per arrestare la segnalazione FGF nella cella 33-35. Tre giorni dopo l'isolamento di cardiomiociti, i cardiomiociti isolati state trasdotte con lentivirus per esprimere proteine .......
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Discussione
Cardiomiociti primari isolati da ratti neonati sono stati a lungo utilizzati per studiare le funzioni dei cardiomiociti in vitro. Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento di cardiomiociti neonatali di cuccioli di ratto utilizzando un metodo di digestione enzimatica in due fasi, prima digestione con tripsina O / N a 4 ° C e poi collagenasi purificata. Un vantaggio di impiegare il passo collagenasi purificata è che lo stesso grado di enzima viene utilizzato per tutte isolamenti. Pertanto, la qual.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Dr. Alengo Nyamay'antu e la Dr. Ilse Timmerman per i loro consigli sul confezionamento dei lentivirali. Questo lavoro è supportato da una sovvenzione per lo sviluppo degli scienziati dell'American Heart Association 10SDG4170137.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 Forbici per la decapitazione | WPI | 501749 | Autoclave prima dell'uso |
| 1 Forbici fini per l'isolamento del cuore e il taglio | WPI | 14393 | Autoclave prima dell'uso |
| 2 Pinze fini (Dumont n. 5) | Autoclave Sigma | F6521 | prima dell'uso |
| 3 Piatti di plastica sterilizzati da 10 cm | Sigma | CLS430165 | Per isolamento cardiaco |
| 3,5 cm Fondo in vetro piastre di coltura | MatTek | P35G-1.5-20-C | Per la placcatura finale dei cardiomiociti per il futuro imaging di cellule vive. Le micro-piastre di ibidi sono un'alternativa accettabile. |
| Piastre di coltura con fondo in vetro da 3,5 cm | MatTek | P35G-0,17-14-C | Per TIRF o immagine ad alta risoluzione |
| Soluzione di etanolo, 70% (v/v) in acqua | Sigma | E7148 | |
| 2% Gelatina | Sigma | G1393 | |
| 1 Piatto di plastica sterilizzato da 10 cm | Sigma | CLS430165 | Per tripsinizzazione |
| Foglio di alluminio | Qualsiasi marca | ||
| Parafilm | Sigma | P7543 | |
| Due piastre per colture cellulari in plastica da 10 cm | Sigma | CLS430165 | Per la selezione |
| Autopipetta | Drummond Scientific | 4-000-300 | Per la triturazione |
| Contatore | |||
| Cellometro, contatore cellulare automatizzato | nexcelom | Per controllare e contare le cellule | |
| Microscopio ed ematocitometro | Qualsiasi marca | Per controllare e contare le cellule | |
| Soluzione di tripano blu, 0,4% | invitrogeno | 15250-061 | |
| CO2 incubatore | Sanyo | MCO-19AIC | |
| Agitatore orbitale di incubazione | Sigma | Z673129 | Per agitare il tessuto cardiaco con collagenasi a 37 gradi; C a 170-200 giri/min |
| 10 mg/ml soluzione di BrdU | BD Pharmingen | 550891 | |
| DMEM, invitrogeno ad alto contenuto di glucosio | 41965039 | Miscelare il terreno come indicato nel protocollo e riscaldare prima dell'uso | |
| MEM | invitrogen | 31095029 | Miscelare il terreno come indicato nel protocollo e riscaldare prima dell'uso |
| Siero fetale bovino | invitrogeno | 26140079 | |
| Penicillina-streptomicina (10.000 U/ml) | invitrogen | 15140-122 | |
| Sezione 2 Trasduzione | |||
| 3 Impacchettamento plasmidi | |||
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Il vettore di trasferimento lentivirale, pLVX-IRES-Puro | Clontech | 632183 | |
| Opti-MEM (terreno senza siero) | invitrogen | 31985070 | |
| Reagente | |||
| polietilenimmina" Max", (MW 40.000) - PEI lineare ad alta potenza (equivalente a Mw 25.000 in forma base libera) | Polysciences | 24765-2 | Può essere sostituito con X-tremeGENE 9 di Roche |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | sostituto del PEI come reagente di trasfezione |
| Clorochina | Sigma | C6628 | Sciogliere in acqua e fare 100 mM di soluzione madre. L'inibizione dell'acidificazione endosomiale può essere ottenuta con 10-100 μ M Clorochina. |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Siringa Luer-Lok da 10 ml, sterilizzata | BD | 309604 | |
| 0,45 μ m filters | Sigma | F8677 | Utilizzare solo filtri in acetato di cellulosa o polietersulfone (PES) (a basso legame proteico). Non utilizzare filtri alla nitrocellulosa. La nitrocellulosa lega le proteine di superficie sull'involucro lentivirale e distrugge il virus. |
| Bromuro di esadimetrina | Sigma | H9268 | Sciogliere in acqua e fare 8 mg/ml di soluzione madre, quindi filtrarla per sterilizzare. |
| Polietilenglicole 6.000 | Sigma | 81260 | |
| Cloruro di sodio | Sigma | S9888 | |
| Idrossido di sodio | Sigma | S5881 | |
| Sezione 3 Trasduzione | |||
| Cellule HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| Alcune piastre per colture cellulari da 10 cm | Sigma | CLS430165 | |
| Micropiastra a 96 pozzetti con coperchio, fondo piatto, coltura tissutale, sterile | BD Falcon | 353072 | Per titolazione |
| Pipetta multicanale, 10-100 &; l, 8 canali | eppendorf | 3122 000.035 | |
| Sezione 4 Imaging | |||
| Microspopy confocale a disco rotante | PerkinElmer | L7267000 | |
| Una camera a temperatura controllata | Qualsiasi marca | Per mantenere la temperatura a 37 ° C | |
| A Sistema ambientale CO2 | Qualsiasi marca | Opzionale per mantenere la concentrazione ottimale di CO<2 per mantenere la concentrazione ottimale | |
| COsub>2 Mezzo indipendente, senza glutammina | invitrogen | 18045-054 | Per l'imaging time-lapse a lungo termine |
| DMEM, glicemia alta, HEPES, senza rosso fenolo | invitrogen | 21063-029 | Per l'imaging time-lapse a lungo termine |
Riferimenti
- Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
- Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E.
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Ristampe e permessi
