Un metodo rapido isolamento dei mitocondri da biopsie di tessuto mammiferi è descritto. Fegato di ratto o preparazioni muscolari scheletriche sono stati omogeneizzati con un dissociatore tessuto commerciale e mitocondri sono stati isolati per filtrazione differenziale attraverso filtri a rete di nylon. Tempo di isolamento mitocondriale è <30 min rispetto ai 60 - 100 min con metodi alternativi.
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Articolo metodologico
Isolamento rapida e purificazione di mitocondri per il trapianto da tessuto Dissociazione e Filtrazione Differenziale
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Metodi di isolamento mitocondriali precedentemente descritti utilizzando centrifugazione differenziale e / o Ficoll gradiente di centrifugazione richiedono da 60 a 100 minuti per completare. Noi descriviamo un metodo per il rapido isolamento di mitocondri da biopsie di mammifero usando un dissociatore tessuto commerciale e filtrazione differenziale. In questo protocollo, omogeneizzazione manuale viene sostituito con il ciclo omogeneizzazione standardizzata del dissociatore tessuti. Questo permette uniforme e costante omogeneizzazione del tessuto che non è facilmente ottenibile con omogeneizzazione manuale. A seguito di dissociazione dei tessuti, l'omogeneizzato è filtrata attraverso filtri a rete di nylon, che eliminano le fasi di centrifugazione ripetitivi. Come risultato, l'isolamento mitocondriale può essere eseguito in meno di 30 min. Questo protocollo isolamento produce circa 2 x 10 10 mitocondri competenti vitali e la respirazione da 0,18 ± 0,04 g di campione di tessuto (peso a umido).
Introduzione
Esistono mitocondri in ogni cellula del corpo ad eccezione dei globuli rossi e sono coinvolti in un gran numero di importanti processi cellulari e metabolici 1-4. A causa di queste numerose funzioni, danno mitocondriale può avere effetti negativi 3. Al fine di indagare la funzione mitocondriale e disfunzione diversi metodi di isolamento mitocondriali sono state descritte. I primi resoconti pubblicati su mitocondriale data isolamento al 1940 5-8. Il primo tentativo documentato dimostrato isolamento mitocondriale dalla macinazione di tessuto epatico in un mortaio seguita da centrifugazione in una soluzione salina a bassa velocità 5....
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Protocollo
Preparazione
- Preparare 1 M K-HEPES Stock Solution (aggiustare il pH a 7,2 con KOH).
- Preparare 0,5 M K-EGTA Stock Solution (aggiustare il pH a 8,0 con KOH).
- Preparare 1 M KH 2 PO 4 Stock Solution.
- Preparare 1 M MgCl 2 Stock Solution.
- Preparare omogeneizzazione Buffer (pH 7,2) saccarosio 300 mM, 10 mM K-HEPES, e 1 mM K-EGTA. Conservare a 4 ° C.
- Preparare saccarosio respirazione Buffer 250 mm, 2 mm KH 2 PO 4, 10 mM MgCl 2, 20 mM K-HEPES Buffer (pH 7,2) e 0,5 mM K-EGTA (pH 8,0). Conservare a 4 ° C.
- Preparare 10x PBS Archivio soluzione s....
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Risultati
Una figura che illustra le fasi procedurali nel isolamento dei mitocondri mediante dissociazione dei tessuti e la filtrazione differenziale è mostrato in Figura 1. Tempo procedurale totale è inferiore a 30 min.
I campioni di tessuto sono stati ottenuti utilizzando una biopsia 6 mm. Peso del tessuto era 0,18 ± 0,04 g (peso umido). Il numero dei mitocondri isolati come determinato mediante conteggio granulometria era 2,4 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mitocondri d.......
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Discussione
Per isolare con successo mitocondri utilizzano questo protocollo è essenziale per mantenere tutte le soluzioni e campioni di tessuto sul ghiaccio per conservare la vitalità mitocondriale. Anche quando mantenuto sul ghiaccio, mitocondri isolati esporranno una diminuzione dell'attività funzionale nel tempo 19. Si raccomanda che tutte le soluzioni e le integrazioni essere pre-preparati. Abbiamo pre-pesare e immagazzinare Subtilisina A in 4 aliquote mg in 1,5 ml provette per microcentrifuga e conservare a -20.......
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Dichiarazioni
Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida istituzionali attuali. Noi non abbiamo concorrenti interessi finanziari da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dal National Heart, Lung, and Blood Institute di Grant HL 103542, e Distinguished Trailblazer Award Il BCH Anesthesia Research Foundation di PAC.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Saccarosio | Sigma Aldrich | 84100 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Sostituzione A | Sigma Aldrich | P5380 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5379 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
| KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| ATPlite Luminescence Assay System, Kit di test 1.000 | Perkin Elmer | ||
| Tubi conici da 50 ml | BD | 352098 | |
| ; m Filtri in nylon | BD | 352340 | |
| GentleMACS C provetta | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
| 1,5 ml provetta Eppendorf | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 mm punzone per biopsia | Miltex | 33-36 | |
| 10 μ m Pluristrainer | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415C | Marshall Scientific | EP-5415C | |
| Dissociatore GentleMACS | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
| piastre a 96 pozzetti, trattate con coltura tissutale | VWR | 82050-732 | |
| Agitatore orbitale Rotomax 120 | Heidolph | 544-41200-00 | |
| Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Lettore di micropiastre | BioTek | ||
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | |
| Oxytherm System | Hansatech Instruments Ematocitometro | ||
| Fisher | Scientific 267110 |
Riferimenti
- van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R.
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 1/05/2016. Citeable Link.
A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:
1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.
