Microdissezione è stato ampiamente impiegato per l'esame di DNA, RNA e proteine nel tessuto. Microscopia laser capture (LCM) è il metodo più comunemente usato, ma una nuova tecnica di fresatura, mesodissection, è da poco disponibile. Dimostriamo estrazione di RNA da mesodissected in formalina paraffina fissati diapositive tessuti integrati di Mycobacterium tuberculosis granulomi.
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Articolo metodologico
Un nuovo approccio Microdissezione per recuperare
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Microdissezione è stato utilizzato per l'esame dei tessuti a DNA, RNA e proteina livelli per oltre un decennio. Microscopia laser capture (LCM) è la tecnica di microdissezione più comune usato oggi. In questa tecnica, un laser viene utilizzato per fondere focally una membrana termoplastica che sovrasta una sezione di tessuto disidratato 1. La sezione di tessuto composito viene poi sollevato e separato dalla membrana. Sebbene questa tecnica può essere utilizzata con successo per l'esame dei tessuti, è lunga e costosa. Inoltre, il completamento delle procedure utilizzando questa tecnica richiede l'uso di un laser, limitando così il suo utilizzo. Un nuovo approccio microdissezione più conveniente e pratico chiamato mesodissection è una possibile soluzione per le insidie di LCM. Questa tecnica impiega il sistema MESO-1/MeSectr al mulino tessuto desiderato da un campione di tessuto scorrevole montato mentre contemporaneamente dispensando ed aspirando fluido per recuperare il campione di tessuto desiderato nellaun po 'mulino di consumo. Prima che inizi il processo di dissezione, l'utente allinea formalina paraffina fisso incorporato (FFPE) scorrere con un ematossilina e eosina macchiato (H & E) di riferimento diapositiva. Successivamente, l'operatore annota la zona dissezione desiderato e procede a sezionare il segmento appropriato. Il programma genera un'immagine archiviata della dissezione. Il vantaggio principale di mesodissection è la breve durata necessaria per sezionare una diapositiva, stabilendo una media di dieci minuti dal impostato per campionare generazione in questo esperimento. Inoltre, il sistema è molto più conveniente e facile da usare. Un leggero svantaggio è che non è preciso come microscopia laser capture. In questo articolo mostriamo come mesodissection può essere utilizzato per estrarre RNA da diapositive da granulomi FFPE causate da Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Introduzione
I campioni sono stati tradizionalmente microdissezione manualmente sia da tutto il tessuto o diapositive utilizzando un ago e bisturi. Ciò richiede una netta separazione tra la sezione di tessuto di interesse e dei tessuti circostanti le sezioni 2. Con i progressi attuali nella tecnologia profiling molecolare, vi è stata una crescente necessità di valutare il tessuto a livello cellulare. A causa delle limitazioni di microdissezione manuale, sono stati stabiliti tecniche tra cui LCM per consentire una maggiore precisione di isolamento. Questa tecnica consente al ricercatore di isolare specifiche popolazioni cellulari da vari tipi di cellule e diapositive, c....
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Protocollo
1. Calibrate strumento Mesodissection con 2id software di imaging
Il software di imaging 2id verrà indicato come sia il software o il programma per il resto di questo articolo. Questo passo è necessario per monitorare correttamente l'immagine così come allineare più diapositiva frame.
- Accendere strumento e computer.
- Il software Open e selezionare "strumento di calibrazione".
- Calibrare viaggio stage utilizzando il joystick. Spostare palco per la posizione in alto a sinistra. Premere il tasto "set" in fase 1 in programma.
- Spostare fase di abbassare giusta posizione. Premere il tasto "set" sotto i....
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Risultati
Il protocollo di cui sopra mostra come utilizzare una nuova tecnica mesodissection per estrarre l'RNA da diapositive tessuto FFPE. L'efficacia di questo protocollo è mostrato tramite diapositive FFPE di granulomi polmonari da NHP infettati con Mtb in vari stadi infettivi. Figure 1-3 sono immagini dello strumento. Figura 4 mostra come avviene il processo di dissezione e l'immagine risultante generato dal software. Tabella 1 mostra i risultati di estr.......
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Discussione
Mesodissection è una tecnica che può essere applicata per l'estrazione di RNA da diapositive lesioni patologiche causate da una vasta gamma di agenti patogeni. È una necessità che l'utente ascolti l'immagine e allinea correttamente l'immagine. Per fare questo, lo strumento deve essere calibrato seguendo le indicazioni sul software di imaging. Quando dissezione, se la slitta e la zona di interesse essere sezionato non si allineano, l'utente deve ricalibrare lo strumento. Un altro punto critico nel pro.......
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Dichiarazioni
Gli autori rivelano che non ci sono interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero riconoscere i seguenti premi NIH / subawards per il sostegno di questa ricerca: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, e P51OD011104.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Altre misure disponibili | |
| THOR | AvanSci Bio | Riscaldatore-Agitatore Programmabile | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy Kit di estrazione FFPE | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq | PCR Nugen | 7150 | |
| QIAquick | Qiagen | 28104 |
Riferimenti
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer spe....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 7/01/2014. Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
