Microdissezione è stato ampiamente impiegato per l'esame di DNA, RNA e proteine nel tessuto. Microscopia laser capture (LCM) è il metodo più comunemente usato, ma una nuova tecnica di fresatura, mesodissection, è da poco disponibile. Dimostriamo estrazione di RNA da mesodissected in formalina paraffina fissati diapositive tessuti integrati di Mycobacterium tuberculosis granulomi.
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Articolo metodologico
Un nuovo approccio Microdissezione per recuperare
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Microdissezione è stato utilizzato per l'esame dei tessuti a DNA, RNA e proteina livelli per oltre un decennio. Microscopia laser capture (LCM) è la tecnica di microdissezione più comune usato oggi. In questa tecnica, un laser viene utilizzato per fondere focally una membrana termoplastica che sovrasta una sezione di tessuto disidratato 1. La sezione di tessuto composito viene poi sollevato e separato dalla membrana. Sebbene questa tecnica può essere utilizzata con successo per l'esame dei tessuti, è lunga e costosa. Inoltre, il completamento delle procedure utilizzando questa tecnica richiede l'uso di un laser, limitando così il suo utilizzo. Un nuovo approccio microdissezione più conveniente e pratico chiamato mesodissection è una possibile soluzione per le insidie di LCM. Questa tecnica impiega il sistema MESO-1/MeSectr al mulino tessuto desiderato da un campione di tessuto scorrevole montato mentre contemporaneamente dispensando ed aspirando fluido per recuperare il campione di tessuto desiderato nellaun po 'mulino di consumo. Prima che inizi il processo di dissezione, l'utente allinea formalina paraffina fisso incorporato (FFPE) scorrere con un ematossilina e eosina macchiato (H & E) di riferimento diapositiva. Successivamente, l'operatore annota la zona dissezione desiderato e procede a sezionare il segmento appropriato. Il programma genera un'immagine archiviata della dissezione. Il vantaggio principale di mesodissection è la breve durata necessaria per sezionare una diapositiva, stabilendo una media di dieci minuti dal impostato per campionare generazione in questo esperimento. Inoltre, il sistema è molto più conveniente e facile da usare. Un leggero svantaggio è che non è preciso come microscopia laser capture. In questo articolo mostriamo come mesodissection può essere utilizzato per estrarre RNA da diapositive da granulomi FFPE causate da Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Introduzione
I campioni sono stati tradizionalmente microdissezione manualmente sia da tutto il tessuto o diapositive utilizzando un ago e bisturi. Ciò richiede una netta separazione tra la sezione di tessuto di interesse e dei tessuti circostanti le sezioni 2. Con i progressi attuali nella tecnologia profiling molecolare, vi è stata una crescente necessità di valutare il tessuto a livello cellulare. A causa delle limitazioni di microdissezione manuale, sono stati stabiliti tecniche tra cui LCM per consentire una maggiore precisione di isolamento. Questa tecnica consente al ricercatore di isolare specifiche popolazioni cellulari da vari tipi di cellule e diapositive, che possono poi essere utilizzati per saggi valle come espressione genica. Sebbene molto efficace per saggi a valle, LCM non è senza limitazioni. Primo, LCM è un processo costoso e richiede tempo. Inoltre, a causa della natura instabile di RNA, è spesso difficile da ottenere RNA di alta qualità da campioni LCM 2. A causa della disadvantages di LCM, nuovi progressi nella tecnologia microdissezione sono ancora necessari per renderlo più accessibile a un maggior numero di ricercatori in maniera sensibile conveniente e tempo.
Un tale progresso della tecnologia microdissezione ora disponibile è una tecnica nota come mesodissection. In questa tecnica una macchina viene utilizzata per la lavorazione della sezione di tessuto annotato di interesse e aspirati in un po mulino consumabile 3. Quindi, questo esempio può essere aspirato in un tubo di raccolta e utilizzata per applicazioni a valle. I vantaggi di questo sistema sono che è molto meno costoso e delicato momento. Nella nostra esperienza, il sistema consente la dissezione di una sezione di tessuto polmonare granuloma in dieci minuti. D'altra parte, LCM tradizionale sarebbe probabilmente richiederà ore per completare il processo. Il sistema permette all'operatore di caricare una diapositiva di riferimento da utilizzare come confronto così come strumento per l'annotazione. Inoltre, viene generato un report che illustra the area del vetrino che è stato sezionato. Ci sono due svantaggi principali mesodissection. Sebbene efficace a estrarre più celle, è impegnativo per isolare una singola cella. Inoltre, la precisione dell'immagine generata non è chiaro come se si utilizzano altri microscopi di imaging.
La tubercolosi (TB) è una importante malattia mortale contagiosa dell'umanità in tutto il mondo e risultati da infezione da Mtb. In una maggioranza di individui esposti ad aerosol di Mtb, l'infezione è latente limitato. In almeno 10 milioni di persone ogni anno, si traduce in malattia tubercolare attiva 4. Durante l'infezione latente, Mtb è contenuto all'interno lesioni polmonari patologiche conosciuti come granulomi. Quindi si è sostenuto che l'esito dell'infezione Mtb viene deciso a livello del granuloma 5.
Qui mostriamo come mesodissection può essere utilizzato per microdissect granulomi causati da Mtb. Le slide utilizzatesono da FFPE tessuto polmonare di macachi Rhesus infetti. Ai fini di questa dimostrazione, saremo sezionare granulomi nella loro interezza. Abbiamo inoltre dimostrato che l'RNA può essere estratto dal tessuto recuperato. Questa tecnica può essere applicata a campioni di tessuto da vari altri campioni e poi utilizzato per una varietà di saggi a valle.
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Protocollo
1. Calibrate strumento Mesodissection con 2id software di imaging
Il software di imaging 2id verrà indicato come sia il software o il programma per il resto di questo articolo. Questo passo è necessario per monitorare correttamente l'immagine così come allineare più diapositiva frame.
- Accendere strumento e computer.
- Il software Open e selezionare "strumento di calibrazione".
- Calibrare viaggio stage utilizzando il joystick. Spostare palco per la posizione in alto a sinistra. Premere il tasto "set" in fase 1 in programma.
- Spostare fase di abbassare giusta posizione. Premere il tasto "set" sotto il punto 2 in programma.
- Calibrare aspirazione premendo prima "Z-button" per sollevare assemblea testa. Premere il tasto "pulse aspirare" e il pulsante "dissezione" sul joystick finché asta di comando del pistone raggiunge prima posizione. Premere il tasto "set" sotto il punto 3 del programma.
- Premere il tasto "Reset aspirato &# 8221; pulsante. Una volta che il pistone si ferma alla posizione di premere il tasto "set" in basso al punto 4.
- Fare clic sulla scheda "scala".
- Mettere righello calibrazione lato bianco.
- Concentrarsi microscopio, se necessario.
- Disegnare una linea tra le due barre di scala utilizzando il mouse.
- Immettere la distanza in scatola pulsante punto 2. Premere il tasto "Calcola" etichettati.
- Fare clic sulla linguetta "mirino". Girare la velocità del motore a 1.
- Inserire xScisor nel gruppo della testa. Assemblaggio testata inferiore in asse z posizione pronta premendo il tasto "z". NOTA: Il gruppo di testa è la grande struttura sulla sommità dello strumento di dissezione. Il xScisor verrà indicato come un po mulino di consumo per il resto di questo articolo.
- Fare clic su "dissezione impegnarsi" sul joystick. NOTA: Questo pulsante si trova sulla parte superiore del joystick.
- Definire centro di rotazione visivamente. Per fare questo, spostare il centro di mirino sul centro di rotazione usando definireparametro d al punto 1 del programma. Utilizzare il su e giù nella "x" e "y bar-asse" per regolare i pixel per allineare mirino. Fare clic sulla scheda "done".
- Fare clic sull'icona "casa". NOTA: Questo è rappresentato da un'immagine casa situata in alto a destra.
2. Creare Immagine di riferimento
- Posizionare H & E vetrino sul palco. Mettere copertura opaca sulla parte superiore della diapositiva. Guidare lo strumento muovendo il joystick per l'area desiderata della diapositiva H & E. Salvare l'immagine generata. NOTA: Sia la scheda "cattura di riferimento" o scheda "sezionare" possono essere utilizzati per completare questo passaggio.
3. Allineare tessuto per dissezione
- Fare clic sull'opzione "sezionare il tessuto" sullo schermo di casa.
- Compilare l '"operatore", "numero dissezione di adesione", "numero di accesso di riferimento", "xScisor codice a barre", & #8220; dissezione numero di lotto fluido "," dimensione xScisor "e" descrizione "nella scheda" setup ".
- Fare clic sulla scheda "trovare tessuti".
- Importazione di immagini di riferimento precedentemente salvata.
- Inserire un FFPE scivolo senza macchia di 5 micron di spessore sul palco. Spostare palco per la stessa area come quello raffigurato nell'immagine di riferimento. Clicca sulla scheda "Inserisci immagine".
- Fare clic sulla linguetta "align". Utilizzare il mouse e le frecce associati per allineare l'immagine di riferimento all'immagine senza macchia.
4. Annota diapositiva
- Fare clic sulla scheda "annotate".
- Usate il mouse per disegnare un cerchio attorno all'area desiderata della diapositiva che sarà in paraffina.
5. Caricare consumabili Mill Bit
- Riempire consumabile bit mulino con tampone desiderato, qui tampone PKD, tirando lo stantuffo su e giù in un movimento fluido più volte. Assicurati di escludere l'ariabolle.
- Sollevare asse Z premendo il tasto "Z".
- Caricare consumo bit mulino in macchina. Fate questo facendo scorrere la punta mulino consumabile nella parte superiore della macchina in modo che la linea bianca sulle linee strumento con la linea nera sul bit mulino consumabile. Premere il tasto "Reset aspirazione" per consentire stantuffo per essere abbassata nella posizione corretta. NOTA: Dovrebbe essere facile scivolare la punta mulino di consumo. Se non lo è, assicurarsi che le tacche siano allineate correttamente.
- Bassa asse Z premendo nuovamente il tasto "Z".
6. Dissect Tissue (Figura 4)
- Apri scheda "sezionare".
- Girare velocità del motore e aspirazione a 1.
- Casella "spettacolo di monitoraggio". Nota: Questo consente all'utente di visualizzare l'area sezionato durante il processo di dissezione.
- Una volta pronti a sezionare, continuare a tenere premuto il tasto "impegnarsi", così come "aspirato & #8221; pulsante mentre si muove joystick in senso antiorario per sezionare il tessuto.
- Continua a sezionare in senso antiorario finché l'aspirato è scheda "pieno" diventa rossa.
7. Svuotare e rimuovere consumabili Mill Bit
- Mettere una provetta per microcentrifuga 0,5 ml sotto la punta della punta mulino di consumo.
- Pressetta controllo "aspirazione" rapidamente per espellere campione in provetta per microcentrifuga.
- Premere con maggiore forza per espellere usati consumo bit mulino.
- Risciacquare frammento di tessuto tirando indietro lo stantuffo. Spingere lo stantuffo in avanti per esprimere campione rimanente in consumo bit mulino. Il frammento di tessuto sarà ora contenuto all'interno della provetta per microcentrifuga.
8. Lyse campione con proteinasi K digestione da un trattamento termico
- Aggiungere 70 microlitri TE pH 8,5 contenente 5 mg di proteinasi K per recuperare campione di tessuto.
- Collocare il campione in programmabile riscaldamento-shaker.
- Digestione completa utilizzando programmabile riscaldamento-shaker al seguente impostazione: 60 ˚ C per 30 min a 1.500 giri; 82 ˚ C per 15 min a 1.500 giri; e 25 ˚ C per 1 min a 450 rpm. Il campione è ora pronto per applicazioni a valle.
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Risultati
Il protocollo di cui sopra mostra come utilizzare una nuova tecnica mesodissection per estrarre l'RNA da diapositive tessuto FFPE. L'efficacia di questo protocollo è mostrato tramite diapositive FFPE di granulomi polmonari da NHP infettati con Mtb in vari stadi infettivi. Figure 1-3 sono immagini dello strumento. Figura 4 mostra come avviene il processo di dissezione e l'immagine risultante generato dal software. Tabella 1 mostra i risultati di estr...
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Discussione
Mesodissection è una tecnica che può essere applicata per l'estrazione di RNA da diapositive lesioni patologiche causate da una vasta gamma di agenti patogeni. È una necessità che l'utente ascolti l'immagine e allinea correttamente l'immagine. Per fare questo, lo strumento deve essere calibrato seguendo le indicazioni sul software di imaging. Quando dissezione, se la slitta e la zona di interesse essere sezionato non si allineano, l'utente deve ricalibrare lo strumento. Un altro punto critico nel pro...
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Dichiarazioni
Gli autori rivelano che non ci sono interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero riconoscere i seguenti premi NIH / subawards per il sostegno di questa ricerca: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, e P51OD011104.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Altre misure disponibili | |
| THOR | AvanSci Bio | Riscaldatore-Agitatore Programmabile | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy Kit di estrazione FFPE | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq | PCR Nugen | 7150 | |
| QIAquick | Qiagen | 28104 |
Riferimenti
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 7/01/2014. Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
