Articolo metodologico

Fondamentale elementi tecnici di Freeze-frattura / Fermo-etch in Biological microscopia elettronica

DOI:

10.3791/51694

⸱

11 settembre 2014

1Department of Pediatrics, Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill

In questo articolo

Sommario

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Sono descritte le tecniche di base e parametri di lavorazione congelamento-frattura di campioni biologici e dei nanomateriali per l'esame di microscopia elettronica a trasmissione. Questa tecnica è un metodo preferito per rivelare caratteristiche ultrastrutturali e specializzazioni delle membrane biologiche e per l'ottenimento di dati dimensionali e spaziali di livello ultrastrutturale in scienze dei materiali e dei prodotti nanotecnologici.

Abstract

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Freeze-frattura / freeze-etch descrive un processo in cui i campioni, in genere biologici o nanomateriali in natura, sono congelati, fratturato, e replicato per generare un carbonio / platino "cast" destinato ad esame mediante microscopia elettronica a trasmissione. I campioni vengono sottoposti a tassi di congelamento ultrarapido, spesso in presenza di agenti crioprotettivi di limitare la formazione di cristalli di ghiaccio, con conseguente frattura del campione in azoto liquido raffreddato a temperature sotto alto vuoto. La superficie fratturata risultante viene replicato e stabilizzato mediante evaporazione di carbonio e platino da un angolo che conferisce dettaglio superficie tridimensionale al cast. Questa tecnica si è rivelata particolarmente illuminante per lo studio delle membrane cellulari e delle loro specializzazioni ed ha contribuito notevolmente alla comprensione della forma cellulare per la funzione delle cellule correlate. In questo rapporto, passiamo in rassegna i requisiti dello strumento e protocollo tecnico per l'esecuzione dicongelamento-frattura, la nomenclatura e le caratteristiche dei piani di frattura associata, variazioni sul procedimento tradizionale, e criteri per l'interpretazione delle immagini freeze-frattura. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata per le indagini ultrastrutturali in molti settori della biologia cellulare e detiene promessa come una tecnica di imaging emergente per molecolare, le nanotecnologie, e studi di scienza dei materiali.

Introduzione

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Il concetto e l'applicazione pratica del trattamento di congelamento-frattura di campioni biologici è stato introdotto da Steere 1 più di mezzo secolo fa. L'apparato presto stanziati componenti disparati in un self-contained unità di lavoro 1. Apparecchiatura originale è stato modificato e raffinato in strumenti disponibili in commercio per ospitare la necessità critica per la manipolazione a distanza, manutenzione di alto vuoto, e l'evaporazione di carbonio e metalli per produrre una replica adatto per l'esame al microscopio elettronico a trasmissione (Figura 1 e Figura 2).

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Protocollo

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1 Preparazione di campioni biologici per congelamento-frattura / Fermo-etch

  1. Utilizzare un convenzionale EM formulazione fissazione quale il 2% glutaraldeide + 2% paraformaldeide in tampone fosfato 0,1 M per 1 ora. effettuare fissazione primaria di tessuti biologici. NOTA: Mentre può essere opportuno congelare alcuni tipi di campioni senza fissazione preventiva, ematica precauzioni universali patogeni impongono la fissazione del caso in cui il campione è costituito da tessuto umano.
  2. A seguito di fissazione primaria, sciacquare il campione nello stesso tampone integrato con 0,2 M di saccarosio per non più di 1 ora.
  3. Trasferire il campione ....

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Risultati

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La premessa fondamentale di congelamento-frattura immagine interpretazione è che i piani di frattura passano attraverso il doppio strato lipidico delle membrane che conferiscono due facce di frattura, chiamato per convenzione il PF-faccia (plasma frattura-face) e EF-faccia (extracellulare frattura-face) (Figura 3). Il PF-viso è la metà della membrana lipidica a due strati adiacenti al citoplasma della cellula e EF-viso è la metà della membrana lipidica a due strati adiacenti al mezzo extracellulare. La .......

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Discussione

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Negli anni successivi alla sua introduzione e la disponibilità commerciale, congelamento-frattura / procedure etch sono stati ampiamente utilizzati per le indagini di struttura della membrana biologica. Infatti, le migliori prospettive di alcune delle specializzazioni strutturali delle membrane sono state ottenute in preparati congelamento-frattura / etch. Questi studi non solo hanno contribuito alla comprensione della organizzazione strutturale delle membrane, ma anche fornito intuizioni su come la struttura e la funzi.......

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Dichiarazioni

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L'autore non ha nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questa presentazione è stata supportata da un Clinical Innovator Award a JLC dal Flight Attendant Medical Research Institute e dall'Agenzia per la Protezione dell'Ambiente degli Stati Uniti. Sebbene la ricerca descritta in questo articolo sia stata finanziata in tutto o in parte dall'Agenzia per la protezione dell'ambiente degli Stati Uniti attraverso un accordo di cooperazione CR83346301 con il Center for Environmental Medicine, Asthma and Lung Biology presso l'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill, non è stata sottoposta alla revisione paritaria e politica richiesta dall'Agenzia. e pertanto non riflette necessariamente le opinioni dell'Agenzia e non si ....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Impianto di congelamento/congelamento/mordenzatura BalzerBAF400T
Tamponi standard fornitorivari Fissativi
aldeidici standardfornitori
Fornitori vari Bicromato di sodioFornitori
Acido solforicofornitori
Forniture monouso per Evaporazione Platino/CarbonioTechnotrade International
Azoto liquidofornitori vari
Propanofornitori vari
Forniture monouso per microscopia elettronicaMicroscopia elettronica Scienze
Microscopio elettronico a trasmissioneCarl Zeiss Inc.
varivarivari

Riferimenti

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  1. Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).
  2. Pinto da Silva, P., Branton, D. Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane mar....

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Ristampe e permessi

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Preparazione dei campionicongelamento ultra rapidoazoto liquidoreplicazione con platino su carboniomicroscopia elettronica a trasmissionemembrane cellulariarray molecolari

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