Espressione ricombinante Cellulase Cel5A da Trichoderma reesei In piante di tabacco

Sommario

Piante di tabacco sono stati usati per produrre una cellulasi fungine, TrCel5A, tramite un sistema di espressione transiente. L'espressione potrebbe essere monitorato utilizzando una proteina di fusione fluorescente, e l'attività della proteina è stata caratterizzata post-espressione.

Abstract

Enzimi degradanti Cellulosa, cellulasi, sono obiettivi sia di ricerca e di interessi industriali. La preponderanza di questi enzimi in-a-cultura difficili organismi, come funghi ife costruzione e batteri anaerobici, ha accelerato l'uso di tecnologie ricombinanti in questo campo. Metodi di espressione pianta sono un sistema desiderabile per la produzione su larga scala di enzimi e altre proteine ​​industrialmente utili. Qui, sono dimostrati metodi per l'espressione transitoria di un endoglucanasi fungina, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum. Espressione della proteina successo è mostrato, monitorato mediante fluorescenza utilizzando una proteina di fusione mCherry-enzima. Inoltre, una serie di test di base sono utilizzati per esaminare l'attività di transitoriamente espresso T. reesei Cel5A, compresi SDS-PAGE, Western blotting, zimografia, nonché fluorescenza e substrato saggi degradazione dye. Il sistema qui descritto può essere usato per produrre una cella attivaulase in un breve periodo di tempo, in modo da valutare il potenziale di ulteriore produzione in impianti attraverso sistemi di espressione costitutiva o inducibile.

Introduzione

La degradazione della biomassa lignocellulosica e la sua conversione in combustibile liquido è stato immaginato come un metodo per ridurre la dipendenza dai combustibili fossili. Un ostacolo importante nella realizzazione di sistemi di elaborazione biomassa economicamente realizzabili è nella degradazione enzimatica della cellulosa ed emicellulosa ^1. Sistemi di espressione vegetali mostrano un grande potenziale per la produzione di enzimi su scala industriale. Sistemi agricoli ad impianti di raccolta economicamente e di volume sono già stabiliti, come lo sono stati per migliaia di anni. La produzione di cellulasi in piante è desiderabile a causa di fattori come la facilità di autohydrolysis ^2, e la possibilità di massimizzare l'uso degli enzimi inferiori aumentando la digeribilità delle pareti cellulari vegetali ^1. Infine, sistemi vegetali consentono il targeting di proteine ​​ricombinanti ad aree specifiche di cellule vegetali e sono in grado di modificare posttranslationally enzimi ove richiesto ^3.

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Nicotiana tabacum (tabacco) è molto comunemente usato come organismo modello per studi di espressione di proteine ​​eterologhe in piante, a causa della sua crescita e biomassa rapidi caratteristiche di accumulo ^4. Espressione transiente di proteine ​​ricombinanti è una tecnica che permette la produzione di proteine ​​in brevi periodi di tempo ^5, pur mantenendo la flessibilità nella localizzazione e quindi modificazioni post-traduzionali delle proteine ​​selezionate, cioè cellulasi. Ciò consente la produzione di cellulasi (s) per analisi di base, ponendo contemporaneamente le basi per ulteriori strategie di espressione in piante. Utilizzando tale strategia espressione transitoria, un'endoglucanasi da glicosil idrolasi famiglia 5, Cel5A, derivato dal ospitante fungina Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) ⁶ è prodotta (di seguito denominato TrCel5A). TrCel5A è una proteina di kDa 42 che è nativo glicosilata ed è molto attivo in HYDroylzing catene di cellulosa ^7.

La tecnica espressione transiente qui descritto è basato su un sistema relativamente comunemente usato, infiltrando la pianta lascia con Agrobacteria porta il gene di interesse in un vettore di espressione appropriato. Per consentire una rapida analisi di successo nell'espressione planta, TrCel5A può anche essere espresso come proteina di fusione con mCherry, una proteina fluorescente monomerica originariamente derivato da Discosoma sp. Proteine ​​DsRed ^8, con l'aggiunta di sei residui di istidina (His-tag) fusi a il C-terminale (TrCel5A-mCherry). L'espressione della proteina di fusione eterologa, TrCel5A-mCherry, può quindi essere monitorato all'interno della pianta che cresce utilizzando luce verde per esaminare mCherry dispersione. Se lo si desidera, sezioni sottili di materiale vegetale può essere esaminato sotto luce verde al microscopio per stabilire la localizzazione specifica della proteina. Per questo lavoro, segnale e transit peptidi sono stati incorporati nel costrutto, di localizzare la proteina eterologa esportazione verso il reticolo endoplasmatico ^9.

Per analizzare l'attività di cellulasi vegetali espresse, compreso TrCel5A, una serie di prove di attività cellulasi può essere eseguito. Dopo l'estrazione del totale delle proteine ​​vegetali solubili, TrCel5A può essere parzialmente purificato utilizzando una tecnica di incubazione termica. Dimensione proteina viene stabilita tramite SDS-PAGE seguita da Western blotting. Zimografia può essere utilizzato per analizzare l'attività contro substrati, ad esempio cellulosa che è stato carbossi-metilato (rendendo carbossimetil cellulosa: CMC) per solubilità ^10. Attività cellulasi e glucosidasi può essere monitorato utilizzando il fluoroforo 4-metilumbelliferil (4-MU) associata a β-D-cellobioside (combinato: 4-MUC). Un altro metodo per valutare l'attività di endoglucanasi prevede l'analisi spettrometrica di CMC che è stata associata con un azo-dye (Remazolbrilliant Blu R) ^11. Inoltre, l'attività della proteina di entrambi endoglucanasi e una gamma di cellulasi può essere monitorato mediante l'uso di un test di analisi zucchero, come l'idrazide p-idrossi benzoico (PAHBAH) saggio ^12. Queste tecniche possono essere utilizzate per chiarire e quantificare l'attività della cellulasi espressa di interesse.

Protocollo

1. Crescita di Wild Type N. tabacum Piante

1. Per crescere N. tabacum L. cv. Piante Petit Havana SR1 sul suolo, luogo semi del tabacco su pentole adeguate riempiti con normale terriccio per la germinazione. Dopo 2 settimane, il trasferimento piantine ai singoli vasi. Incubare le piante in una serra con costante di 22 ° C (periodo buio) o 25 ° C (periodo di luce) e 70% di umidità relativa dell'aria. Fornire illuminazione in un 16/8 ore di luce / buio ciclo (ad esempio Philips IP65 400 lampade W; 180 micromol · sec ^-1 · m ^-2; λ = 400-700 nm) e di acqua al giorno.

2. Espressione transiente di TrCel5A e TrCel5A-mCherry Proteine

1. In condizioni sterili, scegliere singole colonie di Agrobacterium Agarobacterium (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RifR) contenenti sia pTRAkc-ER-TrCel5A o pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry e trasferimento in una beuta contenente 10 ml di estratto di lievitobrodo (YEB, preparato come da specifiche del costruttore) medio e kanamicina (50 mg / ml), rifampicina (50 mg / ml), e carbenicillina (100 mg / ml) per la selezione. Incubare per 36-40 ore a 26 ° C e 180 rpm. Nota: Il disegno di costrutti adeguati per l'espressione della proteina è al di fuori del campo di applicazione del presente documento, ma per l'orientamento, i metodi di Maclean et al ^13, e Munro e Pellham ¹⁴ può essere seguito per la progettazione di costrutto..
2. Prendere 200 ml di ciascuna coltura per inoculare 20 ml di YEB con le concentrazioni antibiotiche menzionati sopra e incubare alle stesse condizioni di prima.
3. Dopo 36-40 ore, preinduce culture aggiungendo 2 microlitri acetosyringon (200 mM concentrazione finale), 100 ml 40% (w / v) di glucosio e 200 ml di 1 M MES tampone pH 5.6. Incubare per una notte.
4. Preparare 100 ml di un tampone infiltrazione 2x (100 g / L di saccarosio, 3,6 g / L di glucosio, 8,6 g / L Murashige e Skoog sali basali, Aggiustare il pH a 5,6 con idrossido di potassio).
5. Misurare OD ₆₀₀ delle culture con diluizioni 1:5 fino a raggiungere un diametro esterno ₆₀₀ di 5-6. Calcolare il volume cultura necessaria per 30 ml di mezzo infiltrazione OD a _600. Aggiungere 15 ml di tampone di infiltrazione 2x, quindi aggiungere H ₂ O deionizzata per rendere il buffer fino a 30 ml.
6. Prendere le piante da serra e utilizzare una punta della pipetta al nick il lato abaxial del 3 ^° a 5 ^° foglia dalla parte superiore per facilitare l'infiltrazione.
7. Utilizzare un puntale al nick il lato abaxial delle foglie per facilitare l'infiltrazione.
8. Riempire una siringa con mezzo infiltrazione e metterlo (senza ago) su una delle tacche precedenza. Sostenere siringa con un dito sul lato foglia adaxial. Premere con cautela il mezzo nel tessuto delle zone foglia interveinal. Nota: Dopo l'infiltrazione, coltivare piante in una serra nelle stesse condizioni sopra descritte. Inoltre, mantenere una quota uguale di untreated, piante non transitori di espressione (NTEPs) come controlli, alle stesse condizioni previste per gli impianti infiltrati.

3. Valutazione della TrCel5A-mCherry Expression in fogli vegetali

1. Dopo 4-6 giorni, prendere le piante infiltrati con A. tumefaciens contenenti pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry dalla serra e metterli in una stanza buia per analisi di fluorescenza.
2. Per visualizzare la fluorescenza nelle sezioni foglia esprimono TrCel5A-mCherry, impianti luce utilizzando una sorgente di luce portatile che emette luce verde a 515 nm con un filtro rosso (620-750 nm). Nota: In profondità Caratterizzazione dell'espressione proteica nelle foglie delle piante può essere ottenuto da foglie sottili-sezionamento con vibratome e esame sotto luce e microscopia a fluorescenza. Per questo attenersi alla seguente procedura:
   1. Tagliare piccole sezioni di circa 5 x 5 mm formato da una foglia infiltrato ed integrarli nel 4% agarosio disciolto in tampone fosfato 50 mM (pH 5,7).
   2. CutSezione di 80-90 micron dimensioni da foglie embedded utilizzando un vibratome. Sistemarle su un vetrino da microscopio, coprire con tampone o un coprioggetto ed esaminare utilizzando un microscopio a ingrandimento 10X con un rivelatore a fluorescenza, utilizzando la stessa lunghezza d'onda e filtro sopraindicato.

4. TrCel5A Estrazione di Foglie di tabacco

1. Tagliare pezzi di foglie di tabacco per un peso di circa 1 g da piante infettate con A. tumefaciens contenenti pTRAkc-ER-TrCel5A e posto in un mortaio preraffreddato con azoto liquido. Aggiungere una quantità appropriata di azoto liquido per i campioni. Grind foglie in polvere con un pestello preraffreddato.
2. Aggiungere 2 ml di tampone fosfato (PBS) contenente fluoro phenylmethylsulfonyl 1 mM alla materia foglia terreno e mescolare fino a quando la maggior parte della materia foglia è in sospensione. Estratto centrifugare a 15.000 xg per 20 min a 4 ° C e prendere proteici supernatante.
3. Centrifuge l'estratto a 15.000 xg per 20 min a 4 ° C e rimessa proteici surnatante facendo attenzione a non disturbare il pellet. Eliminare il pellet.
4. Parzialmente purificare TrCel5A incubando il supernatante contenente proteine ​​a 55 ° C per 10 min. Lasciar riposare a temperatura ambiente per altri 10 minuti, quindi si centrifuga a 15.000 xg per 10 minuti a RT. Ripetere parziale processo di purificazione per gli impianti non infiltrate per ottenere campioni di controllo. Utilizzare questi esempi per tutti i seguenti esperimenti. Nota: Le soluzioni proteiche possono essere conservati a 4 ° C fino a 1 settimana oa -20 ° C per 3 mesi.
5. Ripetere il processo di purificazione parziale per gli impianti non infiltrate per ottenere campioni di controllo. Utilizzare questi esempi per tutti i seguenti esperimenti. Nota: Le soluzioni proteiche possono essere conservati a 4 ° C fino a 1 settimana oa -20 ° C per 3 mesi.

5. SDS-PAGE, Western Blotting, e Azo-CMC zimografia di TrCel5A-mCherry

1. Acquistare o preparare il 12% (p / v) gel SDS-PAGE come da metodi stabiliti ^15.
2. Sciogliere CMC in acqua fino a (w / v) di 1,5%. Per rendere CMC-gel SDS-PAGE, sostituire 1 ml di 1,5% CMC per 1 ml di acqua in una soluzione di 10 ml di SDS-PAGE mix gel, risultando in un 0,1% (w / v) CMC + 12% (w / v ) SDS-PAGE mix gel. Versare il gel normalmente. Nota: Assicurarsi che la CMC nella soluzione originale è completamente sciolto dalla combinazione di agitazione e riscaldamento a 40 ° C (ripetere direttamente prima della preparazione della soluzione di gel).
3. Denaturare campioni per ebollizione in presenza di SDS, secondo metodi stabiliti ^12. Come controllo positivo, utilizzare una diluizione 1:500 di una cellulasi miscela disponibile commercialmente da T. reesei, come T. reesei ATCC 26921. Come controllo negativo utilizzare una soluzione proteica simile preparati da foglie non infiltrate (NTEPs).
4. Eseguire l'elettroforesi secondo normali protocolli ^15,ad esempio uso 200 V per ~ 50 min con elettroforesi arrestato una volta che il fronte del colorante raggiunto il fondo del gel.
5. Macchiare un gel SDS-PAGE usando 0,1% (w / v) blu brillante Coomassie e Destain utilizzando una miscela di acido glaciale metanolo / acetico. Nota: Rapid colorazione e decolorazione possono essere eseguite con blando riscaldamento la colorazione e decolorazione soluzioni, cioè usando un forno a microonde per ~ 15 sec per scaldare (ma non bollire) prima della colorazione e poi le soluzioni decolorante, cambiando la soluzione decolorante dopo 10 min , o una volta raffreddato, e ripetere con la nuova soluzione decolorante.
6. Eseguire Western blotting di un gel SDS-PAGE utilizzando protocolli stabiliti ^16,17. Utilizzare i seguenti anticorpi: un anticorpo policlonale di coniglio contro un anticorpo anti-coniglio regione His-tag (primario) e una capra policlonale Fc che è stato coniugato con fosfatasi alcalina (secondario). Nota: anticorpi secondari dovrebbero essere selezionati per consentire la visualizzazione utilizzando nitroblu tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3 '-indolyphosphate sale p-toluidina (NBT / BCIP), come descritto ^18.
7. Eseguire in-gel proteico ripiegatura sul 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE gel incubando il gel in 1.5% (w / v) β-ciclodestrina, tampone fosfato-citrato 20 mM, pH 6,5, a temperatura ambiente con agitando delicatamente per 15 minuti ^19.
8. Eliminare la soluzione di β-ciclodestrina e lavare rapidamente il gel con H ₂ O. Incubare a temperatura ambiente in 50 mM tampone acetato di sodio (pH 4,8) per altri 15 min. Eseguire CMC zimografia usando l'ripiegata 0,15% CMC SDS-PAGE gel incubando il gel in 30 mM acetato di sodio a pH 4,8 per 20 minuti a 50 ° C.
9. Eseguire CMC zimografia usando l'ripiegata 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE gel incubando il gel in 30 mM tampone sodio acetato (pH 4,8) per 20 min a 50 ° C.
10. Macchiare il gel per 10 minuti utilizzando un 0,1% w / v soluzione di rosso Congo e Destain per 30 minuti o fino a bande chiare sono osservati usando 1 M NaCl. Lavare il gel con 0,3% (v / v) di acido acetico per l'imaging più chiara.

6. 4 MUC Activity Assay di TrCel5A

1. Preparare una soluzione stock di 10 mm 4-MUC nel 50% (v / v) di metanolo, e conservarla al buio a temperatura ambiente
2. Immediatamente prima del test, preparare una soluzione di lavoro 4-MUC 2x, composto da 1 mM a 4 MUC e 60 mM acetato di sodio, pH 4,8.
3. Eseguire il test su campioni contenenti 100 ml di proteina foglia (con o senza TrCel5A inducibile espressa), 100 microlitri di una miscela di cellulasi disponibile in commercio da T. 1:1.000 reesei, e pure H ₂ O, rispettivamente. Eseguire ogni campione in triplicato.
4. Dispensare 100 ml di soluzione di lavoro di 4 MUC in pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti, quindi aggiungere 100 ml di ciascun campione.
5. Determinare 0 min timepoint di 4-MU fluorescenza mediante spettroscopia a fluorescenza, utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 360 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 465 nm.
6. Incubare le piastre per 20min a 50 ° C, coperto con coperchi adesivi per evitare l'evaporazione. Arrestare la reazione mediante congelamento (o combinando 100 ml 0,15 M glicina, pH 10,0, e 100 ml di campione in un piatto a parte).
7. Determinare il punto finale di 4-MU fluorescenza mediante spettroscopia a fluorescenza, utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 360 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 465 nm. Sottrarre 0 min da endpoint (20 min) timepoint avere la variazione nei valori di fluorescenza.

7. Azo-carbossimetilcellulosa Activity Assay di TrCel5A

1. Preparare uno stock di 1,5% (w / v) Azo-CMC che è conservato a RT, e una soluzione di precipitazione contenente 18 mM acetato di zinco, 0,5 M di acetato di sodio, pH 5 e 80% di etanolo (v / v), conservare a camera temperatura.
2. Immediatamente prima del saggio, preparare una soluzione Azo-CMC 2x lavoro composto da 1% (w / v) Azo-CMC (in H ₂ O) e 60 mM acetato di sodio, pH 4,8.
3. Unire 50 ml di campione e 50 ml di lavoroing soluzione in provette da 1,5 ml.
4. I campioni di prova contenenti 50 ml di proteina foglia (con o senza TrCel5A transitoriamente espressa); 100 ml di una cellulasi miscela disponibile commercialmente da T. reesei diluita 1:1000; e puro H ₂ O. Eseguire i campioni e gli standard in triplice copia.
5. Incubare campioni per 20 min a 50 ° C. Arrestare la reazione aggiungendo 250 ml di soluzione di precipitazione. Vortex ogni campione vigorosamente per 10 sec a garantire soluzioni sono state completamente combinati.
6. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min e poi di nuovo vortice. Centrifugare i campioni a 1.000 xg per 10 min. Prelevare 200 ml di ogni campione di surnatante ad una piastra a 96 pozzetti, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
7. Dosaggio con spettroscopia assorbanza alla lunghezza d'onda di 590 nm.

8. PAHBAH Tenore di TrCel5A

1. Utilizzare un buco pugno di tagliare un cerchio (~ 5,5 millimetri di diametro), della carta da filtro. Aggiungere 100 microlitri NaAc 60 mM, pH 4,8, 1 e00 ml di campioni, sia contenenti proteine ​​foglia (con o senza TrCel5A inducibile espressa) o T. commerciali miscela cellulasi reesei, diluito 1:1000, e incubare con filtro cerchi di carta per 20 ore a 50 ° C con 300 rpm agitazione. Per ogni campione incubato con carta da filtro, incubare anche una soluzione duplicato senza carta filtro per singoli sample-controlli.
2. Preparare una 330 mM p-idrossi idrazide dell'acido benzoico (PAHBAH) Una soluzione sciogliendo PAHBAH in H ₂ O con l'aggiunta di 5 ml di HCl conc per un totale di 100 ml di soluzione, e conservare a RT. Nota: I migliori risultati si ottengono aggiungendo l'HCl in un volume più piccolo di PAHBAH slurry, cioè 30 ml, che viene agitata sotto della temperatura per la dissoluzione prima di effettuare il volume a 100 ml con H ₂ O.
3. Preparare PAHBAH soluzione B, contenente citrato di sodio 50 mM, 10 mM cloruro di calcio, e NaOH 500 mM e conservare a temperatura ambiente.
4. Immediately prima del test, preparare una soluzione di lavoro 1.5x di 1 ml PAHBAH reattivo a 9 ml di soluzione tampone, negozio in ghiaccio fino al momento dell'uso (da utilizzare entro 4 ore).
5. Preparare i campioni in termostabili 0,2 o 0,5 ml provette. Combinare 5 ml di ciascuna soluzione incubati con carta da filtro (passo 8.1) 45 ml di H ₂ O e 100 ml di soluzione di lavoro PAHBAH. Controlli a campione (campioni incubati senza filtro di carta) devono essere eseguiti con le stesse concentrazioni (5 microlitri del campione, 45 ml di H ₂ O, soluzione di lavoro 100 microlitri PAHBAH). Testare e 5 standard (5 mL) contenenti tra 0 e 0,2 g / L di glucosio, e puro H ₂ O. Eseguire i campioni e gli standard in triplice copia.
6. Incubare i campioni esattamente per 10 min a 100 ° C, poi raffreddare a temperatura ambiente per esattamente 10 min. Le soluzioni pipetta in una piastra da 96 pozzetti e dosaggio spettroscopiche ad una lunghezza d'onda di 410 nm. Sottrarre i singoli campioni-controlli (incubate senza filtro di carta) da campioni per ottenere finalevalori.

Risultati

TrCel5A e TrCel5A-mCherry sono stati espressi con successo in piante di tabacco usando il sistema di espressione transiente (Figure 1A e 1B). L'esame del modello di espressione della proteina di fusione TrCel5A-mCherry rivelato foglie sane (Figura 1C), che ha mostrato un'ampia espressione proteica sotto luce verde (Figura 1D).

Estrazione delle proteine ​​solubili totali è stata eseguita su piante di tabacco che avevano fogli...

Discussione

Espressione ricombinante di cellulasi è un campo di grande interesse, a causa del desiderio di più efficienti sistemi di produzione di biocarburanti ^1. Le piante offrono molte possibilità per la produzione di cellulasi successo, con caratteristiche come le tecniche di raccolta economica e metodi autohydrolysis essendo proprietà molto desiderabili per la produzione di biocarburanti su larga scala. Inoltre, l'uso di diverse localizzazioni per la produzione di proteine ​​consentire, se necessario, modifiche ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4-metilumbelliferile β-D-cellobioside	SIGMA-ALDRICH	M6018
Acido acetico	ROTH	3738
Acetosiringone (concentrato)	ROTH	6003
Antibiotico - kanamicina	ROTH	T832
Antibiotico - rifampicina	ROTH	4163
Antibiotico - carbenicillina	ROTH	6344
Anticorpo - coniglio anti His(6) pAb	ROCKLAND	600-401-382
Anticorpo - capra anti coniglio AP, FC pAb	DIANOVA	111-055-008
Azo-carbossimetilcellulosa	MEGAZYME	S-ACMC
β-ciclodestrina	SIGMA-ALDRICH	C4805
Cloruro di calcio diidrato	SIGMA-ALDRICH	C5080
Carbossimetilcellulosa	ROTH	3333.1
Cellulasi da Trichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
Congo rosso	SIGMA-ALDRICH	75768
Coomasie blu brillante G 250	ROTH	9598.2
D(+)-glucosio	ROTH	8337
Carta	Ethanol ROTH	K928
- Carta assorbente Rotilabo	ROTH	CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
Tampone MES	ROTH	4256
Metanolo	ROTH	8388
Citrato di sodio	ROTH	3580
Dodecilsolfato di sodio	SERVA	20765
Idrossido di sodio	ROTH	6771
Suolo, Einheitserde classic	Spettrometro PATZER GMBH
- Infinite M200	TECAN
Saccarosio	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-Idrossi benzidrazide	SIGMA-ALDRICH	H9882
Soluzione salina tamponata fosfato	ROTH	1058
Sorgente di luce UV - BLAK RAY	UVP
Vibratome - VT1000S	Leica