Espressione ricombinante Cellulase Cel5A da Trichoderma reesei In piante di tabacco

Summary

Piante di tabacco sono stati usati per produrre una cellulasi fungine, TrCel5A, tramite un sistema di espressione transiente. L'espressione potrebbe essere monitorato utilizzando una proteina di fusione fluorescente, e l'attività della proteina è stata caratterizzata post-espressione.

Abstract

Enzimi degradanti Cellulosa, cellulasi, sono obiettivi sia di ricerca e di interessi industriali. La preponderanza di questi enzimi in-a-cultura difficili organismi, come funghi ife costruzione e batteri anaerobici, ha accelerato l'uso di tecnologie ricombinanti in questo campo. Metodi di espressione pianta sono un sistema desiderabile per la produzione su larga scala di enzimi e altre proteine ​​industrialmente utili. Qui, sono dimostrati metodi per l'espressione transitoria di un endoglucanasi fungina, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum. Espressione della proteina successo è mostrato, monitorato mediante fluorescenza utilizzando una proteina di fusione mCherry-enzima. Inoltre, una serie di test di base sono utilizzati per esaminare l'attività di transitoriamente espresso T. reesei Cel5A, compresi SDS-PAGE, Western blotting, zimografia, nonché fluorescenza e substrato saggi degradazione dye. Il sistema qui descritto può essere usato per produrre una cella attivaulase in un breve periodo di tempo, in modo da valutare il potenziale di ulteriore produzione in impianti attraverso sistemi di espressione costitutiva o inducibile.

Introduction

La degradazione della biomassa lignocellulosica e la sua conversione in combustibile liquido è stato immaginato come un metodo per ridurre la dipendenza dai combustibili fossili. Un ostacolo importante nella realizzazione di sistemi di elaborazione biomassa economicamente realizzabili è nella degradazione enzimatica della cellulosa ed emicellulosa ^1. Sistemi di espressione vegetali mostrano un grande potenziale per la produzione di enzimi su scala industriale. Sistemi agricoli ad impianti di raccolta economicamente e di volume sono già stabiliti, come lo sono stati per migliaia di anni. La produzione di cellulasi in piante è desiderabile a causa di f....

Protocol

1. Crescita di Wild Type N. tabacum Piante

1. Per crescere N. tabacum L. cv. Piante Petit Havana SR1 sul suolo, luogo semi del tabacco su pentole adeguate riempiti con normale terriccio per la germinazione. Dopo 2 settimane, il trasferimento piantine ai singoli vasi. Incubare le piante in una serra con costante di 22 ° C (periodo buio) o 25 ° C (periodo di luce) e 70% di umidità relativa dell'aria. Fornire illuminazione in un 16/8 ore di luce / buio ciclo (ad esempio Philips IP65 400 lampade W; 180 micromol · sec ^-1 · m ^-2; λ = 400-700 nm) e di acqua al giorno.

2. Espression....

Results

TrCel5A e TrCel5A-mCherry sono stati espressi con successo in piante di tabacco usando il sistema di espressione transiente (Figure 1A e 1B). L'esame del modello di espressione della proteina di fusione TrCel5A-mCherry rivelato foglie sane (Figura 1C), che ha mostrato un'ampia espressione proteica sotto luce verde (Figura 1D).

Estrazione delle proteine ​​solubili totali è stata eseguita su piante di tabacco che avevano fogli.......

Discussion

Espressione ricombinante di cellulasi è un campo di grande interesse, a causa del desiderio di più efficienti sistemi di produzione di biocarburanti ^1. Le piante offrono molte possibilità per la produzione di cellulasi successo, con caratteristiche come le tecniche di raccolta economica e metodi autohydrolysis essendo proprietà molto desiderabili per la produzione di biocarburanti su larga scala. Inoltre, l'uso di diverse localizzazioni per la produzione di proteine ​​consentire, se necessario, modifiche .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-metilumbelliferile β-D-cellobioside	SIGMA-ALDRICH	M6018
Acido acetico	ROTH	3738
Acetosiringone (concentrato)	ROTH	6003
Antibiotico - kanamicina	ROTH	T832
Antibiotico - rifampicina	ROTH	4163
Antibiotico - carbenicillina	ROTH	6344
Anticorpo - coniglio anti His(6) pAb	ROCKLAND	600-401-382
Anticorpo - capra anti coniglio AP, FC pAb	DIANOVA	111-055-008
Azo-carbossimetilcellulosa	MEGAZYME	S-ACMC
β-ciclodestrina	SIGMA-ALDRICH	C4805
Cloruro di calcio diidrato	SIGMA-ALDRICH	C5080
Carbossimetilcellulosa	ROTH	3333.1
Cellulasi da Trichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
Congo rosso	SIGMA-ALDRICH	75768
Coomasie blu brillante G 250	ROTH	9598.2
D(+)-glucosio	ROTH	8337
Carta	Ethanol ROTH	K928
- Carta assorbente Rotilabo	ROTH	CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
Tampone MES	ROTH	4256
Metanolo	ROTH	8388
Citrato di sodio	ROTH	3580
Dodecilsolfato di sodio	SERVA	20765
Idrossido di sodio	ROTH	6771
Suolo, Einheitserde classic	Spettrometro PATZER GMBH
- Infinite M200	TECAN
Saccarosio	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-Idrossi benzidrazide	SIGMA-ALDRICH	H9882
Soluzione salina tamponata fosfato	ROTH	1058
Sorgente di luce UV - BLAK RAY	UVP
Vibratome - VT1000S	Leica