Il trapianto di pelle di coda è un potente modello per studiare il rigetto dipendente dalle cellule T e l'induzione della tolleranza durante le risposte immunitarie allogeniche nei topi. I vantaggi di questo protocollo sono la chirurgia invasiva minore e la facilità di monitoraggio senza la necessità di sacrificare il topo ricevente.
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Articolo metodologico
Il trapianto di coda della pelle per studiare allogenico di cellule T CD4 risposte in topi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo studio delle risposte delle cellule T e delle loro conseguenze durante il riconoscimento dell'allo-antigene richiede un modello che consenta di distinguere tra cellule T del donatore e dell'ospite, di monitorare facilmente il trapianto e di adattare il sistema per rispondere a diverse domande immunologiche. Medawar e colleghi hanno stabilito il trapianto allogenico della pelle della coda nei topi nel 1955. Da allora, il modello di trapianto di pelle è stato continuamente modificato e adattato per rispondere a domande specifiche. L'uso della pelle della coda rende questo modello facile da valutare per il rigetto del trapianto, non richiede né una preparazione approfondita né un'anestesia profonda, è applicabile ad animali di ogni tipo genetico, scoraggia la necrosi ischemica e consente l'intervento chimico e biologico.
In generale, sia le cellule T allogeniche CD4+ che CD8+ sono responsabili del rigetto degli allotrapianti poiché riconoscono antigeni maggiori di istocompatibilità non corrispondenti provenienti da diversi ceppi di topo. Sono stati descritti diversi modelli per l'attivazione delle cellule T allogeniche nei topi trapiantati di pelle. L'identificazione di molecole di classe I e II del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) in diversi ceppi di topi, compresi i topi C57BL/6, è stato un passo importante verso la comprensione e lo studio delle allorisposte mediate dalle cellule T. Nel modello di trapianto di pelle di coda qui descritto, una mutazione a tre punti (I-Abm12) nel solco di presentazione dell'antigene della molecola MHC-classe II (I-AB) è sufficiente per indurre una forte attivazione allogenica delle cellule T CD4+ nei topi C57BL/6. Gli innesti cutanei di topi I-Abm12 su topi C57BL/6 vengono respinti entro 12-15 giorni, mentre gli innesti singegenici sono accettati per un massimo di 100 giorni. L'assenza di cellule T (topi CD3-/- e Rag2-/-) consente l'accettazione dell'innesto cutaneo fino a 100 giorni, che può essere superata trasferendo 2 x 104 cellule T wild type o transgeniche. Le cellule T trasferite in modo adottivo proliferano e producono IFN-γ nei topi Rag2-/- trapiantati in I-Abm12.
Introduzione
Il trapianto di organi solidi come la pelle, cuore e reni è ormai una procedura standard nella pratica medica in tutto il mondo 1. Organi trapiantati con successo possono essere rifiutati dalla attivazione del sistema immunitario ricevente, che riconosce i principali antigeni di istocompatibilità del donatore. Pertanto, i pazienti trapiantati necessitano di un trattamento con farmaci immunosoppressori 2. Il trapianto allogenico pelle nei topi è stata fondata da Medawar e colleghi nel 1955 ed è stato utile per identificare le molecole mirate successivamente descritto come complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I e II. Da allora, il modello di trapianto di pelle è stato costantemente modificato e adattato per studiare il ruolo di sottoinsiemi di cellule T e la rilevanza di prodotti chimici e di intervento biologico nel sopprimere rigetto 2-4. Pelle dall'orecchio e il tronco sono più difficili da preparare e sono più suscettibili di ipossia e necrosi di coda pelle 5; tuttavia,la procedura di trapianto è simile. Inoltre il monitoraggio dei trapianti coda-pelle è facile a causa della caratteristica struttura dei capelli della pelle.
Questo articolo fornisce una procedura dettagliata per MHC di classe II trapianto coda della pelle disadattamento che permette lo studio dei diversi aspetti del CD4 + T cellulo-mediata rigetto e la tolleranza nei topi. La mutazione naturale tre punti nella molecola MHC di classe II IA b (chiamato IA BM12) 6-9 è sufficiente per indurre il rigetto di alloinnesti cutanee in topi C57BL / 6 8. Il BM12 molecola IA attiva le cellule T CD4 + con vari recettore delle cellule T αβ-(TCR) catene da C57BL / 6 topi, tra cui cellule T Vα2Vβ8-TcR-specifici sono stati identificati al fine di generare un topo transgenico TcR-10. Il trasferimento adottivo di cellule Vα2Vβ8-TcR specifiche T è stato utilizzato per creare un modello di rigetto nei C57B immunodeficientiL / 6 Rag2 - / - topi trapiantati con la pelle IA BM12.
Differenze genetiche tra donatore e ricevente impatto l'esito di trapianto di accettazione e di rifiuto. Ci sono diversi tipi di trapianti: autologhi sono trapianti dal singolo destinatario stesso; syngrafts e allotrapianti sono trapianti da individui geneticamente identici e geneticamente imparentati, rispettivamente. L'accettazione di diversi trapianti di organi allogenici è stata dimostrata dagli interventi chimici e biologici nei pazienti e nei modelli murini 11,3,4. In un approccio di base, anti-CD3 anticorpo trattati C57BL / 6 topi hanno mostrato una sopravvivenza prolungata di IA BM12 tail-pelle (dati non pubblicati). L'esaurimento delle CD4 + e CD8 + T cellule prima del trapianto in topi riceventi provocato l'accettazione delle MHC di classe I e II innesti non corrispondenti (Rev. in 12). È interessante notare che il rigetto di innesti di pelle dipende dalla presenza di CD4 + Cellule T (Rev. in 12). In questo modello, il targeting interazioni specifiche tra le diverse cellule immunitarie, bloccando le molecole di costimolazione con anticorpi o soppressione di cellule T regolatorie potrebbe indurre tolleranza (dati non pubblicati). Infatti, il blocco sia CD40 e CD28 ha portato a lungo termine di tolleranza allogenico pelle 13,14.
Trapianto Tail-pelle è facile da eseguire e facile da controllare rispetto al trapianto di altri organi. Inoltre, trapianti coda-pelle sono facili da preparare e sono meno sensibili a ischemia di altri tessuti cutanei. In contrasto con anestetici iniettati, l'uso di gas anestetico (isofluorano) durante il trapianto accorcia sia la procedura e tempi di recupero destinatario. Arricciamenti del trapianto coda-pelle, che può portare alla guarigione della ferita incompleta e rigetto del trapianto, è impedita dalla applicazione di adesivo tissutale. Inoltre, il modello di trapianto di coda-pelle IA BM12 attiva esclusivamente CD4 + Cellule T sia immunocompetenti e topi immunodeficienti (dello stesso background genetico) facilitare l'interpretazione dei risultati.
Questo protocollo descrive un modello di topo affidabile, riproducibile e facilmente controllato che permette intervento chimico e biologico. Il modello è stato progettato per indagare il rifiuto e la tolleranza induzione di trapianti di coda della pelle.
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Protocollo
In questa pubblicazione video e protocollo, sono state condotte tutte le procedure sugli animali conformemente al protocollo animali approvato dall'Autorità cantonale di Basilea-Città, Svizzera. Eseguire tutte le procedure in condizioni sterili, ove possibile.
1. Preparazione di Chirurgia
- Sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici e garza prima dell'uso.
- Riscaldare il pad calda e organizzare strumenti chirurgici sulla tabella (tabella dei materiali / metodi).
- Aprire le bende striscia dito. Applicare vaselina sul pad ferita con un batuffolo di cotone (assicurarsi che la garza è completamente coperto).
- Pesare i topi e somministrare analgesia Buprenorfina 0,05 mg / kg di peso corporeo. Nota: questo fornirà analgesia subito dopo il trapianto.
2. Preparazione della coda-pelle per il trapianto
- Euthanize topi donatori (ad esempio, IA BM12) per CO 2 asfissia e disinfect le code con una soluzione di disinfezione prima escissione.
- Posizionare la coda con la striscia nera verso il basso su una tavola di plastica pulito e tagliato longitudinalmente tutta la linea mediana, facendo una incisione superficiale coinvolge solo lo strato di pelle.
- Estrarre la pelle dalla coda con pinze di presa.
- Mettere la coda pelle in una coltura di cellule piatto di 10 centimetri riempito con 10 ml HBSS.
3. Procedura chirurgica
- Anestetizzare topi riceventi (ad esempio, C57BL / 6) per inalazione di una soluzione isofluorano 3% in una scatola trasparente induzione. Nota: Ci vogliono 3-5 minuti per il mouse per raggiungere l'anestesia piano chirurgico. Utilizzare veterinario unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Posizionare il mouse sul tappetino tiepida e applicare 1,5% isofluorane tramite una maschera bocca e asini ogni riflesso animale punta pizzicare.
- Shave il sito dorsale dei topi riceventi (ad esempio, C57BL / 6) e rimuovere i peli contaminanti utilizzando una garza sw asciuttoab.
- Disinfettare sito trapianto rasata con una soluzione asettica.
- Pizzicare la pelle con una pinza nel sito centrale / destra del dorso e usare le forbici curve per fare un giro incisione di circa 1 x 0,6 centimetri.
- Se l'emorragia si verifica, quindi pulire la ferita con un tampone di cotone sterile.
- Valutare la dimensione della incisione e tagliare un trapianto della dimensione stimata dalla coda-pelle con il bisturi.
- Tagliare gli angoli per arrotondare il trapianto.
- Caricare il trapianto sul bisturi, eccesso secco di HBSS su un batuffolo di cotone sterile e posizionarlo nel letto innesto del mouse destinatario.
- Evitare la sovrapposizione di donatore e la pelle host e applicare l'adesivo di tessuto sulla zona di contatto in esclusiva.
- Applicare un cerotto, senza pieghe intorno alla vita del mouse.
- Applicare l'adesivo bendaggio non elastico per fissare l'intonaco al mouse (3 mm spostato).
- Incidere con le forbici circa 3 mm nel sito ventrale superiore del bendaggio. Nota: Questo per evitare trANALITICI dei denti del mouse durante la fase di recupero.
- Rimuovere l'anestetico-bocca-maschera e mantenere i topi trapiantati sulla rampa di riscaldamento fino sveglio.
- Ritorno topi trapiantati nelle loro gabbie solo quando completamente recuperato e valutare la loro mobilità per garantire che la fasciatura non sia troppo stretto.
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con etanolo al 70% prima di procedere con un intervento chirurgico successivo.
4. Cure post-operatorie
- Aggiungere sciroppo contenente paracetamolo per l'acqua potabile (4 mg / ml) e somministrare per 7 giorni.
- Ritorno mouse per stanza degli animali una volta che ha recuperato.
- Monitorare attentamente i topi per segni clinici, tra cui la depressione o altri cambiamenti comportamentali (alimentari o di immobilità), aspetto anomalo (mancanza di grooming) o la postura (pilo-erezione o postura ricurva) per il tempo la benda è a posto (1 settimana).
5. Fasciatura Removal (6-7 giorni post-trapianto)
- Anesthetize topi per inalazione di una soluzione isofluorano 3% in una scatola trasparente induzione (vedi sopra).
- Tagliare benda e gesso con le forbici arterie e cura rimuoverle. Nota: evitare di allungamento del sito trapianto.
- Monitorare i topi trapiantati di segni clinici (v. 4.3) e il punteggio per il rifiuto di innesti cutanei (Tabella 1). Nota: Il sistema di punteggio innesto sfrutta le diverse texture dei capelli sulla coda-pelle rispetto alla dorsale pelle. L'aspetto del trapianto e il suo rifiuto è classificato in 3 gradi. Pelle allogenico (MHC II non corrispondenti, ad esempio, IA BM12) innesti di C57BL / 6 topi immunocompetenti di solito sono rifiutati entro 12-15 giorni dopo il trapianto (dati propri e 15-20).
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Risultati
In un primo approccio C57BL / 6 topi sono stati trapiantati con IA allotrapianti BM12 e IA b syngrafts. Dopo la rimozione della fasciatura, innesti segni manifesti di guarigione della ferita senza chiusura della zona di contatto in topi C57BL / 6 (Figura 1A). Dopo la rimozione della fasciatura, CD4 + T infiammazione cellulo-mediata portato alla comparsa di zone necrotiche (macchie rosse) e rigetto di alloinnesti IA BM12 in C57BL / 6 topi entro 13 giorni dopo i...
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Discussione
Trapianto di pelle è un metodo ampiamente usato per studiare rifiuto e tolleranza dipende cellule T. Poiché il modello di trapianto di pelle è stato istituito, sono stati applicati diversi adattamenti e modifiche. Nella procedura descritta, IA BM12 trapianto coda-pelle viene eseguita utilizzando il gas anestetico (isofluorane). L'uso di anestesia gas diminuisce il tempo di esecuzione e topi di recupero, che diminuisce lo stress sui topi trapiantati. La procedura impiega tessuto adesivo per fissare la coda...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni SNF PPOOA-_119204 e PPOOP3_144918 a S.W.R. Ringraziamo E. Palmer e B.T.H. Hausmann per i mouse e la competenza tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Betadine soluzione standard | Mundipharma | ||
| Cotton fioc | Carl Roth GmbH | 31025060 | |
| Dafalgan , UPSA | Bristol Myers Squibb UPSA | ||
| Hansaplast strisce per le dita | Beierdorf AG | REF.76861 | |
| Adesivo tissutale Histoacryl | Braun | REF.1050052 | |
| Leukotape classic , 2 cm x 10 m | BSN Medical SAS | REF.02204-00 | |
| PBS, soluzione salina tamponata con fosfato, pH 7,4 | Invitrogen | 10010015 | GIBCO |
| Garza sterile, 5 x 5 cm, 8 strati | MaiMed GmbH | 21010 | |
| Pinza a modello stretto | FST | 11003-12 | |
| Forbice a iride fine curva | FST | 14095-11 | |
| Forbice a iride fine | FST | 14094-11 | |
| Forbici per maionese | FST | 14010-15 | |
| Forbici per arteria con punta a sfera 11,5 cm | FST | 14080-11 | |
| Pinze per tessuti | FST | 11021-14 | |
| Lama chirurgica n. 20 | Swann-Morton LTD | 3006 | |
| Manici per lame chirurgiche | Siringa Swann-Morton LTD | ||
| , 1 ml | ARTSANA | ||
| Monouso Temgesico, buprenorfina | ESSEX Chemie AG | 0,3 mg/ml | |
| Piastre per coltura tissutale 10 cm, 60,1 cm2 | TPP | ||
| Vaselina | Vifor SA | ||
| Pad caldo | Solis | Tipo 223 |
Riferimenti
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