Il metodo di coltura tridimensionale descritto in questo protocollo ricapitola sviluppo pancreas dispersi da progenitori topo pancreas embrionali, compresa la loro notevole espansione, differenziazione e morfogenesi in un organo ramificato. Questo metodo è suscettibile di immagini, interferenze funzionali e manipolazione della nicchia.
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Articolo metodologico
In Vitro Pancreas Organogenesis da dislocati embrionali di topo Progenitori
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il pancreas è un organo essenziale che regola l'omeostasi del glucosio e secerne enzimi digestivi. La ricerca sull'embriogenesi del pancreas ha portato allo sviluppo di protocolli per produrre cellule pancreatiche da cellule staminali 1. L'intero organo embrionale può essere coltivato in più fasi di sviluppo 2-4. Questi metodi di coltura sono stati utili per testare farmaci e per visualizzare i processi di sviluppo. Tuttavia, l'espansione dell'organo è molto limitata e la morfogenesi non è ricapitolata fedelmente, poiché l'organo si appiattisce.
Proponiamo condizioni di coltura tridimensionali (3D) che consentono l'espansione efficiente dei progenitori pancreatici embrionali dissociati di topo. Manipolando la composizione del terreno di coltura è possibile generare sia sfere cave, composte principalmente da progenitori pancreatici che si espandono nel loro stato iniziale, sia organoidi complessi che progrediscono verso progenitori espandibili più maturi e si differenziano in cellule endocrine, acinose e duttali e che si auto-organizzano spontaneamente per assomigliare al pancreas embrionale.
Dimostriamo qui che il processo in vitro ricapitola molti aspetti dello sviluppo naturale del pancreas. Questo sistema di coltura è adatto per studiare come le cellule cooperano per formare un organo riducendo la sua complessità iniziale a pochi progenitori. Si tratta di un modello che riproduce l'architettura 3D del pancreas e che è quindi utile per studiare la morfogenesi, compresa la polarizzazione delle strutture epiteliali e la ramificazione. È anche opportuno valutare la risposta a segnali meccanici della nicchia come la rigidità e gli effetti sulla tensegrità della cellula.
Introduzione
Cultura Organ fornisce un modello utile che colma il divario tra il complesso, ma di grande rilevanza nelle indagini vivo e conveniente, ma approssimativa simulazione di modelli di linee cellulari. Nel caso del pancreas, non vi è alcuna linea cellulare perfettamente equivalente a progenitori pancreas anche se ci si trasformano linee cellulari che simulano cellule endocrine ed esocrine. L'intero pancreas adulto non può essere coltivato; isolato isolotti endocrini possono essere mantenuti per poche settimane senza proliferazione cellulare e fette di tessuto possono essere tenuti in vitro per alcune ore 5. Cultura pancreas embrionale è stato ampiamente utilizzato non solo per studiare il suo sviluppo, ma anche per indagare interazioni epitelio-mesenchimale 4,6,7, all'immagine processi 8 o interferire chimicamente con essi 9. Due organi metodi di coltura sono utilizzati principalmente: la prima consiste nella coltura gemme pancreatiche su piastre rivestite di fibronectina 2, che è conveutile per gli scopi di imaging; la seconda opzione è quella di cultura organi sui filtri all'interfaccia aria-liquido 3,4 che meglio conserva morfogenesi. Sebbene molto utile, questi metodi portano ad un certo grado di appiattimento; l'espansione di progenitori è molto limitato rispetto al normale sviluppo e la popolazione di partenza è complesso comprendente tutti i tipi di cellule pancreatiche e cellule mesenchimali.
La capacità di cultura ed espandere cellule primarie disperse è prezioso per studiare le relazioni lignaggio e scoprire le proprietà intrinseche dei tipi di cellule isolate 10. Sugiyama et al 11. Potrebbe mantenere progenitori pancreas e progenitori endocrini che hanno conservato alcuni caratteri funzionali per 3-5 giorni di coltura su livelli di alimentazione. Pancreatospheres, simile a neurospheres 12 e mammospheres 13, sono stati espansi da isolotti adulte e cellule duttali sebbene la natura dei progenitori / cellule staminaliche generano queste sfere non è chiaro. Inoltre, in contrasto con sviluppo fisiologico, i pancreatospheres contenevano alcuni neuroni 14,15. Spheres sono stati recentemente realizzati da progenitori pancreas embrionale 16,17 e rigenerante pancreas 18 con buona espansione progenitrici e la successiva differenziazione, ma non è riuscito a riepilogare morfogenesi.
Modelli 3D da cellule disperse e spesso definiti che l'auto-organizzano in organi miniaturizzati hanno recentemente fiorito e simulare lo sviluppo o adulto fatturato di più organi quali l'intestino 19,20, 21 stomaco, il fegato 22, la prostata 23 e la trachea 24. In alcuni casi, la morfogenesi di sviluppo e differenziazione sono stati riassunti in 3D da cellule ES, come è il caso di tazze ottiche 25, 26 o intestino cerebrali 27.
Qui, desCRIBE un metodo per espandere dissociate progenitori pancreatici multipotenti in un ponteggio 3D Matrigel dove possono differenziarsi e di auto-organizzarsi.
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Protocollo
Questo protocollo mira a far crescere organoidi pancreatiche derivate da E10.5 murino dissociate cellule pancreatiche epiteliali.
Il protocollo richiede l'approvazione etica per la sperimentazione animale.
1. Dissezione della gemma dorsale del pancreas da E10.5 embrioni di topo
- Sacrifica il topo gravide temporizzata a giorno embrionale (E) 10.5, aprire l'addome con un paio di forbici, rimuovere le due corna uterine e metterli in un piatto di 10 centimetri di Petri riempita con fosfato freddo tampone salino (PBS) o Dulbecco modificato mezzo essenziale (DMEM) tenuta in ghiaccio. L'esperimento totale dal sacrificio di semina delle cellule avviene in 60-90 min per prevenire danni cellulari.
- Separare l'utero in singoli segmenti di embrioni utilizzando piccole forbici. Trasferire un embrione di un piatto 35 millimetri Petri con PBS freddo e visualizzare sotto un microscopio da dissezione con illuminazione dall'alto. Con una pinza dissezione rimuovere il muscolo, decidua e tuorlo circostante sac ed esporre l'embrione. Posizionare l'embrione di nuovo in mezzo DMEM freddo. Gli embrioni possono essere facilmente trasferiti utilizzando 3 ml di trasferimento di plastica pipetta / contagocce. Isolare ogni singolo embrione in modo simile prima di continuare.
- Inserire un embrione in un 35 millimetri piatto pulito Petri in PBS.
- Utilizzare pinze sottili (0,05 mm di larghezza) per rimuovere la zampa anteriore. Inserire delicatamente la pinza nell'apertura per staccare il tubo digerente dalla regione del midollo spinale (Figura 1). OPTIONAL: Per vedere più comodamente lo stomaco, rimuovere la parte superiore del corpo dell'embrione, fino al cuore e la regione di coda sotto il gambo tuorlo.
- Individuare lo stomaco, il fegato e l'intestino. Utilizzando le pinze, isolare il tratto gastrointestinale dallo stomaco all'intestino e trasferirla in DMEM freddo su ghiaccio (Figura 1). Il germoglio pancreatico dorsale è attaccato dorsalmente, posteriormente allo stomaco (Figura 1).
- Isolare ogni individuo tratto gastrointestinale in un Similar modo prima di continuare. Se devono essere genotipizzati gli embrioni, raccogliere la coda al momento della dissezione e mantenere ogni singolo tratto gastrointestinale in un ben diverso in una piastra da 24 pozzetti con DMEM freddo sul ghiaccio.
- Posizionare un tratto gastrointestinale in un 35 millimetri piatto pulito Petri in PBS freddo. Ora usate l'illuminazione dal basso in campo chiaro di visualizzare e analizzare il bocciolo pancreatico dorsale sotto il microscopio di dissezione. Queste condizioni di ottimizzare la visualizzazione dei volumi. Usando aghi di tungsteno elettroliticamente-affilati o 20 aghi da siringa G, isolare la gemma pancreatica con il minor mesenchima possibile intorno l'epitelio (Figura 1).
- Trasferire il germoglio isolato in una capsula petri contenente una soluzione dispasi fredda (1,25 mg / ml) per 2-3 min. Da questo punto, trasferimento può più convenientemente essere fatto con-tirato fiamma 50 capillari di vetro microlitri collegati ad un tubo flessibile bocca controllato. In alternativa, ma con più risk di perdere la gemma, utilizzare un 10 microlitri pipetta automatica (Pipetman) con appropriati consigli di plastica.
- Eseguire pancreatica aspirazione nascere ed espulsione sotto controllo microscopico. Mettere la gemma pancreatica nel PBS. Ulteriori pulire la gemma pancreatica isolato dal mesenchima con gli aghi e aspirando delicatamente utilizzando la capillare di vetro (Figura 1).
- Quando l'intero mesenchima viene rimosso, sciacquare la gemma pancreatica in PBS freddo; trasferire ogni germoglio di DMEM freddo nei singoli pozzetti (60 pozzetti mini-vaschette riempite con 10 ml di DMEM freddo). È importante non rimuovere mesenchima in dispasi, che rende il tessuto molto appiccicoso.
2. Placcatura e la coltura di cellule dislocati
- Trasferire gli epiteli sezionato da tutti gli embrioni con un bicchiere capillare tirato fiamma nei pozzetti conici di 60 pozzetti mini-vassoi riempiti con 10 microlitri di PBS per il risciacquo.
- Trasferire il germoglio in 10 ml di tripsina 0,05% and lasciate incubare a 37 ° C per 4 min. Inattivare la tripsina trasferendo il germoglio in un pozzo con 10 microlitri DMEM + 10% di siero fetale bovino (FCS).
- Dissociare la sospensione cellulare per aspirazione attraverso una capillare sottile tirato con un estrattore pipetta. È importante evitare bolle in questa fase mentre pipettando su e giù per dissociare le cellule. Organoidi pancreas in modo ottimale a partire da piccoli gruppi di 5-15 cellule e quindi la dissociazione parziale è raccomandata (Figura 1).
- Si riuniscono le cellule da diversi embrioni in una provetta Eppendorf per minimizzare le differenze dovute al trattamento individuale. Diluire la sospensione cellulare in refrigerate Matrigel in un rapporto 1:3. Aliquotare questa miscela in una piastra a 96 pozzetti, 8 microlitri / pozzetto in una piastra o ottimizzato per l'imaging (vedi sotto).
- Incubare la piastra a 37 ° C per 5 minuti, consentendo al Matrigel per addensare. Riempire i pozzetti con 70 ml di mezzo di sua scelta (organoide o sfera, vedi Tables 1 e 2) e lasciare in un ambiente umidificata contenente il 5% di CO 2 e il 95% aria a 37 ° C.
- Sostituire il mezzo ogni 4 ° giorno. Monitorare le crescenti colonie pancreatiche quotidiana e documentare il processo di imaging.
- Piccole molecole o proteine di interesse possono essere aggiunti al mezzo in questa fase per esperimenti di interferenza, come riportato in precedenza 28.
Tabella 1: media organoide.
| Nome del materiale | Archivio Concentrazione | Concentrazione nel mezzo finale | Volume di magazzino |
| Penicillina-Streptomicina | 100% | 1% | 50 microlitri |
| Sostituzione Serum KnockOut (supplemento) | 100% | 10% | 500 microlitri |
| 2-mercaptoetanolo | 14.3 M | 0,1 mm | 1 ml |
| Phorbol Myristate acetato (PMA) | 16 micron | 16 Nm | 5 microlitri |
| Y-27632 (inibitore ROCK) | 50 mM | 10 pM | 1 ml |
| EGF | 50 mg / ml | 25 ng / ml | 2,5 microlitri |
| Ricombinante umana R-spondina 1 | 250 mg / ml | 500 ng / ml | 10 microlitri |
| - O - | |||
| Ricombinante mouse R-spondina 1 | 250 mg / ml | 500 ng / ml | 10 microlitri |
| FGF1 ricombinante umano (aFGF) | 100 pg / ml | 25 mcg / ml | 1.25 microlitri |
| Eparina (Liquemin) | 2500 U / ml | 2,5 U / ml | 2 microlitri |
| Recombinant FGF10 umano | 100 pg / ml | 100 ng / ml | 5 microlitri |
| DMEM/F-12 | 4,412.25 microlitri | ||
| Totale | 5.000 pl |
Tabella 2: Sphere medie.
| Nome del materiale | Archivio Concentrazione | Concentrazione nel mezzo finale | Volume di magazzino |
| Penicillina-Streptomicina | 100% | 1% | 50 microlitri |
| B27 x50 (supplemento) | 100% | 10% | 100 microlitri |
| FGF2 ricombinante umano (bFGF) | 100 pg / ml | 64 ng / ml | 3.2 microlitri |
| Y-27632 (inibitore ROCK) | 50 mM | 10 pM | 1 ml |
| DMEM/F-12 | 4.845,8 ml | ||
| Totale | 5000 microlitri |
3. Imaging della progressione dello Sviluppo organoide
- Organoidi fotografia sia giornaliero o mediante microscopia time lapse utilizzando un microscopio a fluorescenza time-lapse. Per l'imaging lasso di tempo, utilizzare un XY (Z) microscopio a fluorescenza invertito automatizzato.
- Deposito piccole goccioline di 3 ml in piastre 4 pozzetti o piastre con fondo di vetro riempiti con 2-5 ml di media. Immagine con un obiettivo 10x lunga distanza. Nota: I topi transgenici che esprimono traccianti fluorescenti possono essere utilizzati. Movie 1 mostra per esempio l'espansione iniziale di organoidi da Pdx1-Ngn3-ER TM-IRES-nGFP + mouse 4. La GFP nucleare consente all'utente di monitorare le cellule come singoli oggetti ma principi simili possono essere applicati per monitorare le cellule con membrana fluorescenza talecome mT / mG topi 29.
- Inizia time-lapse imaging 3 ore dopo la semina delle cellule per evitare derive di messa a fuoco e impostare l'automazione di controllo software di prendere 1 foto / h per 3 o più giorni in posizioni definite manualmente. Per ogni posizione, acquisire un contrasto interferenziale immagine (DIC), nonché il segnale GFP, notifica espressione marcatore fluorescente.
4. Recupero di organoidi di Istologia
- Posizionare la piastra a 96 pozzetti su ghiaccio e rimuovere il mezzo, sostituendolo con ghiaccio PBS freddo. Questo depolimerizza parzialmente Matrigel.
- Aspirare delicatamente ogni singolo organoide, rimuovendo il Matrigel circostante con una punta di 1.000 ml, al fine di non perturbare l'architettura complessiva. Trasferire ciascun organoide a un pozzo con ghiaccio freddo PBS. Mantenere la piastra su ghiaccio. Fissaggio diretto in Matrigel è anche possibile.
- Fissare la organoide per 15 minuti a 4% paraformaldeide (PFA), criopreservare in saccarosio e incorporarlo in gelatina. Elaborare ogniorganoide per criosezionamento e istologia come precedentemente descritto (Johansson et al., 2007) 4.
5. Recupero di organoidi per la PCR e Biochimica
- Posizionare la piastra a 96 pozzetti su ghiaccio e rimuovere il supporto. Aggiungere 60 ml di RNAlater per pozzetto per stabilizzare e proteggere RNA cellulare.
- Interrompere il gel in ogni pozzetto meccanicamente da parte depolimerizzante su ghiaccio. O ripristinare singoli organoidi con una punta di 1.000 ml, al fine di non perturbare l'architettura generale o recuperare l'intero bene (con Matrigel) interrompendo il gel meccanicamente con una punta di 200 microlitri. Utilizzare una punta di 1.000 microlitri di trasferire il contenuto e in un libero non appiccicosa provetta Eppendorf RNAsi tenuto in ghiaccio.
- Lavare i pozzetti con 60 microlitri RNAlater e aggiungere il resto del contenuto alla stessa provetta Eppendorf.
- Centrifugare le provette per 5 min a 500-1000 xga 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante, lasciando solo il 20-30 microlitridi RNAlater nel tubo insieme al pellet. Per biochimica, conservare i campioni più asciutto possibile.
- Non congelare i campioni in RNAlater immediatamente; conservare a 4 ° CO / N (per consentire RNAlater di penetrare a fondo il tessuto). Il tessuto può essere conservato a -20 ° C per una conservazione a lungo termine e può essere successivamente trattati per frammentazione del tessuto e l'estrazione di piccole quantità di RNA.
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Risultati
E10.5 dorsali progenitori pancreatici dissociate e seminate in 3D Matrigel ricapitolano sviluppo del pancreas. Progenitori possono essere più facilmente seguiti con i giornalisti fluorescenti. Nel nostro caso abbiamo utilizzato un topo transgenico che esprime una proteina GFP nucleare controllata dal promotore Pdx1 (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (film 1) in assenza di tamoxifene e quindi senza attivare NEUROG3 4 (Figura 2).
Con il mezzo organoide, una ...
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Discussione
La produzione su larga scala delle cellule beta funzionali in vitro è ancora inefficace 1. In questo contesto impegnativo, studi di biologia dello sviluppo possono aiutare decifrare i segnali esatti che sono necessari per la differenziazione delle cellule beta funzionali. Questo protocollo consente per la manutenzione, l'espansione e la differenziazione di progenitori pancreatici embrionali in vitro. Ciò include la formazione di cellule beta produttrici di insulina che non co-express alt...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato in sequenza da un PRN Frontiere della genetica premio pilota, Juvenile Diabetes Research Foundation Grant e Grant 41-2009-775 12-126875 da Det Frie forskningsråd / Sundhed og Sygdom. Gli autori ringraziano il laboratorio Spagnoli per ospitare le riprese video.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15070-063 | Stock mantenuto a -20 ° C |
| KnockOut Siero di ricambio (supplemento) | Gibco | 10828-028 | Stock mantenuto a -20 ° C |
| 2-mercaptoetanolo | Sigma Aldrich | 3148-25ML | Stock mantenuto a 4 ° C |
| Phorbol Myristate Acetato (PMA) | Calbiotech | 524400-1MG | Stock mantenuto a -20 ° C |
| Y-27632 (inibitore ROCK) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock mantenuto a -20 °C. Attenzione! La stabilità/origine è una fonte frequente di problemi. |
| EGF | Sigma Aldrich | E9644-2MG | Stock mantenuto a -80 ° C |
| R-spondina umana ricombinante 1 | R& D | 4645-RS-025/CF | Stock mantenuto a -80 ° C |
| R-spondina di topo ricombinante 1 | R& D | 3474-RS-050 | Stock mantenuto a -80 ° |
| C FGF1 umano ricombinante (aFGF) | R& D | 232-FA-025 | Stock mantenuto a -80 ° C - non includere per aumentare la produzione di cellule beta |
| Eparina (Liquemin) | Drossapharm | Stock mantenuto a 4 ° | |
| C Ricombinante umano FGF10 | R& D | 345-FG-025 | Stock mantenuto a -80 ° C |
| DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15070-063 | Stock mantenuto a -20 ° C |
| B27 x50 (supplemento) | Gibco | 17504-044 | Stock mantenuto a -20 ° |
| C Ricombinante umano FGF2 (bFGF) | R& D | 233-FB-025 | Stock mantenuto a -80 ° C |
| Matrigel | Corning | 356231 | Stock mantenuto a -20 ° C |
| Tripsina 0,05% | Gibco | 25300-054 | Stock mantenuto a 4 ° C |
| RNAlater - Reagente stabilizzante dell'RNA | Qiagen | 76104 | Conservare presso RT |
| Dispase | Sigma Aldrich | D4818-2MG | Concentrazione di lavoro: 1,25 mg/ml. Stock mantenuto a -20 ° C |
| BSA per la ricostituzione | del milipore | 81-068 | Per la ricostituzione delle citochine - stock mantenuto a -20 ° C |
| Siero fetale di vitello (FCS) | Gibco | 16141079 | Stock mantenuto a -20 ° C |
| Vassoi MicroWell a 60 pozzetti | Sigma Aldrich | M0815-100EA | |
| Piastre a 4 pozzetti | Thermo Scientific | 176740 | |
| Piastre a 95 pozzetti F fondo | Greiner Bio | 6555180 | |
| Piastre inferiori in vetro | Ibidi | 81158 | |
| Micropipette in vetro per smaltimento | Blaubrand | 708745 | |
| Microscopio | Stazione di imaging Cell® (supporto Olympus IX81 invertito motorizzato) dotata di una fotocamera Hamamatsu ORCA ER B7W e del Ludin Cube e Box. Il supporto Leica DMI6000 B è circondato da un cubo Ludin e da una scatola, dotato di una fotocamera Leica DFC365 FX e dell'interfaccia di comando software AF6000 Expert/Matrix. | ||
| Obiettivo | Olympus UPLAN FL NA 0,30 aria 9,50 mm 10X lunga distanza; Leica HC PL FLUOTAR NA 0,30 aria 11,0 mm 10X lunga distanza |
Riferimenti
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