È stato sviluppato un approccio per identificare le condizioni ottimali di concentrazione virale per campioni d'acqua di piccolo volume utilizzando punte di adenovirus umano. Le tecniche qui descritte sono utilizzate per identificare i parametri di concentrazione per altri bersagli virali e applicate alla sperimentazione della concentrazione virale su larga scala.
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Articolo metodologico
A Procedura piccolo volume per concentrazione virale da Water
In questo articolo
Sommario
Abstract
La concentrazione su piccola scala di virus (volumi di campione da 1 a 10 L, qui simulati con campioni d'acqua da 100 ml) è un modo efficiente ed economico per identificare i parametri ottimali per la concentrazione del virus. I virus possono essere concentrati dall'acqua mediante filtrazione (elettropositiva, elettronegativa, lana di vetro o esclusione dimensionale), seguita da una concentrazione secondaria con estratto di manzo per rilasciare i virus dalle superfici filtranti e infine da una concentrazione terziaria che si traduce in un volume di 5-30 ml di concentrato virale. Al fine di identificare le procedure di concentrazione ottimale, sono stati valutati due diversi filtri elettropositivi (un filtro vetro/cellulosa [1MDS] e un filtro nano-allumina/vetro [NanoCeram]), nonché diverse tecniche di concentrazione secondaria; La tecnica Celite in cui sono state valutate tre diverse dimensioni delle particelle di Celite (fine, media e grande) seguita dal confronto di questa tecnica con quella del metodo di flocculazione organica consolidato. Vari additivi di eluizione sono stati inoltre valutati per la loro capacità di migliorare il rilascio di particelle di adenovirus (AdV) dalle superfici del filtro. Il celite a particelle fini ha recuperato livelli simili di AdV40 e 41 a quelli del metodo di flocculazione organica stabilito quando sono stati aggiunti picchi virali durante la concentrazione secondaria. Il filtro vetro/cellulosa ha recuperato livelli più elevati di entrambi, AdV40 e 41, rispetto a quello di un filtro in nano-allumina/fibra di vetro. Sebbene non statisticamente significativo, l'aggiunta di eluante dell'estratto di manzo modificato con polifosfato di sodio allo 0,1% ha recuperato il 10% in più di particelle AdV rispetto all'estratto di manzo non modificato.
Introduzione
Virus enterici umani sono importanti agenti eziologici di malattie trasmesse dall'acqua 1-3, ma sono generalmente presenti in numero ridotto nelle acque ambientali contaminate, rendendo la loro individuazione difficile senza concentrazione. Le procedure utilizzate per concentrare virus includono tipicamente una fase di filtrazione, seguita da filtro eluizione, e concentrazione secondaria dell'eluato filtro. Una procedura di filtrazione comune si basa sull'uso di membrane cariche quali filtri elettropositivi (recentemente recensito in 4,5). Questi filtri si basano sulla cattura virus sospese in acqua utilizzando interazioni elettrosta....
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Protocollo
1. Preparazione di cristalleria e Filter Contenitori
- Se non diversamente specificato, sterilizzare tutti i bicchieri, contenitori e soluzioni di filtro a 121 ° C per 15 minuti. Per garantire la sterilità, coprire tutte le aperture o le superfici esposte sia con fogli di alluminio o di carta nastro fissato prima della sterilizzazione.
- Montare apparato di filtrazione allegando alloggiamento del filtro (diametro di 47 mm) a 1 L braccio laterale beuta. Raccogliere filtri necessari: 47 mm di diametro filtri a disco elettropositivi / electronegative.
- Preparare 1 L di estratto di carne bovina 1,5% (flocculanti; produ....
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Risultati
Selezione Celite
Tre diversi tipi di celite stati testati prima della selezione della variante migliore performante. Celites con ammenda di particelle di medie dimensioni realizzati i più alti recuperi adenovirus. L'uso di grandi celites comportato recuperi inferiori sia AdV40 e 41 (range 32% -100%) (Figura 1). Recuperi medi di adenovirus 40 erano 144% ± 52% (fine), 115% ± 28% (medio) e il 82% ± 53% celites (grande) di particelle e per AdV41, 132% ± 39% (fine), 83%.......
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Discussione
Filtri electropositive sono utili nella concentrazione virus dall'acqua; Tuttavia questi filtri possono differire nella loro struttura e composizione che potrebbe a sua volta alterare la loro efficacia. Ad aggravare questo problema, le strutture e le spese del capside variano tra i ceppi virali che richiedono tecniche di concentrazione essere adattati per garantire il recupero ottimale 15. Attraverso semplici modifiche delle tecniche di concentrazione esistenti (ad esempio, filtri elettropositivi.......
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Dichiarazioni
Nessun interesse finanziario in competizione.
Le opinioni espresse in questo articolo sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni o le politiche dell'Agenzia per la protezione dell'ambiente degli Stati Uniti. La menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali non costituisce approvazione o raccomandazione per l'uso.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Dr. Nicholas J. Ashbolt e il Dr. G. Shay Fout per la loro revisione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47 mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47 mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefiltro 47 mm | Millipore Corp. | ||
| Glicina | Sigma | 50046-1KG | |
| Polifosfato di sodio | Acros Organics | 390930010 | |
| Tripsina | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Acido cloridrico | Fisher | A481-212 | |
| BBL Estratto di manzo | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Estratto di manzo | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Sistema di PCR in tempo reale | ABI | N/A | |
| Alloggiamento del filtro in acciaio inossidabile | Millipore Corp. | ||
| Kit di estrazione del DNA del sangue | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calcolatore | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
Riferimenti
- Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
- WHO. Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , World Health Organization. Geneva. (2003).
- Westrell, T., et al.
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Ristampe e permessi
