Nanogold Etichettatura del Sistema lievito endosomiale per le analisi ultrastrutturali

Sommario

Lievito di birra, Saccharomyces cerevisiae, è stata un organismo modello chiave per identificare e studiare geni che regolano la biogenesi e le funzioni del sistema endosomal. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per l'etichettatura specifico dei comparti endosomiali per gli studi ultrastrutturali.

Abstract

Endosomi sono uno dei principali membrana ordinamento posti di blocco nelle cellule eucariotiche e regolano il riciclaggio o la distruzione delle proteine ​​per lo più dalla membrana plasmatica e il Golgi. Di conseguenza il sistema endosomal svolge un ruolo centrale nel mantenimento dell'omeostasi cellulare, e mutazioni in geni appartenenti a questa rete di organelli interconnessi da trasporto vescicolare, causano gravi patologie tra cui il cancro e disturbi neurobiologici. E 'quindi di primaria importanza per comprendere i meccanismi alla base della biogenesi e l'organizzazione del sistema endosomal. Il lievito Saccharomyces cerevisiae è stato fondamentale in questo compito. Per etichettare e analizzare a livello ultrastrutturale sistema endosomal di questo organismo modello specifico, presentiamo qui un protocollo dettagliato per la nanogold assorbimento carica positiva da sferoplasti seguite dalla visualizzazione di queste particelle attraverso una reazione valorizzazione argento. Questo metodo è anche un prezioso troppol per l'esame morfologico di mutanti con difetti nel traffico endosomal. Inoltre, non è solo applicabile per esami ultrastrutturali ma può anche essere combinato con etichettature immunogold delle indagini localizzazione della proteina.

Introduzione

Il sistema endosomal è un importante apparato di smistamento membrana che svolge molteplici ruoli cellulari cruciali, tra cui il traffico di recettori smistamento enzima lisosomiale e il riciclaggio di membrana plasmatica (PM) recettori ^1,2. Endosomi sono divisi in tre diversi comparti, vale a dire. gli endosomi precoci (EE), alla fine degli endosomi (LE) e le endosomi di riciclo. Questa classificazione si basa sul tempo impiegato materiale endocitosi raggiungerli, sulle proteine ​​marker specifiche e sulla loro morfologia. Membrane, ovvero proteine ​​e lipidi bistrati, interiorizzate dal PM possono sia essere consegnati ai lisosomi via e....

Protocollo

1. Spheroplast Preparazione

1. Incubare il lievito notte a 30 ° C in 10 ml di mezzo appropriato determinato dal disegno dell'esperimento.
2. Il giorno dopo, misurare la densità ottica della coltura a 600 nm (OD ₆₀₀₎ usando un fotometro, Diluire le cellule nello stesso terreno di coltura ad una OD ₆₀₀ di 0,2-0,4 e farle crescere ad una fase di crescita esponenziale meno che la progettazione del esperimento richiede una condizione diversa. Le cellule sono in fase esponenziale quando la coltura ha un diametro esterno ₆₀₀ di 1-2.
3. Raccogliere 10 OD ₆₀₀ equivalenti di cellule mediante centrifugazione ....

Risultati

Secondo il protocollo presentato, la morfologia del sistema lievito endosome può essere accesso da EM trasmissione. Figura 1 mostra diversi tipi di compartimenti endosomiali che sono stati raggiunti e quindi etichettati con nanogold. Il nanogold-argento avanzato può essere chiaramente visto come elettroni particelle dense. Le impostazioni ottimali stabiliti per la reazione valorizzazione argento permette avente particelle di oro in una gamma omogenea dimensioni tra 5 e 15 nm, che non interferisce con l&.......

Discussione

Immuno-microscopia elettronica è una tecnica che permette di combinare localizzazione di proteine ​​con la risoluzione ultrastrutturale dei vettori e organelli dove queste proteine ​​risiedono. Ciò è particolarmente importante quando si studia il sistema lievito endosomiale perché i suoi comparti appaiono come strutture puntuate in microscopia a fluorescenza. È pertanto difficile distinguerle. Per questo motivo l'uso di una sonda rilevabile da EM e immettendo il percorso endocitosi in modo dipendente dal tempo è cru.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
TUBI (piperazina-1,4-bis (2-etansulfensaure)	Merck, Darmstadt, Germania	1,102,200,250
HEPES	Merck, Darmstadt, Germania	391,340
EGTA	Sigma, St louis, MO	E4378
MgCl2· 6H2O	Merck, Darmstadt, Germania	1.058.330.250
DL-Ditiotreitolo	Sigma, St louis, MO	D0632
Sorbitolo	Sigma, St louis, MO	S1876
Nanogold Nanoprobes caricate	positivamente, Yaphank, NY	2022	negozio a -20 ° C
HQ-silver™ kit di miglioramento	Nanoprobes, Yaphank, NY	2012	negozio a -20 ° C
Paraformaldeide (PFA)	Sigma, St louis, MO	441244
Glutaraldeide 8% grado EM Polyscience	, Inc., Warrington, PA	216	negozio a -20 ° C
Lytic enzyme	MP Biomedicals, Santa Ana, CA	153526	negozio a -20 ° C
Parafilm M	Sigma, St louis, MO	P7793
50 griglie di nichel mesh	Agar Scientific, Stansted, Regno Unito	G209N
Coltello diamantato crio-immuno 35 gradi;	Diatome AG, Biel, Svizzera	N.A.
Ultramicrotomo UCT	Leica, Solms, Germania	N.A.
Formvar 15/95 resina Microscopia	elettronica Sciences, Hatfield, PA	15800
50 mesh griglie di nichel	Agar Scientific, Stansted, Regno Unito	AGG2050N
Parafilm	Sigma, St louis, MO	P7793
Scatola di stoccaggio per griglie	Leica, Solms, Germania	162-50
Falcon 100 mm x 15 mm Piastra di Petri	Corning, Corning, NY	351029
Pipette capillari Pasteur 150 mm	Van Bruggen Glas, Rotterdam, Paesi Bassi	10216234
Microcentrifuga da 1,5 ml	Sarstedt, Nü mbrecht, Germania	72690001
tubo da 50 ml	Bio-one, Alphen aan den Rijn, Paesi Bassi	210296
Benchkote protezione per superfici	Whatman, Maidstone, Regno Unito

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