Una guida per In vivo Singola unità di registrazione da Optogenetically Identificato corticale inibitorio interneuroni

Sommario

Qui descriviamo la nostra strategia per ottenere registrazioni stabili e ben isolate di singole unità da interneuroni inibitori identificati nella corteccia del topo anestetizzata. I neuroni che esprimono ChR2 sono identificati dalla loro risposta alla luce blu. Il metodo utilizza apparecchiature di registrazione extracellulare standard e rappresenta un'alternativa economica all'imaging del calcio o al patching guidato visivamente.

Abstract

Una sfida importante in neurofisiologia è stato quello di caratterizzare le proprietà di risposta e la funzione dei numerosi tipi di cellule inibitoria nella corteccia cerebrale. Siamo qui condividiamo la nostra strategia per l'ottenimento di stabili, ben isolate-single-unit registrazioni da interneuroni inibitori identificati nel topo corticale anestetizzato utilizzando un metodo sviluppato da Lima e colleghi ^1. Le registrazioni vengono eseguite in topi che esprimono channelrhodopsin-2 (ChR2) in specifiche sottopopolazioni neuronali. I membri della popolazione sono identificati dal loro risposta ad un breve lampo di luce blu. Questa tecnica - chiamata "PINP", o Identificazione Fotostimolazione-assistita di popolazioni neuronali - possono essere implementati con equipaggiamento di serie di registrazione extracellulare. Può servire come un'alternativa economica e accessibile per l'imaging calcio o patch visivamente guidato, al fine di indirizzare registrazioni extracellulari alle cellule geneticamente identificati. Here mettiamo a disposizione una serie di linee guida per l'ottimizzazione del metodo nella pratica di tutti i giorni. Abbiamo raffinato la nostra strategia specifica per il targeting (PV +), le cellule parvalbumin-positivo, ma abbiamo trovato che funziona per altri tipi di interneuroni, nonché, come ad esempio (CR +) interneuroni-calretinina esprimono-somatostatina che esprimono (SOM +) e.

Introduzione

Caratterizzare la miriade di tipi di cellule che compongono il cervello dei mammiferi è stato un obiettivo centrale, ma a lungo sfuggente, della neurofisiologia. Ad esempio, le proprietà e la funzione di diversi tipi di cellule inibitorie nella corteccia cerebrale sono argomenti di grande interesse, ma sono ancora relativamente sconosciuti. Ciò è in parte dovuto al fatto che le tecniche convenzionali di registrazione in vivo alla cieca sono limitate nella loro capacità di distinguere tra diversi tipi di cellule. La larghezza della punta extracellulare può essere utilizzata per separare i neuroni inibitori positivi alla parvalbumina putativi dalle cellule pira....

Protocollo

NOTA: Il seguente protocollo è conforme con il National Institutes of linee guida per la salute, come approvato dalla University of Oregon Animal Care and Use Committee.

1. Chirurgia acuta

1. Anestetizzare l'animale con un cocktail di ketamina-medetomidina, via intraperitoneale (ip) iniezione (Tabella 1).
   NOTA: I topi utilizzati in questi esperimenti sono generati attraversando un cre-dipendente ChR2-EYFP transgenico line10 di interneuroni linee conducente (Pvalb-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Consegna virale di ChR2 o opsine correlati dovrebbe funzionare altrettanto bene, assumendo ....

Risultati

Siamo qui condividiamo la nostra strategia per ottenere registrazioni singola unità da interneuroni inibitori geneticamente classificati nel topo corticale anestetizzato, utilizzando un metodo optogenetic sviluppato da Lima et al. Tabella 1 i dettagli cocktail anestetico suggerito, Ketamina-Medetomidina-acepromazina ^(1. " KMA "). La Figura 1 illustra un microelettrodo di tungsteno, preparato per la registrazione. La figura 2 contiene uno schema circu.......

Discussione

Anche se PINP è concettualmente semplice, può essere difficile in pratica. Un fattore determinante del successo è la scelta dell'elettrodo. Il raggio di ascolto elettrica è il parametro critico. Deve essere sufficientemente grande per rilevare i picchi di luce evocata quando la punta è ancora lontano da una cella ChR2 +, in modo che si può regolare la velocità di avanzamento di conseguenza. Allo stesso tempo, deve essere limitato sufficiente a consentire un buon isolamento singola unità. Cioè, l'elettrodo non de.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ChR2-EYFP Linea	Jackson Colonie	12569
Pvalb-iCre (PV) Linea	Jackson Colonie	8069
Sst-iCre (SOM) Linea	Jackson Colonie	13044
Cr-iCre (CR) Linea	Jackson Colonie	10774
Agarose	Sigma-Aldrich	A9793	Tipo III-A, High EEO
Micro Point (dural uncino)	FST	10066-15
Forbici chirurgiche	FST	14084-09
Bisturi	FST	10003-12 (manico), 10011-00 (lame)
Puralube Unguento oftalmico	Foster & Smith	9N-76855
Coperta Omeotermica	Harvard Apparatus	507220F
Microelettrodi di tungsteno	A-M Systems	577200	12 MΩ Resistenza CA, 127 μ m di diametro, 12° punta affusolata, rivestimento epossidico
Tubo capillare in vetro	Warner Instruments	G150TF-3
Guaina termorestringente	DigiKey	A332B-4-ND
Zapit Accelerator	DVA	SKU ZA/ZAA	Utilizzare con la colla Super standard.
Amplificatore CA a microelettrodo 1800	AM Systems	700000
MP-285 Micromanipolatore motorizzato	Sutter	MP-285
Oscilloscopi digitali a 4 canali	Tektronix	TDS2000C
altoparlanti amplificati	Harman	modello JBL
	Scientifica	LBM-7
800 µ m Cavo patch in fibra ottica	ThorLabs	FC/PC BFL37-800
Misuratore	di potenza ThorLabs	PM100D (misuratore di potenza), S121C (sensore di potenza standard)
475 nm Cree XLamp XP-E	DigiKey	XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND	LED la potenza e l'efficienza sono in continuo aumento, quindi si consiglia di controllare gli ultimi prodotti (www.cree.com).
Arduino UNO	DigiKey	1050-1024-ND

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