Una guida per In vivo Singola unità di registrazione da Optogenetically Identificato corticale inibitorio interneuroni

Sommario

Qui descriviamo la nostra strategia per ottenere registrazioni stabili e ben isolate di singole unità da interneuroni inibitori identificati nella corteccia del topo anestetizzata. I neuroni che esprimono ChR2 sono identificati dalla loro risposta alla luce blu. Il metodo utilizza apparecchiature di registrazione extracellulare standard e rappresenta un'alternativa economica all'imaging del calcio o al patching guidato visivamente.

Abstract

Una sfida importante in neurofisiologia è stato quello di caratterizzare le proprietà di risposta e la funzione dei numerosi tipi di cellule inibitoria nella corteccia cerebrale. Siamo qui condividiamo la nostra strategia per l'ottenimento di stabili, ben isolate-single-unit registrazioni da interneuroni inibitori identificati nel topo corticale anestetizzato utilizzando un metodo sviluppato da Lima e colleghi ^1. Le registrazioni vengono eseguite in topi che esprimono channelrhodopsin-2 (ChR2) in specifiche sottopopolazioni neuronali. I membri della popolazione sono identificati dal loro risposta ad un breve lampo di luce blu. Questa tecnica - chiamata "PINP", o Identificazione Fotostimolazione-assistita di popolazioni neuronali - possono essere implementati con equipaggiamento di serie di registrazione extracellulare. Può servire come un'alternativa economica e accessibile per l'imaging calcio o patch visivamente guidato, al fine di indirizzare registrazioni extracellulari alle cellule geneticamente identificati. Here mettiamo a disposizione una serie di linee guida per l'ottimizzazione del metodo nella pratica di tutti i giorni. Abbiamo raffinato la nostra strategia specifica per il targeting (PV +), le cellule parvalbumin-positivo, ma abbiamo trovato che funziona per altri tipi di interneuroni, nonché, come ad esempio (CR +) interneuroni-calretinina esprimono-somatostatina che esprimono (SOM +) e.

Introduzione

Caratterizzare la miriade di tipi di cellule che compongono il cervello dei mammiferi è stato un obiettivo centrale, ma a lungo sfuggente, della neurofisiologia. Ad esempio, le proprietà e la funzione di diversi tipi di cellule inibitorie nella corteccia cerebrale sono argomenti di grande interesse, ma sono ancora relativamente sconosciuti. Ciò è in parte dovuto al fatto che le tecniche convenzionali di registrazione in vivo alla cieca sono limitate nella loro capacità di distinguere tra diversi tipi di cellule. La larghezza della punta extracellulare può essere utilizzata per separare i neuroni inibitori positivi alla parvalbumina putativi dalle cellule piramidali eccitatorie, ma questo metodo è soggetto a errori sia di tipo I che di tipo II^2,3. In alternativa, i neuroni registrati possono essere riempiti, recuperati e colorati per confermare successivamente la loro identità morfologica e molecolare, ma questo è un processo scrupoloso e dispendioso in termini di tempo. Recentemente, popolazioni geneticamente identificate di interneuroni inibitori sono diventate accessibili per mezzo dell'imaging del calcio o delle registrazioni di patch guidate visivamente. In questi approcci, l'espressione virale o transgenica di un reporter del calcio (come la GCaMP) o di una proteina fluorescente (come la GFP) consente l'identificazione e la caratterizzazione dei tipi cellulari definiti dall'espressione del promotore. Questi approcci utilizzano la microscopia a 2 fotoni, che richiede attrezzature costose, e sono anche limitati agli strati corticali superficiali a causa delle proprietà di diffusione della luce del tessuto cerebrale.

Recentemente, Lima e colleghi¹ hanno sviluppato una nuova applicazione dell'optogenetica per indirizzare le registrazioni elettrofisiologiche a tipi neuronali geneticamente identificati in vivo, chiamata "PINP" – o Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations. Le registrazioni vengono eseguite in topi che esprimono Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specifiche sottopopolazioni neuronali. I membri della popolazione sono identificati dalla loro risposta a un breve lampo di luce blu. A differenza di molte altre applicazioni optogenetiche, l'obiettivo non è quello di manipolare la funzione del circuito, ma semplicemente di identificare i neuroni appartenenti a una classe geneticamente definita, che possono poi essere caratterizzati durante la normale funzione cerebrale. La tecnica può essere implementata con apparecchiature di registrazione extracellulare standard e può quindi fungere da alternativa accessibile ed economica all'imaging del calcio o al patching guidato visivamente. Qui descriviamo un approccio al PINPing di specifici tipi di cellule nella corteccia uditiva anestetizzata, con l'aspettativa che i punti più generali possano essere utilmente applicati in altri preparati e regioni del cervello.

In corteccia, PINP è particolarmente promettente per lo studio delle proprietà di risposta in vivo degli interneuroni inibitori. Gli interneuroni GABAergici comprendono un piccolo sottoinsieme eterogeneo di neuroni corticali⁴. Diversi sottotipi, caratterizzati dall'espressione di particolari marcatori molecolari, hanno recentemente dimostrato di svolgere diversi ruoli computazionali nei circuiti corticali^5-9. Man mano che gli strumenti genetici migliorano, potrebbe essere possibile distinguere i tipi morfologicamente e fisiologicamente separabili che rientrano in queste ampie classi. Condividiamo qui la nostra strategia per ottenere registrazioni stabili e ben isolate di singole unità da interneuroni inibitori identificati nella corteccia del topo anestetizzata. Questa strategia è stata sviluppata specificamente per colpire le cellule positive alla parvalbumina (PV+), ma abbiamo scoperto che funziona anche per altri tipi di interneuroni, come gli interneuroni che esprimono somatostatina (SOM+) e che esprimono calretinina (CR+). Sebbene il PINPing sia concettualmente semplice, nella pratica può essere sorprendentemente inflessibile. Abbiamo imparato una serie di suggerimenti e trucchi attraverso tentativi ed errori che potrebbero essere utili ad altri che tentano il metodo.

Protocollo

NOTA: Il seguente protocollo è conforme con il National Institutes of linee guida per la salute, come approvato dalla University of Oregon Animal Care and Use Committee.

1. Chirurgia acuta

1. Anestetizzare l'animale con un cocktail di ketamina-medetomidina, via intraperitoneale (ip) iniezione (Tabella 1).
   NOTA: I topi utilizzati in questi esperimenti sono generati attraversando un cre-dipendente ChR2-EYFP transgenico line10 di interneuroni linee conducente (Pvalb-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Consegna virale di ChR2 o opsine correlati dovrebbe funzionare altrettanto bene, assumendo livelli di espressione simili si ottengono.
2. Prima di iniziare l'intervento, in modo che le esibizioni di animali non risposta ad un pizzico punta dolce. Ri-somministrare anestetici durante l'esperimento come necessario per mantenere questa profondità dell'anestesia. Se si utilizza anestetici iniettabili, eventualmente impiantare un catetere ip per preparazioni iniettabili di manutenzione.
3. Mantenere l'animale idratato con soluzione salina o di Ringer lattato durante l'esperimento (circa 3 ml / kg / ora), per esempio usando un cocktail anestetico opportunamente diluito per preparazioni iniettabili manutenzione (Tabella 1).
4. Posto l'animale in un apparato porta-teste stereotassico o altro. Assicurarsi che il cranio è ben protetto,. Ciò è essenziale per mantenere registrazioni monocellulari stabili.
5. Applicare una pomata opthalamic agli occhi per prevenire la secchezza. Mantenere la temperatura corporea a 36,5-37 ° C.
6. Eseguire uno scarico della cisterna per la stabilità ulteriore registrazione. Usando un bisturi, rimuovere il tessuto dalla faccia posteriore del cranio per esporre la cisterna magna. Fare un piccolo nick nella dura per drenare il liquido cerebrospinale. Utilizzare solo la punta della lama, ed evitare qualsiasi contatto il gambo cervelletto o del cervello.
7. Utilizzando il bisturi, eseguire una piccola craniotomia (~ 2 mm ²⁾ sopra la zona corticale di interesse (per l'acusticacorteccia, circa -2.3 mm posteriormente di bregma, 4,5 millimetri laterale della linea mediana).
8. Rimuovere la dura e coprire la corteccia esposta con uno strato di agarosio calda 0,5 - spessore di 1 mm (1,5% agarosio in soluzione salina, 0,9% di NaCl; applicare a ~ 37 ° C). Mantenere l'umido agarosio tutto l'esperimento applicando periodicamente alcune gocce di soluzione salina.

2. Registrazione Set-up

1. Preparare un elettrodo di tungsteno (7-14 MW, 127 micron di diametro, 12 ° punta affusolata, rivestimento epossidico). Superglue l'elettrodo di un tubo capillare di vetro e aggiungere termorestringente per una presa (figura 1).
2. Montare l'elettrodo su un micromanipolatore motorizzato (o idraulico), impostare viaggiare ortogonale alla superficie corticale. Far scorrere un filo di terra sotto la pelle, contro il cranio. Evitare il contatto con i muscoli sul lato della testa e la parte posteriore del collo, in quanto possono generare artefatti elettromiografici.
3. Amplificazione del segnale elettrico utilizzando un amplificatore extracellulareli fi catore adatto per la registrazione singola unità, preferibilmente dotata di una modalità di controllo dell'impedenza. Monitorare l'attività chiodare in corso (banda passante di 300 - 5.000 Hz) con due oscilloscopi e un set di altoparlanti amplificati. Qui, i dati registrati vengono digitalizzate continuo ad una frequenza di campionamento di 10 kHz; picchi vengono estratti in linea.
4. Avanzare l'elettrodo attraverso l'agarosio finché la punta raggiunge la superficie della corteccia. Osservare questo passaggio attraverso un microscopio. "Zero" questa posizione sul micromanipolatore.
5. Per meglio approssimare la profondità della registrazione, confermare visivamente che la punta dell'elettrodo esce dalla superficie corticale ad una profondità di zero quando ritirare l'elettrodo al termine di una penetrazione.
   NOTA: Una discrepanza tra la lettura manipolatore e la posizione dell'elettrodo osservato indica che è spostata rispetto al tessuto. Questo può essere causato da instabilità del cervello o animale, o manipolatore deriva.
   1. Come un ulteriore controllo per garantire chequesto set-punto zero corrisponde alla superficie della corteccia, monitorare potenziali di campo evocati stimolo mentre avanza attraverso le prime diverse centinaia di micrometri di tessuto. Durante il monitoraggio potenziali di campo, abbassare il più basso filtro passa-banda di taglio dell'amplificatore extracellulare a 10 Hz. Verificare che la polarità del potenziale campo locale inverte intorno una profondità di circa 100 micron, in prossimità dello strato di confine I / II ^13. Questo è un punto di riferimento affidabile per la corteccia uditiva, ma può essere diverso per le altre aree corticali.
6. Montare una fibra ottica accoppiata ad una sorgente di luce blu (figura 2) su un micromanipolatore manuale. Utilizzando il microscopio, posizionare la punta della fibra più vicino alla superficie del agarosio possibile. Centrare il fascio in cui l'elettrodo si entra il tessuto.
7. Regolare l'uscita della sorgente di luce con una unità di controllo in grado di erogare un TTL (transistor-transistor logic) treno di impulsi di larghezza e duratio specificaton- esempio, un Arduino (figura 3), una scheda PC I / O (come mostrato), o un generatore di impulsi disponibile in commercio.
   1. Monitorare il segnale su entrambi oscilloscopi.
8. Misurare potenza luminosa totale (mW) sulla punta della fibra ottica utilizzando un misuratore di potenza. Utilizzare questo valore per calcolare irradianza (mW / mm ²⁾ dividendo per l'area della sezione trasversale del nucleo della fibra. Iniziare con un valore di intensità nell'intervallo 10 - 15 mW / mm ² e regolare verso il basso se necessario, fino artefatti sono eliminati.
9. Verificare la presenza di manufatti leggeri con l'elettrodo nella agarosio, pronta a entrare nel tessuto. Avviare la ricerca treno di impulsi (ad esempio, 30 impulsi di luce msec, 500 msec intervallo interstimulus (ISI)).
   1. Eliminare manufatti leggeri transitori (Figura 4) per riposizionare la fibra ottica rispetto all'elettrodo per cambiare l'angolo della luce incidente. Se artefatti persistono, provare a diminuire la potenza luminosa. In the caso raro che gli artefatti non possono essere completamente eliminati (solo ridotto al minimo), estendere la durata dell'impulso di ricerca. Questo può aiutare a identificare i veri picchi neuronali.

3. Dritto PINP-in '

1. Avanzare l'elettrodo lentamente attraverso il cervello ad una velocità di circa 1 micron / sec. Utilizzare un oscilloscopio per monitorare l'attività in corso. Dall'altro, scatenare gli impulsi laser.
2. Attendere il 'hash' deboli di picchi luce evocata sul monitor audio, che indica che l'elettrodo si avvicina una cella ChR2 + e spesso può essere percepito ben prima del segnale elettrico risulta sull'oscilloscopio. Rallentare la velocità di avanzamento.
   NOTA: Se la cella si trova direttamente nel percorso dell'elettrodo, l'attività di luce evocata crescerà più grande (e più forte). Come l'elettrodo si avvicina un singolo interneuroni, l'hash risolverà in piccoli ma ben definiti picchi di forma e dimensione uniformi.
3. Appena lipicchi GHT-evocato sono grandi abbastanza per innescare della singolarmente sull'oscilloscopio, cominciano a farlo. Regolare la scala sull'asse orizzontale per osservare la forma esatta della forma d'onda di picco.
4. Fermarsi e attendere per il tessuto di stabilirsi. Resistete alla tentazione di spostare l'elettrodo più vicino alla cella. Questo passaggio è fondamentale per una registrazione stabile. Se dopo alcuni minuti il ​​rapporto segnale-rumore non è migliorata - cioè, il tessuto è costante, ma non ha portato la cella più vicino alla punta dell'elettrodo - avanzamento 5 micron ulteriormente e attendere.
   1. Ripetere questo processo fino a quando la punta o la depressione del potenziale d'azione possono essere catturati in modo affidabile con una soglia di tensione impostata ben al di sopra del rumore di fondo (ad esempio, +/- 300 mV o superiore).
      NOTA: C'è poco rischio di falsi positivi o ambiguità quando PINPing interneuroni inibitori. La maggior parte delle cellule in grado di seguire facilmente un treno di impulsi di durata di 30 msec e inter-pulIntervallo SE 500 msec, o più veloce, con una certa latenza primo picco di 2-5 msec (Figura 5). La maggior parte delle cellule fotovoltaiche +, in particolare, può sostenere cottura per un totale di 1 sec (Figura 6). Perché questi sono neuroni inibitori, disynaptic attivazione (indiretto) non è una preoccupazione importante.
5. Durante la registrazione, monitorare l'attività in corso sul primo oscilloscopio. Tieni d'occhio le dimensioni e la forma del picchi utilizzando il secondo oscilloscopio. Si noti la qualità del loro suono sull'altoparlante.
   1. Ascoltate con attenzione per i cambiamenti improvvisi, che indicano che la cella è sia volge troppo vicino all'elettrodo (dove rischia di essere impalato o danneggiato), o è alla deriva. Se le punte si allargano e distorta, tornare indietro; se crescono più piccolo, far avanzare l'elettrodo. Si muovono lentamente in 2 micron passi.
   2. Verificare la qualità della registrazione post-hoc sovrapponendo tutte le forme d'onda di picco, allineati a picco o depressione. Variare le THRES tensionetenere. Attraverso una vasta gamma di valori di soglia, ci dovrebbe essere solo una forma coerente picco di altezza uniforme (figura 5a).
6. Se in qualsiasi momento il segnale venga contaminato con punte da un neurone vicino, andare avanti. Avanza lentamente, sulla remota possibilità che l'elettrodo passerà fuori dalla portata della cella vicina, ma rimanere nel raggio d'azione del neurone bersaglio. (Questo è di solito senza successo.)
7. Spostare l'elettrodo attraverso l'intera profondità della corteccia (900 + micron) in ogni penetrazione. Se non ci sono i neuroni di luce-sensibili si incontrano dopo molti penetrazioni o, al contrario, le registrazioni sono regolarmente contaminati con punte di cellule ChR2- vicini, provare un nuovo elettrodo.
   NOTA: Anche all'interno di una stessa partita, la geometria impedenza e punta di singoli elettrodi può variare considerevolmente. Entrambi i fattori contribuiscono alla effettiva "ascolto raggio" dell'elettrodo, che deve essere sufficientemente grande per rilevare i picchi di luce evocati whricerca ile, ma limitato sufficiente per permettere la registrazione di un singolo interneuroni in isolamento.
8. Testare l'impedenza degli elettrodi lo desideri. Per evitare di danneggiare il tessuto, farlo con la punta dell'elettrodo nella parte superiore dello strato di agarosio, ben al di fuori del cervello. All'interno della gamma di 7-14 MW, l'impedenza esatta non è un sicuro indicatore delle prestazioni, o cedere, per questa applicazione. Detto questo, si tratta di un proxy ragionevole per l'ascolto radio: elettrodi più bassa impedenza raccogliere più unità; elevata impedenza, meno.
9. Alla fine dell'esperimento, eutanasia dell'animale mediante istituzionalmente approvati, quali overdose di anestetico, o dislocazione cervicale sotto un profondo piano di anestesia.

Risultati

Siamo qui condividiamo la nostra strategia per ottenere registrazioni singola unità da interneuroni inibitori geneticamente classificati nel topo corticale anestetizzato, utilizzando un metodo optogenetic sviluppato da Lima et al. Tabella 1 i dettagli cocktail anestetico suggerito, Ketamina-Medetomidina-acepromazina ^(1. " KMA "). La Figura 1 illustra un microelettrodo di tungsteno, preparato per la registrazione. La figura 2 contiene uno schema circu...

Discussione

Anche se PINP è concettualmente semplice, può essere difficile in pratica. Un fattore determinante del successo è la scelta dell'elettrodo. Il raggio di ascolto elettrica è il parametro critico. Deve essere sufficientemente grande per rilevare i picchi di luce evocata quando la punta è ancora lontano da una cella ChR2 +, in modo che si può regolare la velocità di avanzamento di conseguenza. Allo stesso tempo, deve essere limitato sufficiente a consentire un buon isolamento singola unità. Cioè, l'elettrodo non de...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ChR2-EYFP Linea	Jackson Colonie	12569
Pvalb-iCre (PV) Linea	Jackson Colonie	8069
Sst-iCre (SOM) Linea	Jackson Colonie	13044
Cr-iCre (CR) Linea	Jackson Colonie	10774
Agarose	Sigma-Aldrich	A9793	Tipo III-A, High EEO
Micro Point (dural uncino)	FST	10066-15
Forbici chirurgiche	FST	14084-09
Bisturi	FST	10003-12 (manico), 10011-00 (lame)
Puralube Unguento oftalmico	Foster & Smith	9N-76855
Coperta Omeotermica	Harvard Apparatus	507220F
Microelettrodi di tungsteno	A-M Systems	577200	12 MΩ Resistenza CA, 127 μ m di diametro, 12° punta affusolata, rivestimento epossidico
Tubo capillare in vetro	Warner Instruments	G150TF-3
Guaina termorestringente	DigiKey	A332B-4-ND
Zapit Accelerator	DVA	SKU ZA/ZAA	Utilizzare con la colla Super standard.
Amplificatore CA a microelettrodo 1800	AM Systems	700000
MP-285 Micromanipolatore motorizzato	Sutter	MP-285
Oscilloscopi digitali a 4 canali	Tektronix	TDS2000C
altoparlanti amplificati	Harman	modello JBL
	Scientifica	LBM-7
800 µ m Cavo patch in fibra ottica	ThorLabs	FC/PC BFL37-800
Misuratore	di potenza ThorLabs	PM100D (misuratore di potenza), S121C (sensore di potenza standard)
475 nm Cree XLamp XP-E	DigiKey	XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND	LED la potenza e l'efficienza sono in continuo aumento, quindi si consiglia di controllare gli ultimi prodotti (www.cree.com).
Arduino UNO	DigiKey	1050-1024-ND