Linee cellulari Reporter offrono un mezzo per visualizzare, monitorare e isolare le cellule di interesse da popolazioni eterogenee. Tuttavia,-gene targeting utilizzando convenzionale ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali umane è estremamente inefficiente. Qui, descriviamo il targeting CNS mesencefalo specifico PITX3 locus fattore di trascrizione con EGFP utilizzando zinc-finger nucleasi avanzata ricombinazione omologa.
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Articolo metodologico
Zinc-finger nucleasi avanzata gene targeting in cellule staminali embrionali umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
Una limitazione importante con cellule staminali embrionali (ESC) protocolli di differenziazione attuali è la generazione di popolazioni cellulari eterogenee. Queste culture contengono le cellule di interesse, ma sono anche contaminati con i CES indifferenziate, derivati non-neurali e altri sottotipi neuronali. Questo limita il loro uso in vitro ed in vivo applicazioni, come la modellazione in vitro per la scoperta di farmaci o terapia di sostituzione cellulare. Per aiutare a superare questo, linee cellulari giornalista, che offrono un mezzo per visualizzare, monitorare e isolare le cellule di interesse, possono essere progettati. Tuttavia, per raggiungere questo obiettivo in cellule staminali embrionali umane via convenzionale ricombinazione omologa è estremamente inefficiente. Questo protocollo descrive il targeting della homeobox pituitaria 3 (PITX3) locus in cellule staminali embrionali umane utilizzando progettati su misura nucleasi zinc-finger, che introducono site-specific doppio filamento rotture del DNA, insieme ad unPITX3 - EGFP -specifica vettore donatore del DNA. Dopo la generazione della linea cellulare PITX3 giornalista, può quindi essere differenziato utilizzando protocolli pubblicati da utilizzare in studi in vitro come modelli di malattia o terapia di sostituzione cellulare di Parkinson.
Introduzione
Cellule staminali embrionali (ESC) protocolli di differenziazione correnti provocano popolazioni cellulari eterogenee, soprattutto per quanto riguarda la derivazione di specifici fenotipi neuronali. Così, anche se le culture contengono il fenotipo cellulare desiderato, altro neuronale, tipi di cellule non-neuronali e non-differenziati sono spesso presenti 1. Queste caratteristiche limitano l'applicazione del CES derivato fonti di cellule per l'uso in terapia di sostituzione cellulare e nella modellazione delle malattie vitro.
Linee cellulari giornalista genetici offrono un mezzo per visualizzare, monit....
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Protocollo
Tutte le procedure sono eseguite in una cappa a flusso laminare sterile. Tutti i mezzi e le soluzioni sono equilibrati a 37 ° C se non diversamente specificato.
1 Espansione di PSC umani (hESC e hiPSCs, WA-09 utilizzato in questo protocollo) per la trasfezione
Nota: Non è necessario espandere hESC su Matrigel o Geltrex. hESC espanse su fibroblasti embrionali di topo (MEF) possono essere utilizzati per elettroporazione o nucleofection a seguito di una fase di rimozione MEF (vedi sezione 2.8).
- Preparare 1 x 100 mm piatto e 1 x boccetta 75cm2 di DR4 MEF a 2,0 x 10 4 cellule per cm 2
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Risultati
A seguito di co-elettroporazione della PITX3 coppia zinc-finger personalizzato progettato insieme al PITX3 - EGFP DNA -specifica donatore vettore, e la successiva selezione puromicina, hESC cloni positivi sono stati inizialmente rilevati tramite lo screening genomico PCR (Figura 1). Southern blot ibridazione di questi cloni positivi PCR con 5 'e 3' sonde specifiche confermato corretto il targeting to esone 1 del locus PITX3 (Figura 2), con un rendimen.......
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Discussione
La generazione di linee cellulari giornalista offre un potente mezzo per monitorare, visualizzare e isolare le cellule di interesse da una popolazione eterogenea derivato da hESC. Tuttavia, gene targeting via convenzionale ricombinazione omologa ha dimostrato di essere estremamente inefficiente per CES umani 3. In questo protocollo si descrive una tecnica relativamente semplice per l'introduzione di una RP in esone uno dei locus PITX3, in hESC utilizzando un vettore targeting ampiamente disponibi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il lavoro descritto in questo protocollo è stato reso possibile da un finanziamento da parte del governo vittoriana come parte di un'alleanza di collaborazione con l'Istituto californiano per la medicina rigenerativa (CIRM).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fibroblasti embrionali di topo (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatina | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Raschietto cellulare | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Filtro cellulare - 40 μ m | BD Biosciences | 352340 | |
| 33 mm - 0,22 μ m filtro | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R& D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Elettroporatore | BioRad | 165-2661 | |
| Cuvetta per elettroporazione da 0,4 cm | BioRad | 165-2088 | |
| Costrutto di puntamento in avanti TV-hPITX3 umano | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromicina | InvivoGen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Siero fetale bovino, qualificato, inattivato dal calore, origine statunitense (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Miscela di terreno/nutrienti Dulbecco's Modified Eagle F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| Sostituzione del siero KnockOut (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| Aminoacidi non essenziali MEM (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoetanolo | Technologies | 21985-023 | |
| Soluzione di sale sodico N-Lauroilsarcosina (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Cloridrato | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Soluzione di proteinasi K (20 mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Espandi il sistema PCR a modello lungo | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L braccio gen. F (primer): 5' TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3' | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L braccio GFP R (primer): 5' ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3' | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1 kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
Riferimenti
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W.
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Ristampe e permessi
