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Articolo metodologico

Zinc-finger nucleasi avanzata gene targeting in cellule staminali embrionali umane

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DOI:

10.3791/51764

⸱

23 agosto 2014

 ,  ,  ,  , 
1Drug Discovery Biology, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University

In questo articolo

Sommario

Linee cellulari Reporter offrono un mezzo per visualizzare, monitorare e isolare le cellule di interesse da popolazioni eterogenee. Tuttavia,-gene targeting utilizzando convenzionale ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali umane è estremamente inefficiente. Qui, descriviamo il targeting CNS mesencefalo specifico PITX3 locus fattore di trascrizione con EGFP utilizzando zinc-finger nucleasi avanzata ricombinazione omologa.

Abstract

Una limitazione importante con cellule staminali embrionali (ESC) protocolli di differenziazione attuali è la generazione di popolazioni cellulari eterogenee. Queste culture contengono le cellule di interesse, ma sono anche contaminati con i CES indifferenziate, derivati ​​non-neurali e altri sottotipi neuronali. Questo limita il loro uso in vitro ed in vivo applicazioni, come la modellazione in vitro per la scoperta di farmaci o terapia di sostituzione cellulare. Per aiutare a superare questo, linee cellulari giornalista, che offrono un mezzo per visualizzare, monitorare e isolare le cellule di interesse, possono essere progettati. Tuttavia, per raggiungere questo obiettivo in cellule staminali embrionali umane via convenzionale ricombinazione omologa è estremamente inefficiente. Questo protocollo descrive il targeting della homeobox pituitaria 3 (PITX3) locus in cellule staminali embrionali umane utilizzando progettati su misura nucleasi zinc-finger, che introducono site-specific doppio filamento rotture del DNA, insieme ad unPITX3 - EGFP -specifica vettore donatore del DNA. Dopo la generazione della linea cellulare PITX3 giornalista, può quindi essere differenziato utilizzando protocolli pubblicati da utilizzare in studi in vitro come modelli di malattia o terapia di sostituzione cellulare di Parkinson.

Introduzione

Cellule staminali embrionali (ESC) protocolli di differenziazione correnti provocano popolazioni cellulari eterogenee, soprattutto per quanto riguarda la derivazione di specifici fenotipi neuronali. Così, anche se le culture contengono il fenotipo cellulare desiderato, altro neuronale, tipi di cellule non-neuronali e non-differenziati sono spesso presenti 1. Queste caratteristiche limitano l'applicazione del CES derivato fonti di cellule per l'uso in terapia di sostituzione cellulare e nella modellazione delle malattie vitro.

Linee cellulari giornalista genetici offrono un mezzo per visualizzare, monitorare e isolare le cellule di interesse, a condizione che l'espressione della proteina reporter (RP) riproduce l'espressione endogena. L'uso di promotori immediatamente a monte di una regione del gene codificante può essere usata per derivare reporter genetici grezzi ma tali costrutti mancano i precisi elementi regolatori che controllano l'espressione del gene endogeno. Al contrario, la ricombinazione omologa offre laopportunità di garantire l'espressione ad alta fedeltà del RP. In passato, il targeting vettori progettati per ricombinazione omologa a specifici loci di interesse sono stati utilizzati per RP di topo (CES mESCs) bersaglio utilizzando elettroporazione come mezzo di consegna DNA 1,2. Tuttavia la generazione di linee cellulari giornalista via convenzionale ricombinazione omologa è estremamente inefficiente per CES umane (hESC), e, quindi, è stata documentata solo in una manciata di casi (recensito in 3). Utilizzando una proteina chimerica ingegneria contenente una fusione di una nucleasi Fok I con motivi zinc-finger site-specific, conosciuti collettivamente come zinc-finger nucleasi (ZFNs), DNA rotture del doppio filamento possono essere introdotti a livello pre-determinati loci genomici. Quando si aggiunge un vettore di DNA con omologia a entrambi i lati del DNA rottura a doppio filamento, il sito genomico può essere riparato tramite ricombinazione omologa, consentendo l'inserimento della sequenza di DNA donatore. Questa tecnica si è dimostrata utile fo editing genomico in cellule primarie umane 4,5 e 6,7 hESC. Più recente lavoro ha utilizzato trascrizione attivatore-come effettrici nucleasi (Talens), fattori di trascrizione utilizzati da impianti patogeni 8, per aiutare nella progettazione di site-specific nucleasi 9.

Nel seguente protocollo dimostriamo la generazione di una linea cellulare hESC giornalista da elettroporazione di un EGFP contenente omologa vettore targeting 6 insieme ZFNs per l'homeobox pituitaria umana 3 (PITX3) locus. Dopo la selezione antibiotica per 2-3 settimane, hESC con il DNA integrato correttamente possono essere raccolti manualmente, ampliati e proiettati inizialmente tramite PCR, e successivamente convalidati da Southern blotting.

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Protocollo

Tutte le procedure sono eseguite in una cappa a flusso laminare sterile. Tutti i mezzi e le soluzioni sono equilibrati a 37 ° C se non diversamente specificato.

1 Espansione di PSC umani (hESC e hiPSCs, WA-09 utilizzato in questo protocollo) per la trasfezione

Nota: Non è necessario espandere hESC su Matrigel o Geltrex. hESC espanse su fibroblasti embrionali di topo (MEF) possono essere utilizzati per elettroporazione o nucleofection a seguito di una fase di rimozione MEF (vedi sezione 2.8).

  1. Preparare 1 x 100 mm piatto e 1 x boccetta 75cm2 di DR4 MEF a 2,0 x 10 4 cellule per cm 2 in mezzi MEF (vedi Tabella 1) su piatti pre-rivestite con 0.1% w / v di gelatina.
    Nota: CF1, BLK6 o MF1 MEF può essere utilizzato, tuttavia, si consiglia di utilizzare le linee MEF resistenti agli antibiotici, per esempio, DR410.
  2. Il giorno successivo, hESC passaggio su un piatto da 100 millimetri pre-placcato con MEF preparati in sezione 1.1. Per fare questo ASPItasso hESC supporti da culture piatti, lavare hESC con soluzione salina bilanciata Ca2 + / Mg2 + Hanks -free '(HBSS), aggiungere dispasi (vedi Tabella 2 per volumi adeguati) e posto in un incubatore umidificato a 37 ° C / 5% di CO 2. Dopo 3-5 minuti di incubazione, aspirare dispasi e delicatamente lavare 1 - 2 volte con HBSS per rimuovere MEF. Aggiungere i media hESC (vedi tabella 3) e utilizzando un raschietto cellulare, o 5 ml pipetta, raschiare delicatamente le colonie sulla superficie del piatto cultura.
  3. Raccogliere i frammenti di colonie in sospensione dal piatto di coltura in una provetta da centrifuga 15 ml. Piatto cultura Sciacquare con i media hESC e trasferimento al tubo da 15 ml. Fare attenzione a non rompere grumi in cellule singole o in piccoli frammenti.
  4. Centrifugare per 5 minuti a 160 xg per far sedimentare frammenti di colonia.
  5. Aspirare il surnatante. Toccare fondo della provetta 15 ml con il dito per allentare colonia frammento pellet. Frammenti di colonia delicatamente risospendere in hESC supporti in base al rapporto di divisione (normallya divisi rapporto tra 1: 4 e 1: 8 è appropriato). Fare molta attenzione a non rendere grumi nelle singole cellule o piccoli frammenti come questo influenzerà replating efficienza.
  6. Prima di replating frammenti hESC sul MEF di lavaggio 1X con HBSS. Lentamente aggiungere una quantità appropriata (vedi Tabella 2) di sospensione cellulare contenente frammenti hESC nei media hESC ai piatti pre-placcati con MEF.
  7. Posizionare piatti della cultura sulla mensola in incubatrice e muoversi lentamente avanti e indietro e un lato all'altro per distribuire uniformemente frammenti di colonia.
  8. Sostituire i media hESC quotidiana.
  9. Per preparare mezzi condizionati dal MEF (MEF-CM) lavare 75 cm 2 fiasco pre-plated con MEF 1 x con HBSS. Aggiungi i media hESC. Dopo 24 ore, raccogliere condizionata media e sostituire con i media hESC fresca. Ripetere ogni giorno per un massimo di 12 giorni. Conservare MEF-CM a 4 ° C fino al momento dell'uso.

2 Preparazione dei CES umane per la trasfezione

  1. Osservare la crescita di hESCsotto un microscopio giornaliero. Quando le colonie diventano 40-50% confluenti, la piastra 3 x 100 mm con piatti 2,0 x 10 5 MEF per cm 2.
  2. Quando le colonie diventano 60 - 70% confluenti sono pronti per essere transfettate. "Sposo" colonie rimuovendo colonie differenziate o per anime colonia.
    Nota: Come crediamo maggiore trasfezione e l'efficienza di targeting si verificano quando le cellule sono in fase di crescita di registro, si suggerisce di elettroporazione essere effettuati prima di hESC raggiungano ≥ 70% di confluenza.
  3. Lavare colonie hESC con HBSS e aggiungere Accutase.
    Nota: Non è necessario hESCs pretrattare con inibitore ROCK Y-27632 inibizione sufficiente si verifica quando incubati con Y-27632 durante la fase 2.7
  4. Incubare per 10 - 20 min a 37 ° C / 5% di CO 2 fino colonie sono resi singole cellule come visto sotto un microscopio. Cellule Triturare con una pipetta 1 ml.
  5. Aggiungi i media hESC e filtro in un tubo da 15 ml con un straine 40 micron cellar per rimuovere grumi di cellule.
  6. Centrifugare a 160 xg per 5 min. Risospendere il pellet di cellule nei media hESC freschi e ripetere per rimuovere ogni residuo di soluzione Accutase.
  7. Risospendere le cellule in mezzi hESC contenente 10 mM Y-27632 e trasferire la sospensione cellulare totale per un piatto 100 millimetri pre-rivestito con gelatina.
  8. Incubare a 37 ° C / 5% di CO 2 per almeno 30 min.
  9. Durante questo periodo MEF aderirà al piatto di gelatina rivestito. Raccogliere hESC non aderenti con una pipetta 1 ml in una nuova provetta da centrifuga 15 ml e determinare la densità delle cellule utilizzando un emocitometro.

3. Elettroporazione di hESC

  1. Supporti CM-MEF filtro con un filtro da 0,22 micron e aggiungere 10 ng / fattore di crescita dei fibroblasti ml ricombinante umano 2 (rhFGF2).
  2. Trasferire 7,5 x 106 hESC da sezione 2.9 a un nuovo tubo da 15 ml e centrifugare a 160 xg per 5 min.
  3. Durante questo tempo impostato il elettroporatore: Scegliere il programma per ele esponenzialectroporation e impostare i seguenti parametri, Tensione: 250 V, Capacità: 500 uF, e Resistance: ∞-.
  4. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 0,8 ml di ghiacciata 0,22 micron filtrato HBSS. Trasferire la soluzione in una sterile 0,4 centimetri elettroporazione cuvetta.
  5. Aggiungere TV-hPITX3-forward il targeting costrutto (30 mg DNA) e mescolare delicatamente con una pipetta 200 microlitri. Incubare in ghiaccio per 5 min. Durante questo tempo togliere un'aliquota di PITX3 ZFN mRNA e sbrinamento sul ghiaccio. Quando scongelato trasferimento di 7,5 ml di ZFN mRNA a DNA miscela / cellula elettroporazione cuvetta. Mescolare delicatamente con una pipetta 200 microlitri.
    Nota: Il locus nel mirino è il fattore principale che contribuisce alla efficienza di targeting. Codifica Loci geni silenti, i geni non espressi in CES, come PITX3 sono difficili da indirizzare utilizzando convenzionale ricombinazione omologa 6. Così, questo protocollo utilizza progettato su misura ZFNs per il locus PITX3 umano per indurre un DNA a doppio filamento break.
  6. Elettroporazione seguendo le istruzioni sullo schermo sul elettroporatore.
  7. Usando una pipetta 200 ml trasferire il contenuto della cuvetta elettroporazione ad una provetta da 15 ml contenente 10 ml supporti hESC. Lavare la cuvetta due volte con 200 ml di media hESC ogni volta e trasferire in una provetta da 15 ml. Ci saranno "muco-come" detriti costituito da DNA e proteine ​​dalle cellule lisate che avrà un impatto negativo la sopravvivenza delle cellule. Centrifugare a 160 xg per 5 minuti per rimuovere questi detriti.
  8. Aspirare il surnatante e picchiettare delicatamente pellet di cellule per allentare. Risospendere in 30 ml completati MEF-CM contenenti 10 mM Y-27632 e replate composta da 3 x 100 mm preplated piatti con MEF.
  9. Modificare i media giornaliera. Il giorno 2, Y-27632 può essere ritirata e cellule cresciute in soli mezzi hESC.
  10. Dopo 2-3 giorni le hESC devono essere 50-70% confluenti. A questo punto iniziare selezione antibiotica (ad esempio, 0,5 mg / ml puromicina).
  11. Mantenere selezione aggiungendo fresco dei media hESC / puromicina quotidiana. Dopo ~ 7 giorni piccole colonie dovrebbero essere visibili. Se non si utilizzano MEF resistenti agli antibiotici, MEF può essere completata con l'aggiunta di un ulteriore 1,0 x 10 4 cellule per cm 2.

4. Picking cloni transgenici hESC

  1. Circa 14-21 giorni dopo la selezione (quando le colonie hanno raggiunto il diametro di circa 1 mm) preparano piatti per l'espansione e lo screening. Inizia sbrinamento un'aliquota di Matrigel o Geltrex a 4 ° C per un minimo di 5 ore. Diluire come da istruzioni del fabbricante e aggiungere 75 microlitri di ciascun pozzetto di piastre 3 x 96 pozzetti. Preparare piatti 3 x 48 pozzetti da placcatura MEF a 2,0 x 10 4 cellule per cm 2. Incubare entrambe le piastre O / N a 37 ° C / 5% di CO 2.
  2. Il giorno seguente sezionare colonie in 16-25 parti usando un ago G 21 sulla estremità di una pipetta 2 ml tagliando una griglia.
  3. Aspirare Matrigel da piastre da 96 pozzetti e sostituirlo con supplemsupporti ENTED CM-MEF. Lavare MEF in piastre 48 pozzetti 1 x con HBSS e aggiungere i media hESC.
  4. Usando una pipetta 200 microlitri delicatamente trasferire un terzo della colonia sezionato in una piastra a 48 pozzetti per l'espansione. Trasferire l'altra 2/3 della colonia sezionato in una piastra a 96 pozzetti contenenti corrispondente completati supporti CM-MEF.
  5. Mantenere entrambe le piastre cambiando media giornaliera (integrato multimediale CM-MEF per Matrigel piastre rivestite da 96 pozzetti e hESC supporti per le piastre 48 pozzetti contenenti MEF, entrambi integrati con 0,5 mg / ml puromicina).
  6. Espandere fino piastre a 96 pozzetti sono al 100% confluenti e quindi inizialmente schermo tramite PCR.

5. Screening ed espansione di cloni positivi

  1. Per preparare il DNA genomico (metodo basato su 11) Rimuovere qualsiasi supporto dalle lastre invertendo, quindi asciugare su carta assorbente.
  2. Lavare ogni pozzetto due volte con PBS RT (100 l / pozzetto ogni lavaggio), invertito e macchia come per il passo 5.1. Posizionare le piastre a -80 ° C fo 1 - 2 ore per aiutare a lisi cellulare (piastre possono essere conservate a tempo indeterminato come questo).
  3. Mentre le cellule sono a -80 ° C fare sarcosyl Lysis Buffer (vedi tabella 4) (50 ml / pozzetto). Per lisare cellule, piatti caldi per 5 minuti a temperatura ambiente poi tampone di lisi pipetta in ciascun pozzetto. Sigillare i bordi di ogni piatto con del nastro, posto in un contenitore sigillabile contenente tovaglioli di carta umidi per creare l'umidità, e incubare O / N a 60 ° C.
  4. Dopo l'incubazione aggiungere 150 ml di NaCl 5M a 10 ml di -20 ° C etanolo assoluto, mescolare bene e aggiungere 100 ml a ciascun pozzetto (Nota: etanolo andrà nuvoloso quando viene aggiunto NaCl). Piastre Toccare delicatamente per mescolare (non pipetta) e lasciare per un minimo di 30 minuti a temperatura ambiente. Durante questo tempo la soluzione andrà chiaro e il DNA viene precipitato.
  5. Rimuovere la soluzione come al punto 5.1 quindi aggiungere 150 ml di etanolo al 70% in ogni pozzetto. Capovolgere piastra delicatamente e asciugare come prima. Ripetere questa operazione un ulteriore 2x.
    Nota: Poiché il DNA precipitato naturalmente aderes per la plastica coltura di tessuti non diventa sloggiato durante queste fasi di lavaggio.)
  6. Dopo l'ultimo lavaggio piatti brevemente centrifugare alla massima velocità per concentrare il DNA al fondo di ciascun pozzetto poi asciugare a temperatura ambiente (o 37 ° C) per almeno 30 min.
  7. Aggiungere 40 - 50 ml T0.1E (pH8.0) (vedi tabella 5) o TE (pH8.0) ad ogni pozzetto e posizionare le piastre a 65 ° C per 1 ora o al 4 ° CO / N prima di utilizzare per la PCR. Risospendere il DNA toccando delicatamente i lati della piastra. Utilizzare 1-2 ml di ri-sospensione DNA / 10 microlitri reazione PCR.
  8. Utilizzando il Expand lunga Template PCR con hPITX3 L braccio gen. F e hPITX3 L primer braccio GFP R eseguono lo screening iniziale di cloni a 58 ° C ricottura, 45 sec estensione, 35 cicli.
  9. Campioni elettroforesi con 1kb Hyperladder in un gel di agarosio 1% contenente GelRed a 100 V per 45 minuti e rilevare cloni positivi mediante illuminazione UV.
  10. Convalidare PCR cloni positivi per digestione del DNA genomico da Expacloni nded (vedi sotto) con HindIII e ibridazione sonde 5 'e 3' dei bracci vettore omologia con un Southern blot (come descritto in precedenza al punto 1). Le sonde sono generati mediante PCR utilizzando coppie di primer hPITX3 5 'della sonda F e R, e hPITX3 3' della sonda F e R, digerito con EcoRI e ligato in un vettore generale clonazione.
  11. A seconda del numero di cloni positivi, preparare due pozzetti di una piastra da 6 pozzetti pre-placcatura con MEF (2,0 x 10 4 cellule per cm 2).
  12. Il giorno successivo pretrattare cloni positivi nella piastra a 48 pozzetti con 10 mM Y-27632 per un minimo di 1 ora.
  13. Lavare cloni positivi con HBSS e aggiungere 300 ml di Accutase.
  14. Quando le colonie sono resi singole cellule, aggiungere 1 ml di media hESC e raccogliere in una provetta da 15 ml.
  15. Modificare i media giornaliera. Il giorno 2, Y-27632 può essere ritirato e le cellule coltivate in hESC media.
  16. Quando le colonie sono il 70 - 80% confluenti, sottocultura e congelare il resto della coloframmenti di NY.

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Risultati

A seguito di co-elettroporazione della PITX3 coppia zinc-finger personalizzato progettato insieme al PITX3 - EGFP DNA -specifica donatore vettore, e la successiva selezione puromicina, hESC cloni positivi sono stati inizialmente rilevati tramite lo screening genomico PCR (Figura 1). Southern blot ibridazione di questi cloni positivi PCR con 5 'e 3' sonde specifiche confermato corretto il targeting to esone 1 del locus PITX3 (Figura 2), con un rendimen...

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Discussione

La generazione di linee cellulari giornalista offre un potente mezzo per monitorare, visualizzare e isolare le cellule di interesse da una popolazione eterogenea derivato da hESC. Tuttavia, gene targeting via convenzionale ricombinazione omologa ha dimostrato di essere estremamente inefficiente per CES umani 3. In questo protocollo si descrive una tecnica relativamente semplice per l'introduzione di una RP in esone uno dei locus PITX3, in hESC utilizzando un vettore targeting ampiamente disponibi...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Il lavoro descritto in questo protocollo è stato reso possibile da un finanziamento da parte del governo vittoriana come parte di un'alleanza di collaborazione con l'Istituto californiano per la medicina rigenerativa (CIRM).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fibroblasti embrionali di topo (DR4)GlobalStemGSC-6004G
GelatinaSigmaG1393-100ML
HBSS, senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo (HBSS)Life Technologies14175-095
DispaseStemCell Technologies7923
Raschietto cellulareCorning3008
AccutaseLife TechnologiesA11105-01
Y27632Axon MedchemAxon 1683
Filtro cellulare - 40 μ mBD Biosciences352340
33 mm - 0,22 μ m filtroMilliporeSLGP033RS
rhFGF2R& D Systems233-FB-025/CF
ElettroporatoreBioRad165-2661
Cuvetta per elettroporazione da 0,4 cmBioRad165-2088
Costrutto di puntamento in avanti TV-hPITX3 umanoAddgene31942
ZFN Kit; Human PITX3Sigma-AldrichCKOZFN1050-1KT
PuromicinaInvivoGenant-pr-1
MatrigelBD Biosciences354277
GeltrexLife TechnologiesA1569601
NaClSigma-AldrichS3014
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies10566-016
Siero fetale bovino, qualificato, inattivato dal calore, origine statunitense (FBS)Life Technologies16140-071
Pen/StrepLife Technologies15070-063
Miscela di terreno/nutrienti Dulbecco's Modified Eagle F-12 (DMEM/F12)Life Technologies11320-033
Sostituzione del siero KnockOut (KSR)Life Technologies10828-028
Aminoacidi non essenziali MEM  (NEAA)Life Technologies11140-050
GlutaMAXLife Technologies35050-061
ß-mercaptoetanoloTechnologies21985-023
Soluzione di sale sodico N-Lauroilsarcosina (Sarcosyl) (30%)Sigma-Aldrich61747
EDTASigma-AldrichE9884
Trizma CloridratoSigma-AldrichT3253
Soluzione di proteinasi K (20 mg/ml)Bioline AustraliaBIO-37084
Espandi il sistema PCR a modello lungoRoche Australia11681834001
hPITX3 L braccio gen. F (primer): 5' TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3'GeneWorks, Australia
hPITX3 L braccio GFP R (primer): 5' ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3'GeneWorks, Australia
HyperLadder 1 kb Bioline AustraliaBIO-33025
GelRedJomar Bioscience, Australia41003
Life

Riferimenti

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