3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un'applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

Summary

In questo protocollo video tracciamo - ad alta velocità e in tre dimensioni - lisosomi marcati in fluorescenza all'interno di cellule viventi, utilizzando il metodo di tracciamento orbitale in un microscopio a due fotoni modificato.

Abstract

L'obiettivo di questo protocollo video è quello di discutere come eseguire e analizzare un esperimento tridimensionale fluorescente orbitale particle tracking utilizzando una versione modificata del microscopio a due fotoni ^1. A differenza di approcci convenzionali (scansione raster o largo campo basato su una pila di frame), il tracciamento orbitale 3D permette di localizzare e seguire con un spaziale elevata (10 precisione nm) e risoluzione temporale (risposta in frequenza 50 Hz) lo spostamento 3D di una particella fluorescente passare lunghezza-scale di centinaia di micron ^2. Il metodo si basa su un algoritmo di feedback che controlla l'hardware di un microscopio a scansione laser a due fotoni per eseguire un'orbita circolare intorno all'oggetto da tracciare: il meccanismo di feedback manterrà dell'oggetto fluorescente al centro da comandare lo spostamento dei il raggio di scansione ^3-5. Per dimostrare i vantaggi di questa tecnica, abbiamo seguito un organello in rapido movimento, il lisosoma, dentro alcellule iving ^6,7. Le cellule sono state piastrate secondo protocolli standard, e colorate con un colorante commercialmente lisosoma. Discutiamo brevemente la configurazione hardware e più in dettaglio il software di controllo, effettuare un esperimento di tracciamento orbitale 3D all'interno delle cellule viventi. Si parlerà in dettaglio i parametri richiesti per controllare il microscopio a scansione e consentire il movimento del fascio in un'orbita chiusa attorno alla particella. Concludiamo dimostrando come questo metodo può essere efficacemente utilizzato per tracciare il movimento veloce di un lisosoma marcato lungo i microtubuli in 3D all'interno di una cella dal vivo. Lisosomi possono muoversi con velocità nell'intervallo 0,4-0,5 micron / sec, tipicamente visualizzando un moto diretto lungo la rete microtubuli ^8.

Introduction

Un gran numero di approcci sono stati sviluppati fino ad oggi per monitorare le particelle fluorescenti in tre dimensioni utilizzando un microscopio. La maggior parte approcci si basano sull'impiego di telecamere veloci, ideale per monitorare in due dimensioni, di solito in combinazione con modifiche personalizzate dell'ottica emissione del microscopio per ottenere inseguimento in direzione assiale. Microscopi a scansione laser confocale (uno o due fotoni) convenzionalmente in grado di monitorare una particella fluorescente eseguendo una sequenza temporale di z-stack, anche se questo processo è in genere richiede tempo, e produce la risoluzione di tempo ragionevole (10 Hz) solo se la particella monitorata è conservato nel centro di una piccola regione di imaging raster da un meccanismo di feedback attivo ^2.

L'idea di bloccaggio-in per la particella è alla base del metodo di monitoraggio orbitale. Invece di un raster scan un'orbita circolare viene eseguita intorno alla particella fluorescente. L'intensità della fluorescenza lungol'orbita localizza con precisione la posizione delle particelle ^4.

La posizione localizzato della particella può quindi essere utilizzato per azionare gli scanner microscopio e ri-centro orbita sulla posizione delle particelle. Gli scanner galvanometro del microscopio sono guidate da una tensione analogica. La componente alternata della tensione permette di eseguire un'orbita con il fascio laser focalizzato, cioè un sinusoidale e un'onda coseno applicata agli specchi X e Y scansione consentirà di eseguire un'orbita circolare. Il DC offset del segnale facilita la modifica della posizione del centro orbita. Dopo un periodo di orbita è determinata e la forma d'onda per il segnale AC è configurato, il sistema di retroazione deve aggiornare solo la componente continua del segnale.

Un software in grado di leggere il segnale fluorescente raccolti dai rivelatori è necessario per controllare gli scanner e rivelatori, per calcolare la posizione della particella e aggiornare il DC offset. Per una valutazione di successo di imaging un'accurata scelta dei parametri orbitali (dimensioni e della tempistica) è necessario e questi parametri devono essere regolati in base alle caratteristiche delle particelle fluorescenti che è necessario tenere traccia.

I fondamenti fisici e matematici della tecnica sono stati descritti in passato ^4,5 per entrambe le applicazioni 2D e 3D. In questo protocollo si illustrano brevemente le principali componenti hardware del setup, e più in dettaglio la scelta dei parametri e la preparazione del campione richiesto per un tipico esperimento che ci permette in seguito lo spostamento di un lisosoma con una risoluzione temporale elevata all'interno di una cellula vivente.

Protocol

Preparazione del campione 1

1. Mantenere le cellule CHOK1 in tessuto fiasche di coltura utilizzando DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino e 100 UI / ml di penicillina 50 mg / ml di streptomicina. Incubare le cellule in un 5% di CO ₂ incubatore umidificato a 37 ° C.
2. Raccolta e poi plate cellule CHOK1 su un diametro di micro-pozzetto 14 mm e uno spessore superficie di 0,16 mm. Cellule seme per densità ottimale per l'imaging, intorno al 60-70% di confluenza.
3. Incubare le cellule per una notte a 37 ° C, 5% di CO _2. Lavare le cellule tre volte in HBSS (Hank Buffered Saline Solution), e incubare le cellule in una soluzione contenente 50 nM di Lysotracker DND26 verde e 150 Nm di tubulina inseguitore verde. Incubare le cellule per 1 ora a 37 ° C. Passaggio facoltativo: Prima di incubazione, eseguire una macchia supplementare con un colorante colorazione matrice mitocondriale (25 Nm).
4. Lavare le cellule tre volte in HBSS per rimuovere il colorante non legato. Aggiungere fresco terreno di coltura DMEM prima imagzione le cellule.

2. Configurazioni Microscopio

Il microscopio per il tracciamento di particelle descritto nel protocollo video viene montato sul telaio di un microscopio invertito disponibile in commercio (Figura 4). Tuttavia moduli commerciali per 3D tracciamento di particelle orbitali sono ora disponibili.

1. Utilizzare un coerente Chameleon-Ultra II Ti: Sa a femtosecondi sorgente di luce di eccitazione laser, con una gamma di lunghezze d'onda di uscita regolabile tra 690 nm-1.040 nm.
2. Assicurarsi che il raggio laser è allineato nella porta posteriore del microscopio utilizzando specchi IR-rivestito. Il raggio laser viene attenuato mediante una piastra semionda rotante seguito da un polarizzatore lineare calcite. Attenuazione del fascio in modo che la potenza media al campione è compreso tra 0,5 e 2 mW.
   NOTA: Il raggio laser viene riflesso da una coppia di specchi a comando galvanometro motori che consentono il controllo della posizione e traiettoria del fascio focalizzato nel piano campione. Inconfigurazione tipica del fascio laser collimato uscire degli specchi galvanometro viene espanso (10X), che passa attraverso un espansore del fascio, prima di entrare nel retro dell'obiettivo microscopio dopo la riflessione nel passo corto specchio dicroico.
3. Raccogliere la luce di fluorescenza dal campione ponendo un obiettivo numerico ad elevata dell'acqua di apertura (60X, NA 1.2) nel percorso ottico. Scegli un cubo filtro di fluorescenza in funzione delle lunghezze d'onda di emissione desiderati in configurazione sia uno o due canali. Impiegare filtri passa-banda di emissione per selezionare ulteriormente la gamma spettrale della fluorescenza emessa.
4. Porre il campione su un palco motorizzato, e regolare la multa movimento dell'obiettivo del microscopio con un piezo-controllore obiettivo.
5. Dirigere la luce dal cubo del filtro in tubi fotomoltiplicatori dove il segnale viene discriminati e inviato a una scheda di acquisizione dati I / O digitale.
   Generato dal computer forme d'onda sono l'uscita analogica della scheda I / O e sono provid: NOTAed agli scanner di controllo elettronica. L'ingresso di conteggio di fotoni dai fotomoltiplicatori e il segnale di uscita per gli scanner sono misurati e controllati tramite la scheda I / O dal Laboratorio per il software Fluorescence Dynamics SimFCS.

3. Imaging

1. Posizionare le cellule sul palco e mettere a fuoco utilizzando l'illuminazione a luce trasmessa.
2. Passa alla scansione di immagini raster per identificare le cellule che hanno incorporato il colorante e di visualizzare i microtubuli sottostanti. Identificare l'area iniziale in cui il movimento delle vescicole è presente.
3. Una volta che una vescicola isolato è identificato, impostare i seguenti parametri per l'inseguimento orbitale:
   1. Selezionare il raggio dell'orbita per definire le dimensioni della scansione circolare secondo la dimensione della particella monitorata. Per un emettitore punto, impostare il raggio dell'orbita pari alla vita della Point Spread Function (PSF) del fascio di eccitazione al massimo la sensibilità e la risposta.
   2. Impostare il assialedistanza per definire la distanza tra le due orbite che vengono eseguite per localizzare la posizione della particella lungo la direzione assiale. Impostare la distanza assiale a 1,5-3 volte la vita PSF.
   3. Definire il tempo di sosta in base alla luminosità della particella per impostare il tempo speso su ogni punto dell'orbita, che determinerà anche il tasso-photo sbiancamento. Utilizzare un tempo di sosta tra 10-100 msec.
   4. Impostare il numero di punti in ciascuna orbita di 64 o 128 per produrre periodi orbita nell'ordine di 4-32 msec e fornire un'elevata risoluzione temporale per la determinazione della posizione della particella.
4. Modificare il segnale di offset DC inviata agli specchi in modo da centrare il fascio sulla particella attraverso l'interfaccia utente grafica mediante un cursore di selezione nell'immagine raster-digitalizzata.
5. Inizia il monitoraggio commutando la modalità microscopio da raster-imaging per la scansione orbitale.
6. Attivare la raccolta di feedback e dati.

4. TrajectAnalisi ory

1. Utilizzare il software per visualizzare la fluorescenza raccolte in ogni punto lungo l'orbita e ad ogni tempo sotto forma di un 'tappeto intensità'. L'intensità raccolto lungo il tappeto fornisce informazioni sulle interazioni della particella con altri oggetti luminosi. Utilizzare il software per visualizzare sia le informazioni traiettoria (cioè lo spostamento CC nel tempo di x, y scanner e del -piezo z) e l'intensità di fluorescenza raccolti dal tubo fotomoltiplicatore nel tempo sotto forma di serie temporali.
2. Utilizzare la rappresentazione delle serie storiche e le informazioni 'tappeto' intensità 'di scegliere solo una regione di interesse nella traiettoria.
3. Utilizzare il software per visualizzare una proiezione 2D della porzione selezionata della traiettoria della particella. Selezionare i controlli appropriati per codice colore traiettoria secondo l'intensità di fluorescenza delle particelle.
4. Selezionare l'opzione per visualizzare la particolo traiettoria in 3D, e codice-colore che secondo l'intensità di fluorescenza. Ruotare la traiettoria in 3D utilizzando i comandi per visualizzare le caratteristiche del moto lisosomi lungo il microtubulo.

Results

Secondo questo protocollo veloce inseguimento singola particella 3D può essere eseguita all'interno di cellule viventi utilizzando un microscopio a due fotoni modificato per monitorare lo spostamento dei lisosomi fluorescente. L'esperimento eseguito consiste di tracciare un lisosoma isolato muoversi all'interno della cella dopo il processo di maturazione endosome ^9. I lisosomi sono stati colorati con un colorante verde fluorescente ed eccitato a 930 nm che sfruttano 2-fotone di eccitazione. I nostri dati dimo...

Discussion

Nonostante gli enormi progressi delle tecniche di microscopia a fluorescenza e strumentazioni nel corso degli ultimi anni, raggiungendo traiettorie delle particelle fluorescenti in tre dimensioni con una elevata risoluzione temporale è rimasta una sfida nel campo. Se alta risoluzione temporale è stato raggiunto particelle di inseguimento in due dimensioni, estensione alla direzione assiale comporta tipicamente una drastica riduzione della risposta in frequenza del sistema ^10.

In q...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysotracker DND 26	Life Technologies	L-7526
Localizzatore di tubulina Green	Life Technologies	T34075
Mitotracker RED	Life Technologies	M7512
Coherent Chamelon- ultra II TI	Coherent
Glan Taylor Polarizzatore di calcite	Melles Griot	03PTA001
Galvanometro-motore specchio	Cambridge Technologies	M 6350
Specchio dicroico	Chroma Technologies	700 DCSPXR
Stadio motorizzato	ASI	MS2000
Piezoelettrico	PI	P721-LLQ
Tubo fotomoltiplicatore	Hamamatsu	H7422P-40
Scheda di acquisizione dati	IO tech	PCI 1128-4000
Software di imaging	LFD	Global per immagini-SimFCS