In questo protocollo video tracciamo - ad alta velocità e in tre dimensioni - lisosomi marcati in fluorescenza all'interno di cellule viventi, utilizzando il metodo di tracciamento orbitale in un microscopio a due fotoni modificato.
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Articolo metodologico
3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un'applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obiettivo di questo protocollo video è quello di discutere come eseguire e analizzare un esperimento tridimensionale fluorescente orbitale particle tracking utilizzando una versione modificata del microscopio a due fotoni 1. A differenza di approcci convenzionali (scansione raster o largo campo basato su una pila di frame), il tracciamento orbitale 3D permette di localizzare e seguire con un spaziale elevata (10 precisione nm) e risoluzione temporale (risposta in frequenza 50 Hz) lo spostamento 3D di una particella fluorescente passare lunghezza-scale di centinaia di micron 2. Il metodo si basa su un algoritmo di feedback che controlla l'hardware di un microscopio a scansione laser a due fotoni per eseguire un'orbita circolare intorno all'oggetto da tracciare: il meccanismo di feedback manterrà dell'oggetto fluorescente al centro da comandare lo spostamento dei il raggio di scansione 3-5. Per dimostrare i vantaggi di questa tecnica, abbiamo seguito un organello in rapido movimento, il lisosoma, dentro alcellule iving 6,7. Le cellule sono state piastrate secondo protocolli standard, e colorate con un colorante commercialmente lisosoma. Discutiamo brevemente la configurazione hardware e più in dettaglio il software di controllo, effettuare un esperimento di tracciamento orbitale 3D all'interno delle cellule viventi. Si parlerà in dettaglio i parametri richiesti per controllare il microscopio a scansione e consentire il movimento del fascio in un'orbita chiusa attorno alla particella. Concludiamo dimostrando come questo metodo può essere efficacemente utilizzato per tracciare il movimento veloce di un lisosoma marcato lungo i microtubuli in 3D all'interno di una cella dal vivo. Lisosomi possono muoversi con velocità nell'intervallo 0,4-0,5 micron / sec, tipicamente visualizzando un moto diretto lungo la rete microtubuli 8.
Introduzione
Un gran numero di approcci sono stati sviluppati fino ad oggi per monitorare le particelle fluorescenti in tre dimensioni utilizzando un microscopio. La maggior parte approcci si basano sull'impiego di telecamere veloci, ideale per monitorare in due dimensioni, di solito in combinazione con modifiche personalizzate dell'ottica emissione del microscopio per ottenere inseguimento in direzione assiale. Microscopi a scansione laser confocale (uno o due fotoni) convenzionalmente in grado di monitorare una particella fluorescente eseguendo una sequenza temporale di z-stack, anche se questo processo è in genere richiede tempo, e produce la risoluzione di tempo ragio....
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Protocollo
Preparazione del campione 1
- Mantenere le cellule CHOK1 in tessuto fiasche di coltura utilizzando DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino e 100 UI / ml di penicillina 50 mg / ml di streptomicina. Incubare le cellule in un 5% di CO 2 incubatore umidificato a 37 ° C.
- Raccolta e poi plate cellule CHOK1 su un diametro di micro-pozzetto 14 mm e uno spessore superficie di 0,16 mm. Cellule seme per densità ottimale per l'imaging, intorno al 60-70% di confluenza.
- Incubare le cellule per una notte a 37 ° C, 5% di CO 2. Lavare le cellule tre volte in HBSS (Hank Buffered Saline Solution), e incubare le cellule in....
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Risultati
Secondo questo protocollo veloce inseguimento singola particella 3D può essere eseguita all'interno di cellule viventi utilizzando un microscopio a due fotoni modificato per monitorare lo spostamento dei lisosomi fluorescente. L'esperimento eseguito consiste di tracciare un lisosoma isolato muoversi all'interno della cella dopo il processo di maturazione endosome 9. I lisosomi sono stati colorati con un colorante verde fluorescente ed eccitato a 930 nm che sfruttano 2-fotone di eccitazione. I nostri dati dimo.......
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Discussione
Nonostante gli enormi progressi delle tecniche di microscopia a fluorescenza e strumentazioni nel corso degli ultimi anni, raggiungendo traiettorie delle particelle fluorescenti in tre dimensioni con una elevata risoluzione temporale è rimasta una sfida nel campo. Se alta risoluzione temporale è stato raggiunto particelle di inseguimento in due dimensioni, estensione alla direzione assiale comporta tipicamente una drastica riduzione della risposta in frequenza del sistema 10.
In q.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo progetto è stato supportato da sovvenzioni NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 e P50-GM076516
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Lysotracker DND 26 | Life Technologies | L-7526 | |
| Localizzatore di tubulina Green | Life Technologies | T34075 | |
| Mitotracker RED | Life Technologies | M7512 | |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | ||
| Glan Taylor Polarizzatore di calcite | Melles Griot | 03PTA001 | |
| Galvanometro-motore specchio | Cambridge Technologies | M 6350 | |
| Specchio dicroico | Chroma Technologies | 700 DCSPXR | |
| Stadio motorizzato | ASI | MS2000 | |
| Piezoelettrico | PI | P721-LLQ | |
| Tubo fotomoltiplicatore | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| Scheda di acquisizione dati | IO tech | PCI 1128-4000 | |
| Software di imaging | LFD | Global per immagini-SimFCS |
Riferimenti
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two photon excitation fluorescence microscopy. Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).
- Dupont, A., Lamb, D. C. Nanoscale three dimensional single particle tracking. Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).
- Estrada, L. C., Gratton, ....
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Ristampe e permessi
