Questo articolo descrive microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo come una tecnica di trasfezione per le cellule testicolari di topo per studiare processi unici di spermatogenesi. Il protocollo presentato prevede fasi di preparazione capillare di vetro, microiniezione attraverso il dotto efferente, e trasfezione mediante elettroporazione.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
In Vivo Microiniezione e Elettroporazione di mouse Testicolo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo contributo video e articolo fornisce una descrizione completa di microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo. Questa particolare tecnica di trasfezione di cellule testicolari del mouse permette lo studio di processi unici in spermatogenesi.
Il seguente protocollo si concentra sulla trasfezione delle cellule testicolari del mouse con costrutti plasmidici. In particolare, abbiamo utilizzato il vettore giornalista pEGFP-C1, che esprime la proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) e anche il vettore pDsRed2-N1 che esprimono la proteina fluorescente rossa (DsRed2). Entrambi i geni reporter codificati erano sotto il controllo del promotore del citomegalovirus umano immediato-precoce (CMV).
Per eseguire il trasferimento genico in testicoli di topo, i costrutti reporter di plasmide vengono iniettate in testicoli di topi viventi. A tal fine, il testicolo di un animale anestetizzato è esposto e il sito di microiniezione è preparato. Il nostro posto preferito diiniezione è il condotto efferente, con la rete testis in ultima analisi, collegato come via di trasporto anatomica degli spermatozoi tra il testicolo e dell'epididimo. In questo modo, il riempimento dei tubuli seminiferi dopo microiniezione è ottimamente gestito e controllato grazie all'utilizzo di soluzioni di DNA macchiati. Dopo aver osservato un ripieno sufficiente del testicolo dalla sua struttura tubulo colorata, l'organo è elettroporata. Questo consente il trasferimento della soluzione di DNA in cellule testicolari. Dopo 3 giorni di incubazione, il testicolo viene rimosso ed esaminato al microscopio per fluorescenza verde o rosso, illustrando il successo trasfezione.
Generalmente, questo protocollo può essere impiegato per la consegna DNA o RNA-costruisce in soggiorno topo testicolo per (sopra) esprimere o abbattere i geni, facilitando l'analisi della funzione genica in vivo. Inoltre, è adatto per studiare costrutti reporter o putativo regula geneElementi Tory. Così, i principali vantaggi della tecnica di elettroporazione sono prestazioni veloci in combinazione con il minimo sforzo, così come le attrezzature tecniche moderato e le competenze necessarie rispetto alle tecniche alternative.
Introduzione
Spermatogenesi dei mammiferi è considerato un sofisticato processo di cellule staminali di auto-rinnovamento successivamente sottoposti a mitosi, meiosi e la differenziazione al fine di sviluppare in maturo spermatozoi aploidi. Questi cambiamenti morfologici sono orchestrati da diversi tipi di cellule e nonostante i profondi tentativi, è ancora impossibile imitare questi processi in coltura cellulare 1,2. Quindi, la ricerca sulla spermatogenesi fino ad ora si affida a organismi viventi come modelli in vivo. In generale, gli studi di funzione genica si basano generalmente su animali transgenici. Tuttavia, generare e sostenere questo tipo di modello....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali effettuati sono stati approvati dal comitato etico locale (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Germania).
1 plasmidi Preparazione
- Per la preparazione plasmide, utilizzare i kit di purificazione del plasmide (vedi tabella materiali) o metodi simili con buffer di rimozione di endotossine in modo che le reazioni immunitarie dell'animale possono essere evitati. Seguire le istruzioni del manuale. Impiegare DDH 2 O per diluire la soluzione plasmide.
- Eliminare i detriti facendo girare la soluzione di DNA alla massima ve....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
L'impostazione sperimentale per l'esecuzione di microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo in quanto è utilizzato in base al protocollo è illustrato in Figura 1. Anche se è possibile acquisire micropipette industrialmente, abbiamo preferito di generare le nostre pipette tirando (Figura 1A ) e smussatura (Figura 1B) capillari di vetro in modo che essi montati nostre esigenze. L'attrezzatura per microiniezione ed elettroporazione è illustrato ne.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La ricerca nel campo della biologia riproduttiva, in particolare nel settore della fertilità maschile e la spermatogenesi inevitabilmente si basa su organismi viventi. Al fine di esaminare la funzione testicolare, no / sistema di coltura cellulare adeguata in vitro è stata stabilita in grado di riflettere tutti i cambiamenti morfologici cruciali da un spermatogonio diploide ad aploide un maturo 1,2 spermatozoo. Così, la generazione di animali geneticamente modificati è spesso necessa.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Marten Michaelis, Alexander Sobczak, e Joachim M. Weitzel impiegati presso l'Istituto di Biologia della Riproduzione, Leibniz Institute for Biologia Animal Farm (FBN), Dummerstorf, Germania, dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Ringraziamo Birgit Westernstroeer del Centro di Medicina della Riproduzione e Andrologia presso l'Università di Muenster per l'insegnamento della microiniezione testicolare. Inoltre, siamo grati a Ursula Antkewitz e Petra Reckling per l'assistenza tecnica. Ringraziamo la Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) per sostenere questo lavoro (WE2458 / 10-1).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Centrifuga | Sigma | 1-15 PK | |
| Spettrofotometro | Nanodrop | ND-1000 | |
| Estrattore per micropipette | Narishige | PC-10 | Estrattore capillare verticale |
| Capillari per microiniezione | Clark | GC100-10 | a parete standard in borosilicato |
| Bachofer | Typ 462 | smussatrice | |
| Elettroporatore | Nepagene | CUY 21EDIT | elettroporatore a onda quadra |
| Elettrodi pinzetta | Nepagene | CUY 650P5 | 5 mm Ø elettrodi a disco |
| Stereomicroscopio | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Sorgente di luce fredda | Zeiss | KL 1500LCD | |
| Pompa per microiniezione | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipolatore | fatto in casa | Tavolo a croce XYZ | |
| Strumenti chirurgici | FST | forbici, pinze, portaaghi | |
| Pinze fini | FST | Dumont #5, #7 | preparazione dei dotti efferenti |
| clip applicazione cucitrice | FST | Michel, 12029-12 | |
| Clip di sutura Michel | FST | Michel, 12040-01 | 7,5 x 1,75 mm |
| Sutura chirurgica | Catgut, Markneukirchen, Germania | Siringa Catgut 00 | |
| con ago da 30 G | B. Braun | Omnican 40 | per caricare la micropipetta e per l'anestesia |
| Kit di isolamento plasmidico | Promega | Cat. # A2495 | plasmide Midiprep |
| Plasmide pEGFP-C1 | Clontech Cat. #6084-1 | promotore CMV + plasmide EGFP | |
| pDsRed2-N1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + DsRed2 |
| Fast Green dye | Sigma | F7258-25G | per diluizione in ddH2O |
| 10% Ketamine | Serum Werk, Bernburg, Germania | Miscela di urotamina | in un tasso 1:1 con xilazina |
| 2% Siero di xilazina | Werk, Bernburg, Germania | Miscela di xilazina | in un tasso 1:1 con ketamina |
| Sterilium | Bode Chemie | Unguento | per disinfezione |
| S& K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, | unguento oftalmico Augensalbe per prevenire la secchezza oculare | |
| To-Pro-3 ioduro | Invitrogen | T3605 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | |||
| 1.37 M NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ibuprofene, Dolormin | Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany | 01094902 | soluzione analgesica pediatrica (FANS) per alleviare il dolore postoperatorio |
| 27 mM KCl | Carl Roth | 6781.1 | |
| 100 mM Na2HPO4· 2H2O | Carl Roth | T106.2 | |
| 18 mM KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 |
Riferimenti
- Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. Fact or fiction: In vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).
- Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R. Models of in vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 32-43 (2012).
- Zizzi, A., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
