Articolo metodologico

Isolamento di cellule murine Linfonodo stromali

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DOI:

10.3791/51803

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19 agosto 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, Immunoregulation, University of Basel and University Hospital Basel

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'isolamento delle cellule stromali dei linfonodi è una procedura a più fasi che include la digestione enzimatica e la disaggregazione meccanica per ottenere cellule reticolari fibroblastiche, cellule linfatiche ed endoteliali del sangue. Nella procedura descritta, una breve digestione è combinata con la disaggregazione meccanica automatizzata per ridurre al minimo la degradazione del marcatore di superficie delle cellule stromali linfonodali vitali.

Abstract

Gli organi linfoidi secondari, compresi i linfonodi, sono composti da cellule stromali che forniscono un ambiente strutturale per l'omeostasi, l'attivazione e la differenziazione dei linfociti. Vari sottogruppi di cellule stromali sono stati identificati dall'espressione della molecola di adesione CD31 e della glicoproteina podoplanina (gp38), cellule reticolari della zona T o cellule reticolari fibroblastiche, cellule endoteliali linfatiche, cellule endoteliali del sangue e periciti FRC-simili all'interno della popolazione cellulare doppia negativa. Per tutte le popolazioni sono descritte diverse funzioni, tra cui la separazione e il rivestimento di diversi compartimenti, l'attrazione e l'interazione con diversi tipi di cellule, la filtrazione dei fluidi drenanti e la contrazione dei vasi linfatici. Negli ultimi anni, diversi gruppi hanno descritto un ruolo aggiuntivo delle cellule stromali nell'orchestrare e regolare le risposte citotossiche delle cellule T potenzialmente pericolose per l'ospite.

I linfonodi sono strutture complesse con molti tipi di cellule diverse e quindi richiedono una procedura appropriata per l'isolamento delle popolazioni cellulari desiderate. Attualmente, i protocolli per l'isolamento delle cellule stromali linfonodali si basano sulla digestione enzimatica con tempi di incubazione variabili; Tuttavia, le cellule stromali e le loro molecole di superficie sono sensibili a questi enzimi, il che provoca la perdita dell'espressione del marcatore di superficie e la morte cellulare. Qui viene proposto un breve protocollo di digestione enzimatica combinato con la disgregazione meccanica automatizzata per ottenere una sospensione vitale di singole cellule di cellule stromali linfonodali che mantengono la loro espressione molecolare di superficie.

Introduzione

I linfonodi sono compartimenti specializzati in cui vengono avviate e coordinate risposte immunitarie adattative contro stranieri e di auto-antigeni. La procedura qui presentata descrive una breve digestione enzimatica combinata con pipettaggio meccanico automatizzato per ottenere linfonodo sospensione singola cella e ottenere l'accesso a linfonodali cellule stromali vitali che mantengono l'espressione di superficie di diverse molecole.

Formare cellule stromali linfonodale l'impalcatura del linfonodo e compiere tre funzioni principali: primo filtrano fluidi corporei di assaggiare antigeni, gli agenti patogeni e il loro modello molecolare associata patogeni (PAMP), così come le citochine e pericolo del modello molecolare associato (smorza) presente nel corpo. In secondo luogo, si attraggono e istruiscono le cellule presentanti l'antigene (APC) e linfociti di interagire e di avviare le risposte immunitarie adattative; e terzo, offrono un ambiente strutturale per l'omeostasi e la differenziazione dei linfociti 1-3. Durante le cellule stromali infiammazione dei linfonodi producono fattori di crescita, citochine e chemochine, adattarsi al rigonfiamento in tal modo organizzare l'interazione tra cellule dendritiche (DC), T, e B- cellule. L'orchestrazione delle risposte immunitarie è possibile solo a causa della complessa architettura strutturale formato da diverse popolazioni di cellule stromali.

Cellule stromali linfonodi sono cellule CD45 negativi e si distinguono per l'espressione di CD31 o gp38 in cellule endoteliali e fibroblastiche 1 -6. Gp38 + CD31 - definisce le cellule della zona T reticolari (TRC, noto anche come FRC: cellule reticolari fibroblastiche), gp38 + CD31 + definisce cellule linfatiche endoteliali (LEC), gp38 - CD31 + definisce cellule endoteliali del sangue (BEC). Inoltre, la caratterizzazione delle sottopopolazioni ha rivelato l'esistenza di altre cellule stromali linfonodali. Infatti, una piccola popolazione di cellule periciti-simile è stato caratterizzato nellagp38 - CD31 - la popolazione 7. Pertanto, l'adattamento della procedura di isolamento è vantaggiosa per l'identificazione e la caratterizzazione delle proprietà funzionali di varie cellule stromali linfonodali.

Prima dello sviluppo del linfonodo cellule stromali digestione protocolli di studio delle cellule stromali linfonodali era limitato a osservazioni in situ utilizzando la sezione di tessuto e microscopia. Tuttavia, studi strutturali e funzionali hanno mostrato caratteristiche importanti delle cellule stromali linfonodali. Cellule stromali linfonodi sono associati con podoplanin, collagene e della matrice extracellulare (ECM) proteine ​​per formare un complesso di 3 struttura dimensionale chiamato sistema conduit, che trasporta le proteine ​​linfatiche e massa molecolare associato-basso dal seno subcapsulare di linfonodo all'alta endoteliale venule nella T cellule zona 8. Dendritiche sono in stretto contatto con le cellule dello stroma e può osservare sporge nel con tubolarestruttura duit di campione di fluido e rilevare gli antigeni 8. L'interazione delle cellule stromali linfonodali (TRC e LECs) con DC è mediata dal rilascio e la presentazione delle chemochine CCL21 e CCL19 9,10. CCL19 e CCL21 sono riconosciuti dal recettore CCR7 facilitare dendritiche e le cellule T di migrare al linfonodo zona di cellule T 4,11. Nonostante l'uso di chemochine simili, le cellule DCs e T hanno diverse rotte migratorie verso i linfonodi 12. Successivamente, utilizzando la digestione enzimatica del linfonodo e l'isolamento delle cellule stromali linfonodali puri, studi funzionali sono stati condotti sul ruolo delle diverse cellule dei linfonodi stromali e la loro capacità di interagire con le cellule dendritiche e le cellule T / B 6,13. In primo luogo, il crosstalk tra la produzione di cellule T effettrici IFN-γ e cellule stromali linfonodali induce la produzione del metabolita ossido nitrico dimostrato di smorzare le risposte delle cellule T e la proliferazione negli organi linfoidi secondari 14-16. In secondo luogo, linfa ncellule stromali ODE sono stati riportati per supportare la differenziazione delle sottopopolazioni DC regolamentazione attraverso la produzione di IL-10 17, e di modulare naif omeostasi delle cellule T attraverso la produzione di IL-7 6,18. In terzo luogo, espressione di TLR in cellule stromali linfonodali suggerisce che le cellule stromali sono suscettibili di segnale derivato da una infezione o di auto-molecole rilasciato durante lesioni dei tessuti. Infatti, il trattamento di cellule stromali linfonodali con il ligando di TLR3 poly (I: C) induce una modesta sovraregolazione di grande espressione di istocompatibilità di classe I e sovraregolazione di co-inibitorio molecola PD-L1, ma non di molecole costimolatorie, con conseguente drammatici cambiamenti nel tessuto periferico antigeni espressione 19. Diversi gruppi hanno mostrato cellule stromali linfonodali esprimono antigeni tissutali periferiche e inducono tolleranza delle cellule T autoreattive 19,21-27. Pertanto, la comprensione delle interazioni tra cellule stromali linfonodali e l'altro re migratorio ecellule linfonodali sidente aiuteranno a trovare nuove molecole bersaglio per consentire l'attivazione o la soppressione delle risposte immunitarie durante l'infiammazione. Pertanto, è necessaria l'attuazione della separazione enzimatica pubblicata del linfonodo.

Protocolli precedentemente pubblicati utilizzano diverse combinazioni di base di collagenasi-digestione enzimatica con una bassa sollecitazione meccanica 6,19,20. Tuttavia, lunghe incubazioni con enzimi di digestione o la diversa combinazione di digestione enzimatica potrebbero degradare diverse molecole di superficie necessaria per analizzare lo stato di attivazione e di individuare nuove cellule stromali linfonodali. A seconda del tipo di analisi delle cellule stromali, il protocollo Link o Fletcher protocollo potrebbe essere più adatto. Nella procedura descritta, una digestione enzimatica leggermente più corto è combinato con disaggregazione meccanica automatizzata per ridurre al minimo la superficie marcatore degradazione delle cellule stromali nodo linfa vitale. Questa procedura consente di isolamento altamente riproducibile edistinzione dei linfonodi popolazioni di cellule stromali con bassa variabilità e di oltre il 95% vitalità. Le cellule stromali linfonodi isolati a fresco possono essere utilizzati direttamente per l'espressione marcatore di superficie, analisi delle proteine, e gli studi trascrizionali, nonché creazione di linee di cellule stromali di effettuare saggi funzionali in vitro.

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Protocollo

In questa pubblicazione video e protocollo, sono state effettuate tutte le procedure sugli animali conformemente al protocollo animali approvato dalla Autorità cantonale di Basilea Città, Svizzera.

1 Linfonodi Preparazione e digestione

  1. Acqua preriscaldo in un becher da 37 ° C su un agitatore magnetico con piastra di riscaldamento.
  2. Preparare Base Medio come segue: terreno DMEM (senza piruvato) supplementato con FCS 2%, 1,2 mM CaCl 2 e Pen / Strep (100 unità di penicillina, 100 mg di streptomicina).
  3. Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione prima dell'uso.
  4. Euthanize topi linfonodale donatori per CO 2 asfissia e asettico sezionare i linfonodi. Non sezionare il grasso circostante. NOTA: Questo protocollo è ottimizzato per il nodo periferico-pelle drenante linfatico (inguinale, brachiale, ascellare).
  5. Mettere i linfonodi in una capsula di Petri sterile contenente 2 ml di ghiaccio freddo ambiente basico.
  6. Interrompere il linfonodo capsule utilizzando due aghi 25 G fissi sulla siringa da 1 ml.
  7. Trasferire il tessuto linfonodale interrotto in 5 ml in polipropilene tubo a fondo rotondo contenente 750 ml terreno base integrato con 1 mg / ml di collagenasi IV e 40 mcg / ml I. DNAse
  8. Aggiungere un agitatore magnetico sterile in ciascuna provetta.
  9. Inserire il tubo nel bicchiere con 37 ° C preriscaldato acqua e mescolare i tubi a bassa velocità (1 round / sec) per 30 min.
  10. Rimuovere il tubo dalla agitatore magnetico con piastra di riscaldamento e lasciare frammenti linfonodali stabilirsi.
  11. Rimuovere con cautela il surnatante arricchito in "cella non stromali". NOTA: Se l'analisi di T, B, cellule dendritiche e CD45 - gp38 - CD31 - è previsto, salva la frazione "cellule non-stromali".
  12. Lavare restante tessuto linfonodale una volta con 750 microlitri di media di base. NOTA: Questo passaggio è necessario solo se si lavora con i topi immuno-competenti.
  13. Lasciate frammenti linfonodali stabilirsi.
  14. Rimuovere ilfrazione di cellule-floating non-stromale.
  15. Aggiungi ai frammenti linfonodali 750 microlitri terreno base integrata con 3,5 mg / ml Collagenase D e 40 mcg / ml DNasi I.
  16. Collocare il tubo indietro nel bicchiere contenente la 37 ° C preriscaldato acqua.
  17. Digest nodo tessuto linfatico per 5 minuti mentre lentamente mescolando.
  18. Disaggregare linfatici frammenti di tessuto nodo di pipettaggio e mescolando 700 ml per 10 cicli a velocità massima utilizzando una pipetta multicanale automatizzata. NOTA: Questo sconvolge nodo tessuto linfatico per migliorare la digestione.
  19. Posizionare il tubo di nuovo nel bicchiere con 37 ° C acqua preriscaldata.
  20. Digest frammenti di tessuto linfonodale per altri 10 min, mescolando lentamente.
  21. Disaggregare linfatici frammenti di tessuto nodo pipettando e miscelazione per 99 cicli a velocità massima utilizzando una pipetta multicanale automatizzata.
  22. Aggiungere 7,5 ml di 0,5 M EDTA per assicurare il mantenimento della sospensione singola cellula.
  23. Frammenti di tessuto linfonodale disaggregare per tubotting e miscelazione per 99 cicli a velocità massima utilizzando una pipetta multicanale automatizzata.
  24. Aggiungere 750 microlitri di media di base e passare le cellule attraverso una maglia di nylon di 70 micron.
  25. Sospensione cellulare Centrifugare 5 min a 1.500 xg, a 4 ° C.
  26. Cellule stromali possono ora essere utilizzati per ulteriori analisi.

2. colorazione di cellule stromali Linfonodo

  1. Utilizzare una combinazione di anti-CD45, anti-podoplanin (gp38), anticorpi anti-CD31 per riconoscere con successo le cellule TRC, LEC, BEC e DN.
  2. Incubare il tessuto linfonodale digerito con Live / inseguitore Morto, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-gp38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200) in 100 microlitri HBSS contenente 2 % FCS per almeno 20 min, 4 ° C, al buio.
  3. Lavare le cellule aggiungendo 500 l di HBSS contenente 2% FCS
  4. Sospensione cellulare Centrifugare 3 min a 1500 xg, a 4 ° C.
  5. Risospendere in 100 ml di HBSS contenente 2% FCS.
  6. Eseguire le cellule colorate in un citofluorimetro equipped con le seguenti ottiche: fonte di eccitazione fino a tre laser: blu (488 nm, raffreddato ad aria, 20 mW a stato solido), rosso (633 nm, 17 mW HeNe), e viola (405 nm, 30 mW a stato solido) .
  7. Porta CD45 - cellule di escludere le cellule ematopoietiche.
  8. Canottiere Cancello (FSC-W) e le cellule vive (live / inseguitore DEAD) per escludere doppietti e cellule morte.
  9. Trama gp38 vs CD31 per visualizzare TRC (gp38 + CD31 -), LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) cellule (vedi Figura 1) e DN (gp38 - - CD31).

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Risultati

Il presente protocollo è un protocollo di digestione modificata pubblicato da Link et al., 2007 6 con un tempo di digestione breve (45 minuti massimo) a causa di disaggregazione meccanica con una pipetta multicanale automatizzata. Inoltre, la procedura è più standardizzato, minimizza la degradazione dei marcatori di superficie su diverse cellule stromali linfonodali e permette la gestione di più di un campione allo stesso tempo.

Collagenase IV e Collagenase D in Links pro...

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Discussione

Lo studio delle cellule stromali linfonodali recentemente è diventato un focus di ricerca a causa dello sviluppo di due protocolli di digestione pubblicati 6,13. Entrambi i protocolli sono adeguate per ottenere cellule stromali nodo singolo linfatici ma differiscono per l'uso di enzimi digestivi e il tempo di digestione. Poiché le cellule stromali e loro marcatori di superficie sono sensibili alla digestione enzimatica e sollecitazioni meccaniche, è necessario un protocollo ottimizzato.

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Sanjiv Luther e colleghi per le utili discussioni nello stabilire l'attuale protocollo di digestione dei linfonodi. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni SNF PPOOA-_119204 e PPOOP3_144918 a S.W.R.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEMLifeTechnologies-Gibco41965-039
FCSConcentrazione finale 2%
CaCl2Sigma 499609Concentrazione finale 1,2 mM
Collagenasi IVWorthington Biochemical Corporation>160 unità per mg di peso secco, utilizzare alla concentrazione finale di 1 mg/ml
di Collagenasi DRoche11088882001utilizzare a 3,5 mg/ml
di DNAsi IRoche11284932001l'uso a 40 & micro; g/ml
Magneti di agitazioneFAUST5 mm di lunghezza-2 mm ø
Tubi in polistirene a fondo tondo 5 mlFalcon-BD Bioscience
Agitatore magnetico con funzione di riscaldamentoIKA-RCT-standard9720250
piastre di Petri 100 mm, steriliTPP6223201
aghi da 25 GTerumo
anti topo CD45 AbBiolegendClone 30-F11
anti topo CD11c AbBiolegendClone N418
anti topo Podoplanin AbBiolegendClone 8.1.1
anti topo CD31 AbBiolegendClone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multicanale		Eppendorf4861 000.821/8301.250 &; l volume massimo
anti mouse CD140aBiolegendClone APA5
anti mouse CD80BiolegendClone 16-10A1
anti mouse CD40BiolegendClone 1C10
anti mouse I-AbBiolegendClone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1)BiolegendClone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Kit colorante per cellule morte Near-IRInvitrogenL10119

Riferimenti

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