Endocitosi mediata dalla clatrina, un processo rapido e altamente dinamico, internalizza molte proteine, compresi i recettori di segnalazione. Il protocollo qui descritto visualizza direttamente la cinetica dei singoli eventi endocitici. Questo è essenziale per capire come i membri principali del macchinario endocitico si coordinano tra loro e come il carico proteico influenza questo processo.
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Articolo metodologico
Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF
In questo articolo
Sommario
Abstract
Molti importanti recettori di segnalazione vengono internalizzati attraverso il ben studiato processo di endocitosi mediata dalla clatrina (CME). I saggi biologici cellulari tradizionali, che misurano i cambiamenti globali nell'endocitosi, hanno identificato oltre 30 componenti noti che partecipano all'ECM e gli studi biochimici hanno generato una mappa di interazione di molti di questi componenti. Sta diventando sempre più chiaro, tuttavia, che l'ECM è un processo altamente dinamico la cui regolazione è complessa e delicata. In questo manoscritto, descriviamo l'uso della microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per visualizzare direttamente la dinamica dei componenti del macchinario endocitico mediato dalla clatrina, in tempo reale nelle cellule viventi, a livello di singoli eventi che mediano questo processo. Questo approccio è essenziale per chiarire i sottili cambiamenti che possono alterare l'endocitosi senza bloccarla globalmente, come si vede con la regolazione fisiologica. Ci concentreremo sull'utilizzo di questa tecnica per analizzare un'area di interesse emergente, il ruolo della composizione del carico nella modulazione della dinamica di distinte fosse rivestite di clatrina (CCP). Questo protocollo è compatibile con una varietà di sonde di fluorescenza ampiamente disponibili e può essere applicato alla visualizzazione della dinamica di molte molecole di carico che vengono internalizzate dalla superficie cellulare.
Introduzione
Il processo di endocitosi clatrina-mediata (CME) dipende l'arrivo tempestivo delle tante componenti del macchinario endocitosi clatrina-mediata per raccogliere il carico e manipolare la membrana plasmatica in vescicole 1-3. CME è avviata da membrana deformazione e di carico-adattatore proteine che si uniscono in siti nascenti di endocitosi 1. Queste proteine reclutano la clatrina proteina di rivestimento, che assembla in una struttura a gabbia che forma la fossa clatrina rivestite (CCP) 4. Una volta che il PCC è completamente assemblato in una forma sferica, membrana scissione, soprattutto attraverso l'azione del grande GT....
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Protocollo
1 Espressione di fluorescenza Tagged CME Componenti in cellule in coltura
HEK293 cellule sono cellule modelli utili che sono stati ampiamente utilizzati per studiare biologia e GPCR endocitosi, e quindi sono utilizzati come modelli in questo protocollo. Utilizzare qualsiasi protocollo di trasfezione fornendo espressione uniforme senza sovraespressione e bassa citotossicità.
- Maniglia tutti coltura cellulare in una cappa a flusso laminare sterile. Riempire 4 pozzetti di una piastra 12 pozzetti con 1 ml di Dulbecco Modified supporto essenziale (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS). Da un pallone T25 confluenti di cellule ....
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Risultati
Utilizzando live-cella TIRF microscopia abbiamo registrato le dinamiche endocitiche del μ-oppioidi-recettore (MOR), un recettore accoppiati a proteine G (GPCR) e la sua endocitica proteina adattatrice β-arrestina. Il costrutto β-arrestina stato trasfettate in una linea cellulare che esprime stabilmente MOR usando il protocollo descritto nella figura 1, e ripreso 96 ore dopo. Il MOR nella linea cellulare stabile è N-terminale contrassegnato con GFP sensibile al pH. Questa proteina fluorescente reagisce.......
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Discussione
Qui si descrive l'uso di TIRFM per visualizzare clatrina-mediata endocitosi (CME), a livello di singole controparti centrali in cellule viventi in tempo reale. CME è un evento rapido e altamente dinamico mediato dall'effetto cumulativo di molti spazialmente e temporalmente separati singoli eventi. La maggior parte dei test che sono attualmente utilizzati, come le misurazioni biochimiche di interiorizzazione con biotinilazione superficie o di legame ligando, citometria a flusso o cellule dosaggi fissi di misura q.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare i dottori C. Szalinski, H. Teng e M. Bruchez per l'aiuto con Imaris, R. Vistein e D. Shiwarski per l'aiuto tecnico e i consigli, e il dottor M von Zastrow, il dottor T Kirchhausen, il dottor D Drubin e il dottor W Almers per i reagenti e l'utile discussione. I finanziamenti forniti dalla sovvenzione T32 NS007433 a SLB e NIH DA024698 e DA036086 a MAP.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM/Alto glucosio con L-glutammina e piruvato di sodio | Fisher Scientific. | ||
| salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco, senza calcio, senza magnesio | Gibco, di Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Gibco di siero fetale bovino | , di Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, senza rosso fenolo | Gibco, di Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, di Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE di Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Reagente di trasfezione |
| 25 mm vetro di copertura | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Fiasche trattate per colture cellulari Corning, 25 cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Piastra a 6 pozzetti per colture cellulari | Greiner Bio-One, di VWR | 82050-896 | |
| Monoclonale ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetato sale (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Kit | di etichettatura delle proteineLife Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Software di analisi delle immagini | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, per l'analisi | |
| automatizzata Microscopio invertito Nikon Eclipse Ti e accessori necessari, tra cui cubi filtranti e filtri | Braccio Nikon | ||
| Nikon TIRF con adattatori necessari per Nikon Eclipse Ti | Nikon | Per la regolazione dell'angolo di incidenza | |
| iXon+ EMCCD fotocamera e adattatori | Andor |
Riferimenti
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clath....
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Ristampe e permessi
