È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine ​​a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF

70.8K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/51805

⸱

20 ottobre 2014

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

In questo articolo

Sommario

Endocitosi mediata dalla clatrina, un processo rapido e altamente dinamico, internalizza molte proteine, compresi i recettori di segnalazione. Il protocollo qui descritto visualizza direttamente la cinetica dei singoli eventi endocitici. Questo è essenziale per capire come i membri principali del macchinario endocitico si coordinano tra loro e come il carico proteico influenza questo processo.

Abstract

Molti importanti recettori di segnalazione vengono internalizzati attraverso il ben studiato processo di endocitosi mediata dalla clatrina (CME). I saggi biologici cellulari tradizionali, che misurano i cambiamenti globali nell'endocitosi, hanno identificato oltre 30 componenti noti che partecipano all'ECM e gli studi biochimici hanno generato una mappa di interazione di molti di questi componenti. Sta diventando sempre più chiaro, tuttavia, che l'ECM è un processo altamente dinamico la cui regolazione è complessa e delicata. In questo manoscritto, descriviamo l'uso della microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per visualizzare direttamente la dinamica dei componenti del macchinario endocitico mediato dalla clatrina, in tempo reale nelle cellule viventi, a livello di singoli eventi che mediano questo processo. Questo approccio è essenziale per chiarire i sottili cambiamenti che possono alterare l'endocitosi senza bloccarla globalmente, come si vede con la regolazione fisiologica. Ci concentreremo sull'utilizzo di questa tecnica per analizzare un'area di interesse emergente, il ruolo della composizione del carico nella modulazione della dinamica di distinte fosse rivestite di clatrina (CCP). Questo protocollo è compatibile con una varietà di sonde di fluorescenza ampiamente disponibili e può essere applicato alla visualizzazione della dinamica di molte molecole di carico che vengono internalizzate dalla superficie cellulare.

Introduzione

Il processo di endocitosi clatrina-mediata (CME) dipende l'arrivo tempestivo delle tante componenti del macchinario endocitosi clatrina-mediata per raccogliere il carico e manipolare la membrana plasmatica in vescicole 1-3. CME è avviata da membrana deformazione e di carico-adattatore proteine ​​che si uniscono in siti nascenti di endocitosi 1. Queste proteine ​​reclutano la clatrina proteina di rivestimento, che assembla in una struttura a gabbia che forma la fossa clatrina rivestite (CCP) 4. Una volta che il PCC è completamente assemblato in una forma sferica, membrana scissione, soprattutto attraverso l'azione del grande GTPasi, dynamin, genera vescicole libere clatrina rivestite (CCV) 5,6. Questa interiorizzazione innesca un rapido smontaggio del mantello clatrina, permettendo componenti di essere riutilizzati per più cicli di CME.

La scoperta e la caratterizzazione delle proteine ​​coinvolte nella CME è stata radicata nella Bioch tradizionaleemical, e le tecniche di microscopia genetiche 4-6,8. Questi test hanno chiarito i ruoli e punti di interazione di questi componenti endocitiche. Anche se molto utile per definire i componenti essenziali di macchinari traffico, questi test sono molto limitati a catturare il comportamento dinamico dei componenti CME o concentrazione del carico. Questa è una limitazione fondamentale, dal momento che CME è guidato dalla assemblea coreografia di serie di moduli proteici in passi definiti, e dal momento che i piccoli cambiamenti nelle dinamiche dei singoli eventi endocitiche può avere grandi conseguenze cumulative di endocitosi. Inoltre, dati recenti indicano che le singole controparti centrali possono differire sia nella composizione e nel comportamento, suggerendo che la regolazione fisiologica di questo processo è altamente spazialmente e temporalmente vincolato 9-14. Visualizzare singoli eventi endocitiche, dunque, è essenziale per capire il motivo per cui ci sono più proteine ​​ridondanti coinvolte nel CME e b come queste proteine ​​possano essere controllatisegnali fisiologici y per regolare il carico internalizzazione.

Qui si descrive l'uso di Total Internal Reflection microscopia a fluorescenza (TIRFM) per osservare CME a livello della dinamica dei singoli CCP in cellule viventi. TIRFM si basa sulla differenza di indice di rifrazione tra il vetrino di vetro e l'ambiente fluido di cellule 15,16. Quando la luce di eccitazione è diretto verso le cellule in oltre l'angolo critico, si riflette internamente, creando un'onda evanescente che mantiene un campo sottile di illuminazione che si estende a circa 100 nm sopra il vetrino. Questo assicura che solo le molecole fluorescenti all'interno di questo ristretto campo sono entusiasti. In pratica, questo permette l'eccitazione di molecole fluorescenti sopra o vicino alla membrana plasmatica, e riduce al minimo la fluorescenza dalle parti interne della cellula. Ciò fornisce un rapporto segnale-rumore e asse z risoluzione significativamente superiore per visualizzare gli eventi alla membrana plasmatica, compared a modi di trasporto più comunemente utilizzati, come epifluorescenza convenzionale o microscopia a fluorescenza confocale. Abbiamo anche descrivono, ad un livello introduttivo e pratico, l'uso di un'immagine piattaforma di analisi comunemente usato per analizzare e quantizzare semplici caratteristiche morfologiche e dinamiche dei singoli eventi cargo endocitiche.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1 Espressione di fluorescenza Tagged CME Componenti in cellule in coltura

HEK293 cellule sono cellule modelli utili che sono stati ampiamente utilizzati per studiare biologia e GPCR endocitosi, e quindi sono utilizzati come modelli in questo protocollo. Utilizzare qualsiasi protocollo di trasfezione fornendo espressione uniforme senza sovraespressione e bassa citotossicità.

  1. Maniglia tutti coltura cellulare in una cappa a flusso laminare sterile. Riempire 4 pozzetti di una piastra 12 pozzetti con 1 ml di Dulbecco Modified supporto essenziale (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS). Da un pallone T25 confluenti di cellule HEK293 diluire 1:50, 1:25, 1:16, 1:10, rispettivamente in ciascuno dei 4 pozzi.
    1. In alternativa, seminare le cellule ad una piastra multi-pozzo di dimensioni desiderate, secondo le istruzioni del produttore. Seed 0,4-2 x 10 4 cellule in una piastra 12 pozzetti. Far crescere le cellule durante la notte in una sterile 37 ° C con 5% di CO 2 e il 95% di umidità.
      NOTA: Considerando che la crescita rates variano a seconda delle condizioni e linee cellulari, potrebbe essere preferibile seminare pozzi multipli per garantire confluenza ideale per la trasfezione il giorno successivo o la possibilità di effettuare trasfezioni in duplicato.
  2. La mattina successiva, selezionare un pozzo che è ~ 70% confluenti per trasfezione (vedi Figura 1B). Se nessun bene ha raggiunto questo stato, aspettare un altro giorno.
    NOTA: 70% di confluenza è l'ideale per HEK293 cellule. Trasfezione le cellule che sono risultati più sparse nella morte cellulare e la tossicità. Trasfettando over-confluenti cellule si traduce in scarsa espressione.
  3. Aggiungere 60 microlitri di buffer CE (dal kit di transfezione), 400 ng di plasmidi che codificano taggato GPCR e / o componenti del macchinario clatrina, e 2,4 ml di Enhancer nella provetta da 1,5 ml, come descritto nel protocollo del produttore. Vortex per 2 secondi per assicurare la miscelazione sufficiente, e girare in una microcentrifuga a 2.000 xg per 2 secondi per raccogliere il liquido sul fondo.
  4. Aggiungere6 ml Effectene come descritto nel protocollo del produttore. Vortex per 2 secondi, e far girare a 2.000 xg per 2 secondi in una microcentrifuga per raccogliere il liquido sul fondo. Attendere 20 minuti per consentire la formazione di micelle trasfezione complesse.
  5. Aspirare i media del bene da transfettate. Aggiungere delicatamente 0,8 ml di DMEM con 10% FBS alla miscela reagente di trasfezione e mescolare pipettando su e giù lentamente per ridurre la rottura delle micelle. Aggiungere i media e la miscela di trasfezione al pozzo molto lentamente dal lato. Aggiungere qualsiasi miscela di trasfezione rimanente dalla provetta al pozzo mediante una micropipetta.
    NOTA: In alternativa, aggiungere un extra di 0,5 ml di DMEM con 10% FBS al pozzo transfettate per dare alle cellule nutrimento supplementare conseguente trasfezione più dolce e più bassa espressione transiente.
  6. Riportare le cellule a 37 ° C incubatore per 5 ore.
  7. Aspirare il terreno contenente la miscela di trasfezione. Sostituire con 1 ml di DMEM con 10% FBS. Consentirele cellule a crescere durante la notte.
  8. Il giorno successivo, passare le cellule a coprioggetti non rivestiti, precedentemente sterilizzati in autoclave.
    1. Aggiungere 0,5 ml di tampone fosfato (PBS) con 1 mM EDTA in ogni pozzetto. In alternativa, utilizzare 0,5 ml di 0,05% tripsina-EDTA. Lasciare in incubatrice per 1 min.
    2. Mettere 3 rotondo, sterile 25 millimetri coprioggetto nei pozzetti separati di una piastra da 6 pozzetti. Riempire ogni pozzetto con 2 ml di media. Spingere delicatamente il coprioggetto fino al fondo del pozzo per impedire alle cellule di crescere sul fondo del vetrino.
    3. Agitare manualmente il bene a sollevare le cellule dal fondo del pozzo. Aggiungere 1 ml di DMEM con 10% FBS per sospendere nuovamente. Distribuire le cellule sollevate dal 1 pozzetto di una piastra 12 pozzetti modo uniforme tra i 3 coprioggetti. In alternativa, le cellule piatto su 3 piatti dal fondo di vetro.
  9. Permettono alle cellule di crescere sui vetrini per almeno 48 ore prima di imaging. Assicurarsi che le cellule sono sparsi e piatta.

2.Imaging PCC e Cargo Dynamics Utilizzando TIRFM

  1. Anticorpi anti-FLAG Coniugato M1 con coloranti Alexa Alexa Fluor utilizzando kit Protein Etichettatura secondo il protocollo del produttore. In alternativa, gli anticorpi pre-coniugati possono essere acquistati.
  2. Pre-incubazione delle cellule con anticorpi ad una diluizione 1: 1000 in 1 ml di pre-riscaldato mezzo Leibovitz con 10% FBS, o Opti-MEM con 50 mM HEPES pH 7,4 e il 10% FBS per 10 min a 37 ° C (imaging medio), di etichettare GPCR FLAG-tag sulla superficie cellulare. Saltare questa procedura se le proteine ​​fluorescenti geneticamente codificate, come GFP, sono utilizzati come tag (vedi la discussione per i dettagli).
  3. Trasferire il vetrino in una camera di live-cell imaging. In alternativa, per i piatti con fondo trasparente, aspirare i media anticorpo-etichettatura e aggiungere 700 ml di mezzo di imaging pre-riscaldato.
    1. Utilizzare un paio di pinze e piegare la punta di un ago calibro 25 in un gancio.
    2. Tenere un paio di pinze in mano dominante. Tenere l'ago piegato in OTHer. Girare l'ago fino a quando le curve gancio verso il vetro. Trascinare delicatamente l'ago, lato gancio verso il basso, sul fondo di un 6-pozzetti fino ad agganciarlo sul coprioggetti. Fare attenzione a non graffiare la superficie del vetrino, come sarà staccare le cellule. Sollevare delicatamente il vetrino su dal fondo del pozzo. Bilanciare il coprioggetto contro la parete del pozzo per il supporto.
    3. Utilizzare le pinze per afferrare vicino al bordo del vetrino e spostare il lato della cella coprioggetto fino alla camera di imaging, e montare la camera. Aggiungere 700 microlitri (o quantità appropriata) di terreno di imaging pre-riscaldato. Maneggiare con cura i coprioggetti senza pressione per evitare fessurazioni o rotture.
  4. Trasferire la camera sul microscopio e mantenere la temperatura delle cellule a 37 ° C con un riscaldatore stadio o un incubatore chiusa.
  5. Portare le cellule a fuoco utilizzando un obiettivo ad immersione in olio o 60X 100X TIRF (1.45 NA o superiore). Immagine le cellule in epifluorescenza convenzionale o conmodalità focali di illuminazione (cioè non TIRFM) per identificare le cellule che esprimono i costrutti appropriati. Out-of-focus cellule sono quasi invisibili nel sottile profondità di illuminazione TIRF che rende difficile trovare il piano focale e le cellule.
    NOTA: Alcuni sistemi usano gli stessi laser per TIRFM di immagine in epifluorescenza convenzionale, spostando l'angolo di incidenza del laser sopra l'angolo critico. Come importante precauzione di sicurezza, sempre consapevole della inclinazione del fascio laser, e sempre dirigere lontano dall'osservatore.
  6. Fuoco fino alla superficie inferiore di una cellula che esprime finché il contorno della membrana plasmatica intorno alla cella scompare e appare il centro della cella. Questo è più evidente con una membrana plasmatica di proteine ​​carico localizzate, come il recettore μ-oppioidi (vedere Figura 2A).
  7. Passare a immagini TIRF.
    1. Se si utilizzano gli stessi laser per l'imaging in epifluorescenza convenzionale, aumentare l'angolo di incidenza dellalaser fino fluorescenza fuori fuoco all'interno della cellula scompare, e nessun contorno della membrana plasmatica intorno alla cella è visto. (Confronta Figura 2C alle figure 2A e 2B)
      NOTA: In TIRFM, spostando il piano focale, l'immagine di andare completamente fuori fuoco e / o debole, e il livello generale di fluorescenza diminuisce a causa della minore profondità di illuminazione. Pertanto, un metodo alternativo per passare illuminazione TIRFM è quello di mettere a fuoco al centro della cella in epifluorescenza confocale / convenzionale, quindi aumentare l'angolo di incidenza fino a perdere gran parte della fluorescenza, e quindi concentrarsi verso la membrana plasmatica.
    2. Una volta in TIRFM, garantire il laser di eccitazione riflette attraverso l'obiettivo e non è visibile sopra l'obiettivo. Confermare questo controllando se il punto laser è visibile.
      NOTA: In modalità epifluorescenza o confocali convenzionali, l'illuminazione laser è visibile sopra l'obiettivo,ad esempio sul soffitto.
    3. Affinare la messa a fuoco per ottenere un'immagine nitida. I principali componenti del macchinario endocitica, come ad esempio clatrina, saranno visibili in puncta. Regolare la messa a fuoco sul bene, in modo che il puncta sono tondi come possibile.
      NOTA: Per i carichi membrana localizzata, regolare la messa a fuoco fine fino a quando il filopodia appaiono distinti.
    4. Utilizzare un programma di acquisizione di salvare tutti i parametri di imaging, quali specchi e angolo TIRF. Fate questo per tutte le lunghezze d'onda necessarie.
  8. Eseguire la scansione di tutto il coprioggetto per trovare tutte le cellule che esprimono i marcatori endocitiche desiderati: il recettore μ-oppioidi e l'adattatore di β-arrestina nell'esempio mostrato nella Figura 3A. Selezionare le celle che esprimono, ma non troppo-esprimono. Vedi di discussione per i dettagli.
  9. Una volta che le cellule sono identificati, acquisire immagini ogni 3 secondi per 10 min. Questo è sufficiente a catturare la vita di una controparte centrale, dal momento che la vita media di un CCP in HEK293 cellule impressi in queste condizioni è around 40 sec 10-11. Questo permette a circa 12-14 fotogrammi per osservare il PCC. Per esempio vedere film 1. Ripetere tutti i passaggi per celle aggiuntive di immagine.

3 Analisi di endocitica Dynamics da Verification Manual

Anche se la verifica manuale della vite PCC è fortemente limitata dal numero delle controparti centrali che possono essere rilevati, rimane ancora un mezzo preciso di rilevamento imperterrita dai cambiamenti globali a immagine e rilevazione artefatti. Vedi di discussione per i dettagli.

  1. Aprire il file in ImageJ. Le immagini vengono memorizzate come una singola pila di file tiff con canali interlacciati. Convertire immagini in hyperstacks. Vai a Immagine> Hyperstacks> stack HyperStack. Inserire il numero di canali acquisiti (cioè se di imaging β-arrestina e il recettore μ-oppioidi, entrano 2) Immettere 1 per Z pila (TIRFM è un unico piano), e il numero di fotogrammi del film (cioè un 10 min filmato a 1 fotogramma ogni 3 secondi is 200) nella finestra pop-up.
  2. Il formato HyperStack produce una finestra con due barre di scorrimento. Utilizzare la barra superiore per spostarsi tra i canali e il fondo di muoversi attraverso il tempo. Scorrere fino al canale della proteina le cui vite saranno analizzati.
  3. Spostarsi al fotogramma 10 o 15 del film di ridurre l'inclusione delle controparti centrali preesistenti la cui durata intera non sono visibili. Disegnare una casella ROI attorno a un punto scelto a caso.
  4. Contare il numero di fotogrammi uno spot è visibile.
    NOTA: Vedere la Figura 3B e 3C per gli esempi di tre categorie morfologiche di eventi endocitiche 10,11,16-19.

4 Analisi di endocitica Dynamics tramite riconoscimento Obiettivo

Riconoscimento Obiettivo consente il rilevamento di quasi tutti i CCP impressi in una cella, ma può essere soggetta a errori a causa del rilevamento spurie di strutture errate. Vedi di discussione per i dettagli di pesatura i vantaggi e gli svantaggi di indirizzo eMetodo ach. Diversi programmi, compresi gli algoritmi custom-built, possono essere utilizzati per rilevare oggettivamente CCP. Questo protocollo descrive riconoscimento oggettivo delle controparti centrali utilizzano Imaris, un software di analisi delle immagini (vedi Materiali).

  1. Per iniziare, aprire il file di immagine RAW nel software di analisi delle immagini. Per impostazione predefinita, viene visualizzata un'immagine a colori unito. Utilizzare la finestra "Regolazione Display" per regolare la luminosità di un canale. Fare clic sul nome di un canale per modificare il colore visualizzato. Deseleziona la casella accanto al canale per evitare che il suo display (vedere la Figura 4A).
  2. Creazione di "macchie", cliccando sull'icona con macchie arancioni. Vedere la Figura 4B. Selezionare una regione di interesse (ROI) intorno alla cella. Vedere la Figura 4C. Utilizzare un ROI per escludere aree che erroneamente rilevare bordi d'attacco luminosi e targhe. Analizzare celle multiple con diversi livelli di espressione separatamente.
  3. Misurare il diametro di un posto per ProVide stime iniziali per l'algoritmo. Passare alla modalità "Slice", e fare clic su estremità polari di un punto per misurare il suo diametro. Vedere la Figura 4E. Fate questo per 4 o 5 macchie rotonde che sembrano indicativi di una CCP al culmine della sua stabilità, dopo la formazione e la prima scissione. Utilizzare queste misurazioni per calcolare diametro medio fino al decimo di micron.
  4. Rileva Spot. Tornare alla modalità "Superare". Selezionare il canale appropriato per la rilevazione. Inserire il diametro medio misurato, di solito 0,3 o 0,4 micron. Fare clic sulla freccia in avanti blu per quantificare i Spots. Vedere la Figura 4E. Se il diametro di macchie è sottovalutato, punti spuri di fluorescenza saranno identificati come macchie. Se il diametro è troppo grande, i veri spot saranno ignorati. Quando incerti, stimare un po 'più basso, e filtrare le rilevazioni errate tardi.
  5. Filtra Spot da Quality. Regolare il filtro per catturare il maggior numero possibile di macchie senza schienaleterra. Il filtro di qualità è selezionata per impostazione predefinita 20. Vedere la Figura 4F.
    1. Utilizzare la curva "Qualità" come guida per impostare una soglia appropriata. Spostare la soglia inferiore del filtro con il tasto sinistro del mouse per questo primo tuffo in curva. Questo è un buon punto di partenza per il filtro, in quanto questa posizione di solito affina il rilevamento di macchie visibili solo. Vedere la Figura 4F.
    2. Spot rilevati appaiono sul film sfere o centri pixel. Utilizzando la scheda "Colori", regolare il colore delle macchie di un colore a contrasto per rendere più facile per vederli. Scorrere il filmato di rivedere i punti in ogni fotogramma. L'obiettivo è quello di individuare il maggior numero possibile di spot per la totalità della loro vita.
    3. Eliminare le macchie dimmer o manualmente connettersi a continue tracce in seguito, in quanto non vengono rilevati anche attraverso il corso della loro vita.
    4. Rimuovere targhe luminose con un fil "Intensity"ter, se necessario. Fare clic sul segno più verde per aggiungere un nuovo filtro. Vedere la Figura 4F. Creazione di un filtro Intensità per filtrare dentro o fuori Macchie di un dato segnali di fluorescenza. Utilizzare la curva generata intensità, (analogo a Quality Curva discusso in 4.5) per impostare la soglia. Utilizzare il pulsante sinistro del mouse per rimuovere all'estremità sinistra della curva che rappresenta le macchie brillanti.
      NOTA: Grandi strutture di placca sono di solito tra gli elementi più brillanti del cellulare, e sono facilmente esclusi con questo filtro.
    5. Scorrere il filmato al fine di garantire che le controparti centrali vengono rilevati come macchie e placche brillanti non vengono rilevati. Figura 3D mostra una cella in cui il rilevamento delle controparti centrali (indicato con sfere bianche) è stato ottimizzato con il filtro di qualità e targhe sono state escluse con la qualità filtro.
    6. Ridurre i bordi delle celle luminose con il filtro di qualità. Oggetti luminosi possono ancora bisogno di essere rimosso manualmente, al passaggio successivo. Continuare con il blufreccia.
    7. Rimuovere macchie aberranti nella schermata Modifica Spots. Passare a "Selezionare la" modalità. Fare clic sul posto. Esso diventerà giallo. Fare clic su "Elimina". Fare clic sulla freccia blu per continuare a costruire l'algoritmo. Vedere la Figura 4G.
  6. Tracce di misura. Impostare i brani di "moto browniano." Il PCC non dovrebbe presentare alcun movimento diretto, solo alla deriva minima attraverso la membrana plasmatica. Questo algoritmo è più appropriato per quel movimento. Vedere la Figura 4H.
    1. Impostare il Max Distanza di un piccolo valore come 0,7 micron. Vedere la Figura 4H.
      NOTA: L'impostazione di una piccola distanza minimizza il collegamento di macchie adiacenti e consente ancora per continuare il monitoraggio di uno spot cellulare tramite CCP o il movimento delle cellule.
    2. Impostare Max Gap Size a 1 Questo permette una traccia di continuare se vi è un solo fotogramma mancante in successione. Fare clic sulla freccia blu per calcolare le tracce. Vedere la Figura 4H.
      NOTA: Gdimensioni ap di più di 3 cause diverse tracce per essere correttamente collegati tra loro.
    3. Passa pista visualizzazione di "Dragon Tail". Scorrere il filmato osservando la qualità del rilevamento. Se vengono collegati macchie adiacenti, diminuire il Max distanza inferiore a 0,7 micron. Se le macchie sono state interrotte troppo facilmente, aumentare la Dimensione Max Gap. Fare clic sulla freccia blu per creare tracce. Questo porta alla schermata brani filtro. Vedere la Figura 4H.
  7. Filtro Tracce e l'esportazione dei dati. Utilizzare un filtro "Intensity" per rimuovere ulteriori placche luminose. Utilizzare un filtro "Spostamento" per rimuovere endosomi che entrano nel campo TIRF. Usare cautela, come macchie più lunghi avranno spostamenti più lunghi pure. Fare clic sulla doppia freccia verde per completare il protocollo. Vedere la Figura 4I.
    1. Utilizzare la scheda Edit Tracce, con l'icona della matita, per eliminare i falsi positivi rilevazioni di tracce che non potevano essere rimossi dai filtri. Controllare discontinuities o falsi collegamenti. Per collegare due tracce, selezionarle utilizzando Ctrl-click sinistro, quindi fare clic su "Connetti" nella casella di modifica tracce. Per scollegare i brani in punti separati, selezionare un brano e premere "Disconnetti". Selezionare più punti con Ctrl + click sinistro e fare clic su "Connect" per creare una nuova traccia. Il metodo è lo stesso per l'editing di macchie, descritte in 4.5.7. Vedere la Figura 4J.
    2. Per esportare i dati, andare alla scheda statistiche. Fare clic sull'icona singolo disco floppy per esportare la statistica selezionata. Fare clic sull'icona che appare come una serie di floppy disk per esportare tutte le statistiche. La statistica "Track Durata" contiene la lunghezza delle piste endocitici. Vedere la Figura 4K.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Utilizzando live-cella TIRF microscopia abbiamo registrato le dinamiche endocitiche del μ-oppioidi-recettore (MOR), un recettore accoppiati a proteine ​​G (GPCR) e la sua endocitica proteina adattatrice β-arrestina. Il costrutto β-arrestina stato trasfettate in una linea cellulare che esprime stabilmente MOR usando il protocollo descritto nella figura 1, e ripreso 96 ore dopo. Il MOR nella linea cellulare stabile è N-terminale contrassegnato con GFP sensibile al pH. Questa proteina fluorescente reagisce...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Qui si descrive l'uso di TIRFM per visualizzare clatrina-mediata endocitosi (CME), a livello di singole controparti centrali in cellule viventi in tempo reale. CME è un evento rapido e altamente dinamico mediato dall'effetto cumulativo di molti spazialmente e temporalmente separati singoli eventi. La maggior parte dei test che sono attualmente utilizzati, come le misurazioni biochimiche di interiorizzazione con biotinilazione superficie o di legame ligando, citometria a flusso o cellule dosaggi fissi di misura q...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare i dottori C. Szalinski, H. Teng e M. Bruchez per l'aiuto con Imaris, R. Vistein e D. Shiwarski per l'aiuto tecnico e i consigli, e il dottor M von Zastrow, il dottor T Kirchhausen, il dottor D Drubin e il dottor W Almers per i reagenti e l'utile discussione. I finanziamenti forniti dalla sovvenzione T32 NS007433 a SLB e NIH DA024698 e DA036086 a MAP.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEM/Alto glucosio con L-glutammina e piruvato di sodioFisher Scientific.
salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco, senza calcio, senza magnesioGibco, di Life Technologies21600-010
EDTA Free AcidAmresco0322-500G
Gibco di siero fetale bovino, di Life Technologies10437-028
Leibovitz's L-15 Medium, senza rosso fenoloGibco, di Life Technologies21083-027
Opti-MEMGibco, di Life Technologies
HEPESCellPURE di Fisher ScientificBP2937-100
EffecteneQiagen301425Reagente di trasfezione
25 mm vetro di coperturaFisher Scientific12-545-86
Fiasche trattate per colture cellulari Corning, 25 cm2Fisher Scientific10-126-28
Piastra a 6 pozzetti per colture cellulariGreiner Bio-One, di VWR82050-896
Monoclonale ANTI-FLAG M1Sigma AldrichF3040-5MG
[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetato sale (DAMGO)Sigma AldrichE7384-5MG
Alexa Fluor 647 Kitdi etichettatura delle proteineLife TechnologiesA20173
ImageJNIHhttp://rsb.info.nih.gov/ij/
Software di analisi delle immaginiBitPLanehttp://www.bitplane.com/imaris/imaris, per l'analisi
automatizzata Microscopio invertito Nikon Eclipse Ti e accessori necessari, tra cui cubi filtranti e filtriBraccio Nikon
Nikon TIRF con adattatori necessari per Nikon Eclipse TiNikonPer la regolazione dell'angolo di incidenza
iXon+ EMCCD fotocamera e adattatoriAndor
SH3024301 Soluzione

Riferimenti

  1. McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
  2. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123 (2), (2005).
  3. Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9 (3), (2011).
  4. Ungewickell, E., Branton, D. Assembly units of clathrin coats. Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).
  5. Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351 (6325), (1991).
  6. Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374 (6518), (1995).
  7. Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121 (4), 593-606 (2005).
  8. Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).
  9. Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123 (5), 875-888 (2005).
  10. Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127 (1), 113-124 (2006).
  11. Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).
  12. Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
  13. Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).
  14. Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7 (3), (2009).
  15. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).
  16. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).
  17. Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118 (5), 591-605 (2004).
  18. Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).
  19. Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).
  20. Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
  21. Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
  22. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  23. Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7 (9), (2009).
  24. Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
  25. Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).
  26. Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).
  27. Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).
  28. Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. Redistribution of caveolae during mitosis. J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).
  29. Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
  30. Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Fossule rivestite di clatrinamicroscopia a fluorescenzaanalisi delle immaginiimaging di cellule vivedinamiche endocitichecomposizione del carico
Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine ​​a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.