Al fine di esplorare in modo completo la diversità dei glicani legati all'O, una nuova procedura per l'eliminazione riduttiva della β in gel, combinata con la permetilazione e un metodo di partizione di fase rapida, viene applicata all'analisi dei glicani legati all'O rilasciati direttamente dalle glicoproteine risolte mediante SDS-PAGE e suscettibili di successiva analisi glicomica mediante spettrometria di massa.
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Articolo metodologico
Miglioramento in gel riduttive solfo-glycomics β-eliminazione completa per O-linked e di spettrometria di massa
In questo articolo
Sommario
Abstract
La separazione delle proteine mediante SDS-PAGE seguita dalla digestione proteolitica in gel delle bande proteiche risolte ha prodotto un'analisi proteomica ad alta risoluzione di campioni biologici. Approcci simili, che consentirebbero un'analisi approfondita dei glicani trasportati dalle glicoproteine risolte da SDS-PAGE, richiedono considerazioni speciali al fine di massimizzare il recupero e la sensibilità quando si utilizza la spettrometria di massa (MS) come metodo di rilevamento. Uno dei principali ostacoli da superare per ottenere dati di alta qualità è la rimozione dei contaminanti derivati da gel che interferiscono con l'analisi della MS. Il flusso di lavoro del campione qui presentato è robusto, efficiente ed elimina la necessità di una pulizia HPLC in linea prima della MS. I pezzi di gel contenenti proteine target vengono lavati in acetonitrile, acqua e acetato di etile per rimuovere i contaminanti, compresi i frammenti di acrilammide polimerica. I glicani legati all'O vengono rilasciati dalle proteine bersaglio mediante β-eliminazione riduttiva in gel e recuperati attraverso procedure di purificazione semplici e robuste. Un vantaggio di questo flusso di lavoro è che migliora la sensibilità per il rilevamento e la caratterizzazione dei glicani solfatati. Queste procedure producono un'efficiente separazione dei glicani permetilati solfatati dai glicani permetilati non solfatati (sialilati e neutri) mediante una rapida partizione di fase prima dell'analisi MS, e quindi migliorano le analisi glicomiche e sulfoglicomiche delle glicoproteine risolte da SDS-PAGE.
Introduzione
La glicosilazione è una proteina post-traduzionale modifica essenziale, contribuendo alla fisiologia organismal, patologia dei tessuti, e il riconoscimento cellulare 1-3. Nonostante i grandi progressi nella glicoscienza analitica, che caratterizza la diversità completa di glicani su una specifica proteina rimane un compito estremamente impegnativo, soprattutto sulle proteine isolate da fonti biologiche primarie. Tuttavia, la microeterogeneità di glicani glicoproteina interessa frequentemente interazioni funzionali con altre proteine. Pertanto, la caratterizzazione della diversità glycan è essenziale per comprendere il significato fisiologico di cellulare....
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Protocollo
NOTA: Le preoccupazioni di sicurezza di laboratorio
In linea con le migliori prassi standard di laboratorio, osservare quanto segue. Conservare tutti i solventi organici nelle posizioni appropriate. Conservare tutti i materiali di scarto in contenitori per rifiuti chimici con una chiara etichettatura di composizione chimica. Come diversi reagenti utilizzati in questi protocolli sono potenziali agenti cancerogeni o generare gas infiammabili volatili, gestire tutti i reagenti in una cappa aspirante con ventilazione. Indossare dispositivi di protezione individuale, come guanti, camice da laboratorio e occhiali di protezione ....
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Risultati
Effetto di acetato di etile Trattamento Prima di In-gel riduttiva β-eliminazione
Uno spettro di massa di campioni rappresentativi glicani O-linked permethylated rilasciati da bovini mucina utilizzo nel gel riduttivo β-eliminazione è mostrato in Figura 3. Il lavaggio EtOAc dei pezzi di gel rimuove efficacemente SDS e Polyacryl contaminanti che interferiscono con successiva analisi MS 27.
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Discussione
La combinazione dell'eliminazione riduttiva della β in gel con l'estrazione acquosa-organica migliora la sensibilità e la profondità dei dati strutturali che possono essere acquisiti per caratterizzare i glicani legati all'O solfatati e non solfatati raccolti da piccole quantità di glicoproteine di tipo mucina risolte da altre proteine mediante SDS-PAGE. I progressi essenziali degli approcci tecnici presentati in questo studio sono: (a) facile rimozione di contaminanti derivati da gel mediante semplici fasi di lavaggio; .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione P01HL107151 dal NHLBI/NIH. Gli autori riconoscono inoltre con gratitudine il supporto e l'accesso alla strumentazione forniti attraverso le sovvenzioni P41GM103490 del NIGMS/NIH.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acqua, acqua deionizzata | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, per HPLC |
| Acido acetico, Glacial | Fisher | A38-500 | Certificato ACS ≥ 99,7% p/p |
| Metanolo | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV, per HPLC, ≥ 99,9% |
| Bicarbonato di ammonio | Fluka | 09830-500G | BioUltra, ≥ 99,5% (T), Passaggio 1 |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, per HPLC, ≥ 99,9%, Fase 1 |
| Acetato di etile | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, Fase 1 |
| Boroidruro di sodio | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, Fase 2 |
| Iodometano | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus, 99,5%, Passaggio 6. Conservare a 4 gradi C fino all'uso. Sedersi a temperatura ambiente prima dell'uso. |
| Soluzione di idrossido di sodio, 50% p/p | Fisher | SS254-1 | , Fase 6 |
| Dimetilsolfossido, anidro | Sigma-Aldrich | 276855-1L | Anidro, ≥ 99,9%, Fase 6 |
| Metanolo, anidro | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | Anidro, 99,8%, Passo 6 |
| Diclorometano | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®, per HPLC, ≥ 99,8%, contiene amilene come stabilizzante, Passaggio 7 |
| Dowex 50WX8 forma di idrogenoforma di idrogeno 100-200 maglia | Sigma-Aldrich | 217506-500G | Resina Step 3 |
| AG 50W-X8 | Bio-Rad | 142-1441 | Passaggio 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Colonna di estrazione in fase solida, PP, Octadecyl (C18) Fase inversa | JT Baker | JT-7020-01 | Passaggio 5 e 8 |
| 7,5% Mini-PROTEAN TGX Gel prefabbricato | Bio-Rad | Passaggio 1 | |
| Colorazione Coomassie bio-sicura | Bio-RAD | 161-0786 | G-250, Step 1 |
| Kit per colorazione d'argento per spettrometria di massa | Pierce | 24600 | Step 1 |
| Kit di oligosaccaridi (maltotriosio, dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| Kit di oligosaccaridi (maltotetraosio, dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| Pipette monouso Pasteur, vetro, punta corta | VWR | 14673-010 | Lavare prima dell'uso |
| PYREX 13 x 100 mm Provette di coltura filettate monouso a fondo tondo | Corning | 99447-13 | Lavare prima dell'uso |
| PYREX 16 x 125 mm Provette di coltura filettate monouso a fondo tondo | Corning | 99447-16 | Lavare prima dell'uso |
| Cappucci/chiusure fenoliche con rivestimento in gomma rivestita in PTFE | Kimble | 45066C-13 | Lavare prima dell'uso |
| Cappucci/chiusure fenoliche con rivestimento in gomma PTFE | Kimble | 45066C-15 | Lavare prima dell'uso |
| Siringa Hamilton HPLC | HAMILTON | 81265 | volume 500 μ l, ago misura 22 G |
| Siringa HPLC Hamilton | HAMILTON | 81165 | volume 250 μ l, ago misura 22 G |
| Siringa Hamilton HPLC | HAMILTON | 81065 | volume 100 μ l, ago misura 22s G |
| Siringa HPLC Hamilton | HAMILTON | 80965 | volume 50 μ l, ago misura 22s G |
| Siringhe calibrate Hamilton | HAMILTON | 80300 | volume 10 μ l, misura dell'ago 26s G |
| Petri Dish Glass 100 mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | Lavare prima dell'uso, Passaggio 1 |
| Lame chirurgiche Bard-Parker | Fisher | 371310 | Passaggio 1 |
| Modulo di riscaldamento/agitazione Reacti-Therm | Pierce | 18870 | Passaggio 1, 4 e 7 |
| Blocchi riscaldanti | Fisher | 125D | Passaggio 2 |
| Lana di vetro in fibra di vetro Pyrex, dimensione dei pori 8 μ m | Aldrich | CLS3950 | Passaggio 3 |
| Taglierina per silice fusaTagliatubi | alltech | 3194 | Passaggio 3 |
| Vortici multitubo | VWR | 444-7063 | Passaggio 6 |
| Liofilizzatore 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| Centrifuga | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific |
Riferimenti
- Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
- Moremen, K. W., Tiemeye....
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Ristampe e permessi
