La combinazione di ordinamento magnetico di cellule madri e test di fluttuazione per analizzare genoma instabilità mitotica Durante l'invecchiamento cellulare in Saccharomyces cerevisiae

Sommario

Tassi di mutazione nei giovani Saccharomyces cerevisiae cellule misurati mediante test di fluttuazione vengono utilizzati per prevedere le frequenze di mutazione di cellule madri di età diverse replicative. Ordinamento magnetico e citometria a flusso vengono poi utilizzati per misurare le frequenze di mutazione effettivi e l'età delle cellule madri per individuare eventuali scostamenti dalle frequenze di mutazione previste.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae è stato un ottimo sistema modello per l'esame dei meccanismi e delle conseguenze di instabilità del genoma. Le informazioni ottenute da questo modello di lievito è rilevante per molti organismi, compresi gli esseri umani, dal momento che i fattori di riparazione del DNA e di risposta danno al DNA sono ben conservati tra le specie diverse. Tuttavia, S. cerevisiae non è stata ancora utilizzata per affrontare pienamente se il tasso di accumulare mutazioni cambia con l'aumentare replicativa (mitosi) età a causa di vincoli tecnici. Ad esempio, le misure di lievito durata replicativa tramite micromanipolazione coinvolgono molto piccole popolazioni di cellule, che vietano la rilevazione di mutazioni rare. Sono stati sviluppati metodi genetici per arricchire di cellule madri nelle popolazioni inducendo la morte delle cellule figlie, ma le dimensioni della popolazione sono ancora limitati dalla frequenza con cui si verificano mutazioni casuali che compromettono i sistemi di selezione. Il protocollo attuale si avvale di Sorti magneticong di cellule madri lievito superficie marcato per ottenere abbastanza grandi popolazioni di invecchiamento cellule madri di quantificare mutazioni rare le selezioni fenotipiche. Tassi di mutazione, misurata attraverso test di fluttuazione, e le frequenze di mutazione sono in primo luogo stabilito per i giovani e le cellule utilizzati per predire la frequenza delle mutazioni in cellule madri di varie età replicative. Frequenze di mutazione sono poi determinati per cellule madri ordinati, e l'età delle cellule madri è determinata in citometria a flusso da colorazione con un reagente fluorescente che rileva cicatrici gemma formate sulla loro superficie delle cellule durante la divisione cellulare. Confronto delle frequenze di mutazione previste in base al numero di divisioni cellulari alle frequenze osservate sperimentalmente per le cellule madri di una determinata età replicativa può quindi identificare se ci sono cambiamenti legati all'età nel tasso di mutazioni si accumulano. Variazioni di questo protocollo di base forniscono i mezzi per studiare l'influenza delle alterazioni nelle funzioni geniche specifiche ocondizioni ambientali specifiche in materia di accumulo mutazione ad affrontare i meccanismi alla base del genoma instabilità durante l'invecchiamento replicativo.

Introduzione

I microrganismi, come il lievito Saccharomyces cerevisiae, sono ottimi modelli per indagare tassi di mutazione, ma questi modelli non sono stati pienamente utilizzati per studiare l'accumulo di mutazioni durante l'invecchiamento mitotica delle cellule. L'accumulo di mutazioni nel genoma nucleare è stato ipotizzato di contribuire all'invecchiamento dal conseguente progressiva perdita di (o variazione) funzioni geniche ^1. La possibilità di utilizzare un sistema microbico per studiare i meccanismi e le conseguenze di accumulo di mutazioni durante l'invecchiamento potrebbe accelerare notevolmente l'identificazione di fattori genetici e ambientali che influenzano questo processo, a causa dei sistemi genetici facili e la facilità di quantificare rari cambiamenti fenotipici in microrganismi. Fattori di riparazione del DNA e le proteine ​​di risposta di danno del DNA sono ben conservati tra le specie diverse ^2, e similitudini fondamentali dell'invecchiamento organismal sono stati individuati per gli organismi diversi come S. cerevisiae und mammiferi ^3, il che rende probabile che i risultati ottenuti da studi in lievito saranno rilevanti per l'invecchiamento in molti organismi.

Studi di affinamento in S. cerevisiae fare uso di due modelli di invecchiamento che misurano l'invecchiamento cronologico o invecchiamento replicativo delle cellule. Invecchiamento cronologico è caratterizzata dalla progressiva perdita di vitalità in popolazioni di cellule di lievito che si trovano in uno stato (fase stazionaria) non-dividendo a causa di esaurimento degli elementi nutritivi ^3. Il modello di invecchiamento cronologico è stato utilizzato per dimostrare che le mutazioni si accumulano con l'aumentare di ⁴ anni, dal momento che le popolazioni di cellule di grandi dimensioni sono facilmente ottenuti in questo modello per eseguire le selezioni fenotipiche di cellule mutanti. In questo caso, l'accumulo di mutazione sembra essere influenzato da percorsi di crescita di segnalazione e di stress ossidativo ^5, e ciascuno di questi fattori è rilevante per la comprensione dell'invecchiamento negli eucarioti multicellulari ^3. Il modello di invecchiamento replicativo sfrutta l'divisi asimmetricaon tra S. madre e figlia cellule cerevisiae per indagare l'invecchiamento che si verifica con le generazioni di cellule successive ^3. Lievito invecchiamento replicativo è stata spesso misurata attraverso la micromanipolazione di piccole popolazioni di madre e cellule figlie, o, più recentemente, attraverso il video microscopio di piccole popolazioni di cellule di lievito in dispositivi microfluidici ^6,7. Dimensioni della popolazione limitati rendono questi approcci poco adatta per indagare l'accumulo di mutazioni durante l'invecchiamento mitotico a meno che le informazioni dell'intero genoma è ottenuto da cellule singole o cambiamenti genetici molto ad alta frequenza sono misurati ^8. Whole-sequenziamento del genoma di singole cellule fornisce set di dati sostanziali per indagare l'accumulo di mutazione, ma sistemi di selezione fenotipica hanno l'importante vantaggio di fornire un mezzo per misurare i tassi di mutazione per studiare i meccanismi alla base di accumulo mutazione. Studi per esaminare le frequenze di mutazione e tariffe attraverso selezioni fenotipiche in haploinon sono ancora stati segnalati ceppi di lievito d durante l'invecchiamento replicativo.

Tassi di mutazione sono comunemente misurati mediante test di fluttuazione ^9. Valori di frequenza di mutazione riflettono il numero totale di cellule che ospitano una mutazione in una sequenza genica in una popolazione. Questo include celle in cui si verificano mutazioni indipendenti e tutte le progenie di quelle cellule che semplicemente ereditano mutazioni preesistenti. Al contrario, i tassi di mutazione misurati mediante test di fluttuazione rappresentano il numero di mutazioni indipendenti che di recente si presentano con ogni generazione cellulare. Questi test coinvolgono tipicamente inoculando molte culture ripetute a densità cellulari bassa per ridurre la probabilità di aggiunta di cellule con preesistenti mutazioni in una sequenza bersaglio, in crescita le culture nei pressi di saturazione, e identificare le cellule mutanti dalla crescita su terreno selettivo. Il numero di cellule mutanti identificati nelle popolazioni replicati vengono poi utilizzati in uno dei diversi modelli matematici per stimare il numero di imutazioni INDIPENDENTI sorti durante la crescita ^9. Confrontando il numero di mutazioni indipendenti per la dimensione media della popolazione fornisce una misura del tasso di mutazione. In S. cerevisiae, frequenze di mutazione e le tariffe sono spesso misurata utilizzando i geni URA3 e CAN1, poiché la perdita-di-funzione mutazioni in questi geni producono fenotipi selezionabili. La perdita della funzione URA3 rende le cellule resistenti a 5-fluoroorotic acido (5-FOA), poiché la proteina codificata da URA3 converte 5-FOA in una molecola tossica ^10. La perdita della funzione di CAN1 permette alle cellule di diventare resistente ad canavanina, un analogo arginina tossico, dal momento che la proteina codificata da CAN1 trasporta arginina e canavanina in cellule ^11.

Entrambe le strategie di ordinamento genetici e fisici sono stati impiegati con successo per ottenere più grandi popolazioni di S. cellule madri cerevisiae che facilitano le indagini di invecchiamento replicativo. Strategie genetici includono approcci intelligenti che selezionano contro la sopravvivenza cellula figlia in una popolazione. Il programma di arricchimento madre (MEP) comporta l'induzione beta-estradiolo di espressione ricombinasi Cre solo nelle cellule figlie, che porta alla rottura specifico-figlia di due geni essenziali che sono stati progettati per contenere siti loxP ^12. Ceppi MEP possono essere coltivate normalmente in assenza dell'induttore, ma solo le cellule madri continueranno a dividersi dopo induzione, mentre cellule figlie arresteranno a M-fase tipicamente durante il primo progressione attraverso il ciclo cellulare ^12. Anche se questo sistema non è stato utilizzato per studiare ampiamente accumulo mutazione durante l'invecchiamento, è stato utilizzato per studiare la perdita di eterozigosi, una forma relativamente frequente di instabilità del genoma in ceppi di lievito diploidi, così come i cambiamenti biochimici nelle cellule madri invecchiamento ^13,14. Allo stesso modo, il sistema di figlia-scaricatore comporta-specifico espressione figlia del S. cerevisiae URA3 gene ^15. Ceppi Figlia-scaricatore crescono normalmente fino a 5-FOA viene aggiunto al mezzo, in cui le cellule che esprimono URA3 punto figlie moriranno, mentre le cellule madri continuano a crescere ^15. Sono sistemi utili per arricchire di cellule madri, ma dipendono mantenimento delle funzioni geniche che costituiscono il sistema di selezione. Mutazioni casuali in uno o più componenti del sistema di selezione potrebbe tradursi in cellule figlie che sfuggono la selezione e proliferano in maniera esponenziale. Durante lo sviluppo dei ceppi MEP, le dimensioni della popolazione appropriate erano determinati a evitare la comparsa di cellule figlie mutanti che potrebbero sfuggire la selezione ^12. Tuttavia, questo limite di dimensione della popolazione compromette l'individuazione di forme rare di genoma instabilità durante l'invecchiamento replicativo. Questa restrizione sulla dimensione della popolazione potrebbe essere in parte superato utilizzando ceppi di lievito diploidi con due copie di ogni gene contribuisce al sistema di selezione, poiché la maggior partemutazioni sarebbero probabilmente recessivo ^12. Tuttavia, l'uso di ceppi diploidi vincola i tipi di eventi mutazionali che possono essere facilmente rilevabili rispetto a quelli che possono essere facilmente individuati in cellule di lievito aploidi.

Strategie fisiche smistamento comprendono l'isolamento di cellule madri con una superficie cellulare etichettata cellule figlie senza etichetta per arricchire di grandi popolazioni di cellule madri. L'osservazione che le proteine ​​della superficie cellulare (proteine ​​di parete) di S. cellule figlie cerevisiae sono state recentemente sintetizzate durante germogliamento è stato sfruttato per etichettare le cellule madri senza etichettare le cellule figlie che producono ^16. Per esempio, una popolazione iniziale di cellule di lievito etichettati sulla loro superficie con biotina può coltivare e poi isolata dal loro cellule figlie utilizzando microsfere anti-biotina e magnetico smistamento ¹⁶ perché le cellule figlie generate dalla popolazione iniziale non conterranno biotina sulla loro superficie . Crescita seriale eordinamento consente popolazioni progressivamente più vecchie di cellule madri di ottenere e analizzati. Questa procedura è stata utilizzata con successo per esaminare i cambiamenti nella fisiologia cellulare e l'espressione genica durante l'invecchiamento replicativo di lievito ^13,14,17,18. Il metodo attuale si adatta questa etichettatura biotina e cernita magnetica per arricchire di cellule madri con lo scopo di misurare l'accumulo di mutazioni potenzialmente rare o di altre forme di instabilità del genoma analizzati attraverso selezioni fenotipiche. Crescita seriale e smistamento fisica consentono l'analisi di accumulo di mutazioni in cellule madri progressivamente più anziani, così come nelle loro popolazioni di cellule figlie. Determinazione dei tassi di mutazione per generazione consente una frequenza di mutazione previsto da calcolare per le cellule madri che hanno subito un particolare numero di divisioni cellulari. Poiché i valori di frequenza attesi sono basati sul previsto aumento a causa di turni aggiuntivi di divisione cellulare, scostamenti sostanziali nei mutati osservatisu frequenze rispetto ai valori previsti fornire la prova per le modifiche specifiche per età del tasso di mutazioni si accumulano. Usando questo protocollo, colorazione fluorescente di cicatrici gemma che corrispondono ai siti di divisioni cellulari in cellule madri accoppiate con l'analisi mediante citometria a flusso può essere utilizzato per determinare rapidamente la distribuzione per età delle popolazioni ordinati e non ordinati. Reagenti fluorescenti aggiuntivi, come ad esempio quelli utilizzati per il rilevamento di specie reattive dell'ossigeno, possono essere utilizzati anche durante questo protocollo. Nel complesso, questo protocollo consente l'analisi efficiente dei cambiamenti età-dipendenti genoma instabilità con il potenziale di correlazione legate all'età cellulari cambiamenti fisiologici in un organismo modello ben si adatta allo studio dei fattori genetici e ambientali che influenzano l'instabilità del genoma di invecchiamento legati.

Protocollo

1 Preparazione di mezzi e soluzioni

1. Crescere cellule utilizzando estratto di lievito-peptone-glucosio (YPD) ricco mezzo per il protocollo standard. Preparare un Bacto-peptone 2%, estratto di lievito 1%, soluzione di glucosio al 2% per YPD media e aggiungere 2% Bacto-agar per terreno solido ^19. Autoclave per la sterilizzazione. Utilizzare un mezzo alternativo, se necessario, per verificare una particolare condizione di crescita o ceppo di lievito mutante.
2. Fai solido terreno completo sintetico privo di arginina con 60 mg / L canavanina (SC-arg + canavanina) per selezionare mutanti resistenti canavanina. Preparare una soluzione che è 0,67% Bacto-lievito base di azoto, senza aminoacidi, 2% di glucosio, 0,2% miscela completa senza supplemento di arginina (mix di abbandono), e il 2% Bacto-agar ^19. Autoclave e fredda prima di aggiungere canavanina da un / ml di soluzione di 20 mg (filtro sterilizzato, conservato a 4 ° C) ^19.
   1. Fai solido terreno completo sintetico contenente acido 5-fluoroorotic (5-FOA). Preparare 500ml di una soluzione 1,34% Bacto-base azotata di lievito senza amminoacidi, 4% di glucosio, 0,4% miscela completa supplemento, e 0,2% 5-FOA e filtro-sterilizzare ^19. Autoclave 500 ml di una soluzione di Bacto-agar 4%, brevemente raffreddare, e poi mescolare con la soluzione nutritiva, sterilizzata per filtrazione da 500 ml. Utilizzare appropriati mezzi alternativi per altri test di mutazione.
3. Per l'etichettatura biotina, fare 500 ml 1x fosfato soluzione salina tamponata (PBS) contenente 137 mM di cloruro di sodio, cloruro di potassio 2,7 mM, 10.14 mM sodio fosfato bibasico, e 1,77 mM potassio fosfato bibasico, pH 8 Conservare a 4 ° C e continuare a ghiaccio durante l'uso.
4. Fare un fresco 5 mM biotina magazzino in sterile, acqua ultrapura.
5. Per placare l'etichettatura biotina, fare 500 ml di PBS 1x, glicina 100 mM. Conservare a 4 ° C e tenere in ghiaccio durante l'uso.
6. A seconda del numero di cellule utilizzate e durata dell'esperimento, fare 1-2 L di tampone branello-etichettatura contenente PBS 1x, 2 mM EDTA, 0,5% Bovine albumina sierica. Filtro sterilizzare e buffer di de-gas. Conservare a 4 ° C e tenere in ghiaccio durante l'uso.
7. Preparare una soluzione allo 0,4% trypan blu in 1x PBS, filtro sterilizzare e conservare a temperatura ambiente per l'utilizzo nelle misure vitalità cellulare.
8. Aliquota piccoli volumi (~ 100 microlitri) di un agglutinina germe di grano (WGA) coniugato fluorescente a conservare a -20 ° C in imballaggio leggero (o opachi) microprovette da utilizzare nel determinare l'età delle cellule.

2 Determinazione del Tasso di mutazione e frequenza

1. Stabilire un tasso di mutazione di base per la generazione di cellule utilizzando test di fluttuazione di cellule cresciute in condizioni di coltura standard. Crescere sette alle undici replicare 1 ml culture da una densità iniziale di 1.000-5.000 cellule / ml ai primi di fase stazionaria (~ 10 ⁸ cellule / ml).
   1. Per ogni cultura replica, diluire le cellule 1: 2.000 e diffondere 1-4 microlitri su terreno non selettivo (YPD) per determinare formante colonia-unità / ml. Pellet cellule rimanendo a ~ 2.400 xg per 1 min in una microcentrifuga e risospendere in 100 ml di acqua di diffondersi su terreno selettivo per identificare i mutanti. Incubare le piastre per tre giorni a 30 ° C prima di contare le colonie (regolare il tempo di incubazione, se necessario sulla base del tasso di crescita delle cellule).
   2. Determinare il numero di mutazioni indipendenti (m) che si sono verificati nel processo in base al numero di colonie mutanti (r) ottenuti su terreno selettivo. Utilizzare lo stimatore mediana Lea-Coulson per trovare m sostituendo il numero medio di colonie mutanti per r nella formula sotto ^9. Poi sostituire i valori per m finché il lato sinistro dell'equazione è praticamente nulla.
      
   3. Per determinare il tasso di mutazione, prima di calcolare il numero medio di cellule vitali sparsi sul terreno selettivo moltiplicando il formante colonia-unità / ml media delle culture replicare e il volumedella cultura nella diffusione ml su terreno selettivo. Dividere il valore m dal punto 2.1.2 da questo numero medio di cellule vitali per ottenere il tasso di mutazione per generazione di cellule.
2. Calcolare autonomamente il numero di cellule vitali sparsi sul terreno selettivo per ogni cultura replica in un processo come descritto al punto 2.1.3. Dividere il numero di colonie mutanti (r) ottenuti per una cultura per il numero di cellule vitali sviluppa su terreno selettivo per ottenere la frequenza di mutazione. Utilizzare la media o la mediana delle singole frequenze di mutazione dalle culture ripetute nel passaggio 2.1 come frequenza di mutazione basale.
3. Effettuare misure di frequenza, prima e dopo che le cellule di etichettatura biotina (passi 3.2 e 3.4) per determinare se i risultati di etichettatura passo di qualsiasi cambiamento nella frequenza delle mutazioni che dovranno essere prese in considerazione durante la verifica per le modifiche età-specifici in accumulo di mutazioni.

3 Biotina Etichettatura

1. Streak S. cerevisiae da uno stock di glicerolo a -80 ° C su YPD media e incubare a 30 ° C per 1-3 giorni.
2. Usando una pipetta sterile, trasferire le cellule dalla piastra striscia di 1 ml (o più) di acqua, tenendo presente che 1-1,5 cm di una porzione fittamente coltivato della striscia darà circa 10 ⁸ cellule. Determinare la densità esatta delle cellule utilizzando un emocitometro.
3. Etichetta 10 ⁸ cellule per ceppo (o condizione di trattamento) per punto di raccolta in cui sarà determinata la frequenza di mutazione o di un numero di abitanti sufficiente per ottenere almeno 5-10 colonie mutanti per il campionamento sul terreno selettivo (in base alla frequenza di mutazione dal punto 2.2). Includere un ulteriore 10 ⁸ celle per misurazioni di base per ceppo / condizione.
4. Etichetta biotina secondo la procedura standard dal produttore, ad eccezione di utilizzare un 5 mM reagente biotina magazzino e scuoterla delicatamente durante l'incubazione. Spin per 5 minuti a 4 ° C a 3000 xg per tutte le fasi di centrifugazione, sInce filatura a temperature superiori a 4 ° C può portare ad una maggiore perdita di cellule. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendere le cellule ad una concentrazione di 10 ⁸ etichettati cellule / ml in acqua.
5. Controllare la vitalità delle cellule utilizzando trypan colorazione blu. Diluire 10 ml di cellule con 23 ml di acqua e 67 ml di 0,4% trypan blu in 1x PBS. Incubare per almeno 40 minuti a temperatura ambiente prima di segnare dal vivo (non colorati) e morti (colorati), le cellule utilizzando un emocitometro.
6. Misurare i valori di base per l'instabilità del genoma, l'età delle cellule, e le altre caratteristiche rilevanti (vedere paragrafi 5, 6 e 7).
7. Trasferire le cellule biotina marcata a 20 ml di YPD media per 10 ^{a 8} celle in una beuta (circa 5 x 10 ⁶ cellule / ml). Far crescere la cultura (s) 16-18 ore a 20 ° C per una densità approssimativa di 10 ⁸ cellule / ml (4-5 generazioni cellulari), ma non consentono di raggiungere le cellule fase stazionaria. Utilizzare un tempo di incubazione più breve per la crescita a 30 ° C. Tenere biotina marcata con cells a 4 ° C fino a diverse ore prima di essere aggiunti alla media, se aveva bisogno di ottimizzare i tempi del periodo di crescita e di raccolta.

4. Bead Etichettatura e ordinamento magnetico

1. Dopo la fase di crescita, diluire un'aliquota di coltura per determinare la densità delle cellule utilizzando un emocitometro. Cellule pellet di centrifugazione per 5 minuti a 4 ° C a 3.000 x g. Eliminare il surnatante.
2. Lavare le cellule vortex per sospendere pellet in 30 ml di tampone bead-etichettatura, centrifugazione e poi versare il surnatante come nella sezione 4.1. Ripetere il lavaggio.
3. Completamente risospendere le cellule in 50 microlitri di buffer bead-etichettatura per 10 ⁸ cellule totali nel vortex. Aggiungere 2 ml sfere magnetiche per 10 ^{a 8} cellule totali e vortice brevemente per mescolare. Incubare in ghiaccio per 10 minuti, invertendo periodicamente a mescolare (modificato da un protocollo online all'indirizzo http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf </ A>).
4. Lavare le cellule tre volte con 30 ml di tampone bead-etichettatura.
5. Aggiungere 0,5 ml di tampone bead-etichettatura per 10 ⁸ cellule totali e brevemente vortice pellet su un'impostazione media solo fino a quando le cellule sono risospese. Versare attraverso un colino cella di 40 micron in un tubo da 50 ml per rimuovere eventuali grumi di cellule rimanenti. Se necessario, lasciare le cellule in ghiaccio per 1-2 ore prima del carico sulla colonna.
6. Seguire protocollo raccomandato dal costruttore per le colonne magnetiche per legare, lavare, ed eluire le cellule madri tallone marcato magnetici. Per aumentare il recupero delle cellule marcate, utilizzare almeno una colonna per 2 x 10 ⁹ cellule totali.
   1. Rimuovere eventuali bolle che si verificano durante il caricamento di colonne, in quanto saranno bloccare il flusso. Rimuovere e sostituire la colonna sul separatore tra un lavaggio per impedire alle cellule di diventare intrappolati tra le perle (modificato da un protocollo online su http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf).
   2. Salva fluire dalle fasi vincolanti e lavaggio di analizzare giovani cellule prodotte dalle cellule madri, se lo si desidera. Concentrato cellule come descritto al punto 4.7.
   3. Utilizzare separatori multi-colonna per il trattamento più campioni in una sola volta. Eluire più colonne dello stesso campione nella stessa provetta di raccolta per ridurre il tempo di trattamento e diminuiscono la perdita di cellule.
7. Concentrato cellule madri eluiti mediante centrifugazione a 3000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare tutto ma 1 ml di tampone per 10 ^{a 8} celle marcati con biotina originali. Vortex brevemente per sospendere le cellule in tampone rimanente.
8. Diluire un'aliquota di cellule e macchia blu trypan per determinare la densità cellulare e la vitalità delle cellule utilizzando un emocitometro (vedere il punto 3.5). Calcolare il numero totale di cellule recuperate.
   1. Se il numero delle cellule è notevolmente più elevato del previsto, passare il campione di eluizione attraverso un'altra colonna per cercare di rimuovere contaminanti cellule giovani.Se il numero di celle è sostanzialmente inferiore al previsto, passare il flusso salvati attraverso campione attraverso un'altra colonna per cercare di migliorare il rendimento delle cellule madri.
9. Utilizzare cellule per ulteriori analisi, come descritto nelle sezioni 5 e 6 In alternativa, far crescere le cellule in YPD brodo ancora per aumentare la loro età replicativa (passo 3.7) e seguire, mediante l'etichettatura tallone e smistamento (gradini 4.1-4.8.1), senza il necessario ripetere l'etichettatura biotina.

5 Determinazione del replicativo Age

1. Spin cellule per 2 minuti a 5000 xg a temperatura ambiente per tutti i passaggi in questa sezione. Mettere 25 ml di cellule recuperate (~ 10 ⁸ cellule / ml) in una provetta da 1,5 ml per centrifuga e lavare due volte con 1 ml di PBS 1X. Aspirare il surnatante.
   1. Scongelare una aliquota di WGA-coniugato, vortice per mescolare e girare brevemente per eliminare aggregati proteici. Sospendere le cellule in 180 microlitri 1x PBS e 20 ml di WGA coniugati con una molecola fluorescente per etichettare le cicatrici gemma sulla superficie di thcellule e. Coprire la provetta da 1,5 ml per centrifuga con pellicola e incubare con una leggera oscillazione a 30 ° C per 30 min.
   2. Lavare tre volte con 1 ml di PBS 1X.
2. Per la microscopia a fluorescenza, scivoli etichette e montare secondo la procedura standard con un agente anti-fade. Curare completamente i vetrini al buio (fino a un paio di giorni) prima coprioggetto di tenuta per evitare il movimento delle cellule durante l'imaging. Contare cicatrici gemma su almeno 50 cellule per campione per ottenere una misura rappresentativa di età cellulare. Conservare i vetrini per un massimo di 1 mese per la visualizzazione di cicatrici gemma, se necessario.
   1. In alternativa, determinare l'intensità del segnale fluorescente dal WGA-coniugato eseguendo citometria a flusso su cellule in sospensione in 1 ml di PBS 1x dopo passo 5.1.2. Utilizzare un laser di eccitazione 405 nm e 530/30 filtro nm emissione con un filtro passaggio lungo 505 nm per WGA-Alexa 488 Includere un controllo senza macchia per ogni punto di raccolta.
3. Cicatrici germoglio grafico sulle cellule giovani e le cellule invecchiate contate al microscopio sulasse y contro la media geometrica normalizzata (tinto media geometrica / incolori media geometrica) della fluorescenza WGA-coniugato dalle stesse popolazioni cellulari sul asse x. Ottenere l'equazione di una linea di tendenza lineare per questo rapporto. Per gli esperimenti successivi, sostituire la media geometrica normalizzata di WGA-coniugato intensità di fluorescenza di una popolazione di cellule di x nell'equazione e risolvere per y per determinare l'età cella media di un campione.

6 Mutazione Frequenza

1. Diffusione allineati cellule madri risospese in un tampone dal passo 4,7 su terreno YPD e terreno selettivo come descritto al punto 2.1.1. Utilizzare 1 ml di cellule madri risospese per celle di media e di spin selettivi a 5.000 xg per 1 min.
   NOTA: Diffusione grandi quantità di cellule diluite su terreno YPD come cellule aumentano di età per compensare un numero crescente di cellule non vitali e senescenti nelle popolazioni anziane.
   1. Incubare YPD media e piastre di terreno selettivopunto 6.1 a 30 ° C per 3 e 4 giorni, rispettivamente. Aumentare il tempo di incubazione fino a una settimana per molto vecchie cellule o dei geni lenta crescita. Calcolare la frequenza di mutazione, come descritto al punto 2.2.

7 Calcolo prevista frequenza di mutazione di Age replicativo Data

1. Calcola l'aumento medio dell'età replicativa delle cellule biotina marcata nel corso dell'esperimento sottraendo l'età media della popolazione di cellule iniziale dall'età media delle cellule madri ordinati per il tipo in questione. Utilizzare i secoli cellulari calcolati al punto 5.2 o punto 5.2.2.
2. Moltiplicare il tasso di mutazione ottenuto nel passaggio 2.1.3 con l'aumento dell'età media delle cellule calcolata al punto 7.1. Aggiungere questo valore per la frequenza di mutazione basale per la popolazione iniziale calcolata nel passo 2.2 per determinare la frequenza di mutazione previsto per le cellule dell'età replicativa pertinente.

Risultati

Un diagramma di flusso in Figura 1 mostra i passi complessivi della procedura, compresi i punti in cui i tassi di mutazione, le frequenze, e l'età delle cellule vengono misurate. Determinare con precisione la frequenza e il tasso di mutazioni (o altra forma di instabilità del genoma) in popolazioni di cellule giovani è un primo passo importante, dal momento che è necessario per la scelta di una dimensione della popolazione adeguata per l'etichettatura e smistamento magnetico. Valori della frequenza possono essere stabiliti mediante test di fluttuazione ^9. Risultati di esempio per ceppi di lievito in background genetico BY4741 ²⁰ selezionati per mutazioni nel gene CAN1 che conferiscono resistenza canavanina o mutazioni nel gene URA3 che conferiscono resistenza alla 5-FOA sono illustrati nella Figura 2. Le cellule sono state coltivate a 20 ° C per il rappresentante esperimenti di tasso, e a 20 ° C e 30 ° C per esperimenti di frequenza rappresentativi. Queste temperature sono stati utilizzati perché popolazioni di cellule iniziali coltivatea 30 ° C sono stati poi coltivati ​​a 20 ° C per i successivi esperimenti rappresentativi ordinamento. Valori della frequenza di prove indipendenti erano paragonabili per la popolazione di cellule iniziale e cellule dopo l'etichettatura biotina per un ceppo che ha il gene CAN1 nella sua posizione normale sul cromosoma V, circa 32 coppie kilobase dal telomero del braccio sinistro ( www.yeastgenome.com ) ( Figura 2A, colonne lavanda). Il tasso di mutazione di CAN 1 è sostanzialmente più elevata nelle popolazioni iniziali di un secondo ceppo di lievito che ha una delezione del gene CAN1 dalla sua posizione normale sul cromosoma V e un inserimento di CAN1 sul braccio destro del cromosoma VIII circa 25 coppie kilobase dal telomero ²¹ (Figura 2B). CAN1 frequenze di mutazione del gene erano anche confrontabili per popolazioni di cellule iniziali e cellule biotina marcato alle due temperature di crescita (Fifigura 2A, colonne blu). Tuttavia, le frequenze di mutazione ottenuti a 20 ° C sono risultati essere superiori frequenze di mutazione a 30 ° C. Per verificare se questo effetto della temperatura è stato limitato al gene CAN1, abbiamo misurato le mutazioni in URA3 selezionando per la resistenza al 5-FOA utilizzando il ceppo di lievito che ha CAN1 inserito sul cromosoma VIII. Questo ceppo ha anche una delezione di URA3 dal suo sito normale sul cromosoma V e un inserimento di URA3 sul braccio destro del cromosoma VIII circa 40 coppie kilobase dal telomero ^21. Frequenze di mutazione sono stati anche superiori a 20 ° C per URA3 in questa posizione cromosomica (Figura 2C). Nel complesso, questo dimostra che la temperatura di crescita può influenzare la frequenza delle mutazioni, ma etichettatura biotina non sembra influenzare la frequenza di mutazione. Di conseguenza, i tassi di mutazione e frequenze per le popolazioni iniziali devono essere determinati nello stesso tempe crescitaratura che verrà utilizzato per cicli di crescita e di smistamento. Si consiglia di verificare che l'etichettatura biotina non influenza genoma instabilità prima di utilizzare il protocollo per studiare altri tipi di mutazioni o riarrangiamenti del genoma.

Come previsto, i valori del tasso di mutazione mostrati nella Figura 2A sono diverse volte inferiori rispetto ai corrispondenti misure di frequenza. Questa differenza si verifica perché tasso di mutazione misura la comparsa di cellule con nuove mutazioni con ogni turno di divisione cellulare, mentre le misure di frequenza di mutazione il numero cumulativo di cellule mutanti nella popolazione alla fine del periodo di crescita. Le tariffe e gli intervalli di confidenza al 95% per questi studi dimostrano che i risultati riproducibili possono essere ottenuti utilizzando sette culture repliche per prova, che è il numero minimo di repliche suggerito per questo protocollo.

Una volta che i valori di frequenza e velocità iniziali sono determinati, una dimensione della popolazione dovrebbe essere chOsen che assicura che le cellule adeguate sono presenti dopo vari cicli di smistamento per determinare in modo affidabile le frequenze di mutazione. Etichettare una popolazione di 10 ⁸ cellule per punto di tempo che deve essere analizzato durante l'invecchiamento è appropriato quando le frequenze e le tariffe sono simili a quelli mostrati nella Figura 2A. Questa decisione dipende anche da quanto efficientemente etichettati madre cellule vengono recuperati dopo ogni turno di smistamento. L'efficienza di recupero di cellule madri etichettati può essere rapidamente e semplicemente valutata utilizzando un emocitometro per determinare il numero di cellule eluiti dalle colonne per ogni tipo e per esaminare la morfologia cellulare. Due punti principali sono illustrati dai dati di efficienza esempio di recupero (Figura 3a): il numero di cellule recuperate possono apparire superiore alle attese dopo il primo tipo, e una piccola perdita progressiva di cellule è previsto con costante ordinamento. Il numero maggiore del previsto delle cellule in alcuni esperimenti dopo il primo tipo potrebbe result dall'etichettatura di gemme sulle cellule nella popolazione iniziale. Una cellula di lievito con una gemma viene in genere valutato come una singola cellula per determinare il numero di celle per etichettare con biotina. Etichettatura di gemme presenti nella popolazione iniziale, però, permetterebbe alle cellule che si sviluppano da quelle gemme da conservare anche su colonne di cernita. L'influenza di questo evento sulla determinazione dell'efficienza recupero dipende dalla frazione di cellule germogliate nella popolazione di cellule iniziale. Una seconda ragione potenziale per il numero di cellule più alto dopo sort è che tende ad essere più grandi cellule germogliate a questo punto tempo che può essere completando la divisione cellulare durante l'ordinamento. Come risultato, le grandi gemme ancora attaccati alle loro cellule madri possono essere ordinati, ma poi appaiono come cellule distinte quando si esaminano le cellule eluiti. Mentre alcuni la perdita di cellule si osserva con ogni turno di crescita e di smistamento, il protocollo può causare ritenzione affidabile del 80-90% delle cellule dopo ogni turno di sOrting. Vale la pena lo sforzo per praticare la procedura volta a garantire che l'80% o più delle cellule marcate vengono isolate per evitare la necessità di etichettare un inutilmente grande popolazione di cellule iniziale. Il trattamento di cellule con uno stress lieve dopo il primo tipo (1 mM di perossido di idrogeno in YPD medio per 30 min) non ha impedito il recupero efficiente di cellule con continui cicli di crescita e di smistamento, anche se c'era una certa variabilità nel recupero per il primo ordine stress (Figura 3A).

Ispezione della morfologia cellulare e la vitalità sono anche utile sia per confermare il successo isolamento di cellule madri e per l'adeguamento diluizioni / volumi utilizzati quando la diffusione delle cellule su terreno non selettivo per determinare la densità di unità che formano colonie. Cellule madri diventano sempre più grandi e di forma irregolare come l'età, rispetto alle cellule figlie (Figura 3B). I campioni di cellule madre dovrebbero quindi consistere principalmente di grandi dimensioni, irregularly a forma di cellule come l'esperimento procede attraverso ogni round di smistamento. La presenza di molte piccole cellule ovali di forma regolare potrebbe indicare che le cellule madri non sono adeguatamente separati dalle cellule figlie. La vitalità delle cellule madri dovrebbe aumentare progressivamente declinare con ogni turno di crescere e di smistamento, anche se potrebbe non esserci molti cambiamenti durante i primi 5-10 generazioni cellulari. Il numero di cellule capaci di colonie formanti può diminuire molto più drasticamente rispetto al numero di cellule che sono determinati per essere praticabile da qualche forma di colorazione diretta per l'integrità delle cellule, dovuto alla formazione di cellule senescenti. Quando vitalità da un metodo di colorazione diretta prima comincia a declinare (circa l'80% o meno), potrebbe essere necessario regolare diluizioni e volumi utilizzati per misurare la densità di unità formanti colonia in previsione di un calo più drammatico nella capacità delle cellule vitali per colonie di forma (un due a vari diminuzione volte).

Iletà replicative delle popolazioni ordinati e le popolazioni di controllo devono essere determinati prima che i dati di frequenza di mutazione di cellule madri possono essere analizzati per i cambiamenti specifici per età del tasso di mutazioni si accumulano. Ciò può essere realizzato attraverso il conteggio manuale delle cicatrici gemma su cellule madri (Figura 4) o mediante citometria a flusso per quantificare il segnale per il reagente di rilevamento gemma cicatrice (Figura 5). Bud cicatrici possono essere etichettati con relativamente basso segnale di fondo utilizzando WGA-fluorescente coniugati (Figura 4C). Figura 4A mostra che la maggior parte delle cellule del flusso attraverso campioni della procedura di smistamento avere zero o un germoglio cicatrice. Le cellule eluiti dalle colonne sono per lo più cellule madri di età (Figure 4b e 5). In genere,> 90% delle cellule eluite sono cellule madri, che può essere visto più facilmente dalla citometria a flusso risultato in Figura 5. Celle con relativamente poche cicatrici gemma (<6) OBTained dopo più di due cicli di smistamento potrebbero rappresentare le cellule contaminanti che non sono stati etichettati biotina che ha subito un paio di cicli di divisione cellulare durante il relativo periodo di crescita, al contrario di cellule madri che si dividono molto lentamente. La variazione in età cella può aumentare con i successivi cicli di smistamento, se non tutte le cellule nella popolazione sono in crescita uniforme.

Una popolazione di cellule più grande può essere utilizzato in modo più rapido per valutare l'età cella se si stabilisce una relazione lineare tra intensità di segnale WGA-fluorescenza e il numero di cicatrici gemma per cella. Per questa analisi, la normalizzazione di tutte le intensità di segnale WGA-fluorescenza si ottiene dividendo il segnale delle cellule colorate dal segnale ottenuto per la popolazione appropriata senza macchia di cellule (figlia o madre) per tenere conto di una maggiore fluorescenza di fondo nelle cellule vecchie. Figure 4 e 5 mostra l'analisi delle stesse popolazioni cellulari rappresentativi.Conteggio manuale istituito età media replicative di 0.95 e 11.4 per la cellula figlia (Figura 4A) e popolazioni di cellule madre (Figura 4B), rispettivamente. Normalizzati WGA-segnali di queste due popolazioni e le tre popolazioni addizionali (età media di 3.0, 6.9 e 14.4) sono stati tracciati contro il numero medio di cicatrici gemma per ogni popolazione (Figura 5B). Questa relazione lineare può quindi essere utilizzato con lo stesso ceppo e reagenti in futuri esperimenti per determinare l'età media delle cellule dal normalizzata WGA-segnale ottenuto mediante citometria a flusso, permettendo la determinazione rapida e precisa dell'età delle cellule. Popolazioni di controllo devono ancora essere inclusi per verificare l'efficienza di colorazione simili tra prove.

L'influenza dell'età sulla accumulo di mutazioni può essere affrontata una volta i passi precedenti per ottenere valori di tasso di mutazione, in modo efficiente l'ordinamento delle cellule, e determinando le età cellulari sono realizzate. Il number di punti di tempo in cui la frequenza può essere determinata dipende dalla dimensione della popolazione cellulare marcato con biotina e il numero di cellule che devono essere sparsi sul terreno selettivo per ottenere risultati affidabili. Se variazioni dei tassi di mutazione con l'età, quindi le frequenze di mutazione osservata per l'invecchiamento cellule madri dovrebbero essere diverse da quelle attese basata esclusivamente su turni aggiuntivi di divisione cellulare. Confronto tra la frequenza di mutazione osservata per la frequenza di mutazione predetto in grado di identificare le differenze legate all'età del tasso di mutazioni si accumulano. Come descritto nel paragrafo 7 del protocollo, la frequenza prevista può essere ottenuto dal prodotto del tasso di mutazione di base per la popolazione di cellule iniziale e l'aumento dell'età replicativa delle cellule aggiunti alla frequenza di mutazione per la popolazione iniziale madre. Incrementi di CAN1 frequenza di mutazione sono stati osservati con maggiore dell'età media delle cellule in un ceppo con CAN1 nella sua posizione normale sul cromosoma V(Figura 6A) e in un ceppo con CAN 1 sul braccio destro del cromosoma VIII (Figura 6B). Dal momento che le frequenze di mutazione osservate per le cellule madri in Figura 6A sono simili o appena sotto le frequenze previste, i dati non forniscono alcuna prova di un cambiamento di età-specifica di tasso di mutazione. Al contrario, le frequenze di mutazione per le cellule madri del ceppo con CAN1 sul cromosoma VIII erano superiori alle frequenze previste (Figura 6B). Si noti che le frequenze previste nel grafico non sembrano aumentare molto perché una scala logaritmica doveva essere utilizzato per l'asse y causa del forte aumento della frequenza di mutazione osservata. Pertanto, i risultati in Figura 6B forniscono prove a sostegno di un aumento età-specifica del tasso di mutazioni si accumulano. La differenza nei risultati per i set di dati in Figura 6A e 6B è probabilmente dovuto alla diffe affittare posizioni genomiche di CAN1. Questi tipi di osservazioni forniscono un punto di partenza per lo sviluppo di ipotesi per studiare i meccanismi che influenzano i tassi di mutazione, come le cellule di età e di sviluppare modelli per spiegare l'accumulo di mutazioni con l'età replicativa.

Figura 1 Schema di flusso della procedura generale per l'esame di accumulo di mutazioni durante lievito invecchiamento replicativo. Testo nero e le frecce indicano le principali fasi della procedura. La freccia curva riflette il fatto che giri supplementari di ricrescita e smistamento delle stesse cellule sono utilizzate per ottenere cellule progressivamente più anziani. Frecce viola e testo indicano nelle fasi in cui vengono eseguite le misure indicate. Freq - frequenza.

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Figura 2 Determinazione della frequenza di mutazione e di tasso in popolazioni di cellule giovani. (A) colonie mutanti sono stati selezionati attraverso la diffusione di celle SC-arg + medio canavanina di selezionare per la perdita-di-funzione mutazioni nel gene CAN1 e rispetto al numero totale di cellule vitali sparsi sul terreno selettivo per calcolare frequenze / tariffe. Le cellule da popolazioni iniziali prima di etichettatura biotina (IP) o dopo etichettatura biotina (PB) sono state coltivate utilizzando YPD media da una densità iniziale di 5.000 cellule / ml fino a saturazione. Colonne lavanda indicano la misurazione della frequenza e le colonne blu rappresentano misure di frequenza effettuate a temperature indicate (20 ° C e 30 ° C). Set di sette culture ripetute sono state coltivate per ogni prova e sono stati effettuati 2-5 prove indipendenti. I valori dei tassi individuali calcolati per prove indipendenti sono mostrati, e barre di errore per questi studi rappresentano gli intervalli di confidenza 95% determinanod utilizzando un calcolatore online ^22. Frequenze rappresentano medie e deviazioni standard. Tariffe (B) mutazione CAN1 ottenuti e rappresentati come descritto per la parte A utilizzando un ceppo con CAN1 sul braccio destro del cromosoma VIII. Frequenze (C) mutazione ottenuti seguito di selezione per le colonie mutanti, il 5-FOA utilizzando un ceppo con il gene URA3 situato sul braccio destro del cromosoma VIII. Metodi erano altrimenti come per la parte A, e le medie e le deviazioni standard per tre o quattro prove indipendenti sono mostrati.

Figura 3 Esempio di ordinamento di efficienza determinato calcolando il numero di cellule eluiti dopo ogni turno di smistamento. (A) Il numero totale di cellule in ogni popolazione di partenza dopo l'etichettatura biotina è stato impostato su uno, e la t otale numero di cellule presenti nei campioni eluiti da ogni turno di smistamento cellulare magnetico è stato diviso da quei valori iniziali per ottenere la frazione di cellule marcate. Numero di cellule totali sono stati determinati dal conteggio delle cellule ottenute utilizzando un emocitometro. Colonne arancioni rappresentano la media e la deviazione standard per tre prove indipendenti seguendo il protocollo standard. Colonne blu rappresentano la media e la deviazione standard per due prove indipendenti in cui le cellule sono state trattate con 1 mM di perossido di idrogeno per 30 minuti subito dopo il primo tipo. (B) Dimensioni e morfologia delle cellule dopo etichettatura biotina (post-biotina) e cellule madri recuperato dopo il terzo turno di smistamento magnetico (ordinamento 3 cellule madri) indicato con un microscopio a campo chiaro standard ed un obiettivo 20X. Righe bianche in gli sfondi sono delle linee che delimitano i più piccoli quadratini visibili su un emocitometro standard.k "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 Determinazione di età replicativa mediante strumenti manuali conteggio gemma cicatrice. Microscopia confocale è stato usato per contare le cicatrici gemma su singole celle marcate con un coniugato WGA-fluorescenza (eccitazione a 488 nm e di rilevamento con banda passante 458/543 nm e 505 nm lungo lancio combinazione di filtri). (A) Manuale conta gemma cicatrice di cellule dal flusso attraverso (cellule figlie) dopo il terzo turno di ordinamento magnetico (n = 62). (B) Bud Manuale cicatrice conta delle cellule eluite (cellule madri) a seguito della terzo turno di ordinamento magnetico (n = 54). (C) cellule madri mantenuti dopo il terzo turno di ordinamento magnetico fotografato utilizzando un obiettivo ad immersione in olio 63X con zoom 3X dopo colorazione witha coniugato WGA-fluorescente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5 Determinazione di età replicativa in citometria a flusso. Campioni di 10.000 cellule colorate con un coniugato WGA-fluorescenti sono stati analizzati mediante citometria di flusso con eccitazione a 488 nm e di rilevamento con una banda passante 530/30 e 505 lungo set di filtri passa. (A ) Istogrammi raffiguranti il numero di cellule con specifici intensità di WGA-fluorescenza per una popolazione di cellule figlia o l'eluato (cellule madri) dopo tre turni di ordinamento magnetico. Popolazioni corrispondono a quelle analizzate nella Figura 4. Linee verticali blu indicano la posizione corrispondente per la maggior parte del Daucellule figlia con sull'istogramma cellula madre. (B) La media geometrica normalizzato per il segnale di fluorescenza di ogni popolazione mostrato in A e tre di popolazione addizionale di cellule (età media 3,0, 6,9 e 14,4) è stato calcolato come il rapporto tra la media geometrica dei le cellule colorate e la media geometrica della popolazione di cellule senza macchia appropriato. Questi valori sono tracciati rispetto al numero medio di cicatrici germoglio per ogni popolazione totale (Figura 4 e dati non mostrati). Il valore di R ² per la linea di tendenza di questo confronto è dato sul grafico.

Figura 6 Confronto tra le frequenze di mutazione previsti e osservati durante l'invecchiamento replicativo. Cellule con mutazioni nel gene CAN1 sono stati selezionati come descritto per la Figura 2 Strug ceppi con CAN1 a sua posizione normale sul cromosoma V (A) o sul braccio destro del cromosoma VIII (B). Le cellule sono state coltivate su terreno solido a 30 ° C prima dell'etichettatura biotina e successivamente a 20 ° C. Valori di frequenza osservati sono indicati con colonne arancioni (OB) e le frequenze previste per cellule invecchiate sono visualizzabili con colonne marroni (Pre). La prima colonna di ogni grafico mostra la media e la deviazione standard della frequenza di mutazione iniziale dopo l'etichettatura biotina per quattro prove indipendenti (PB). Numeri sotto le colonne indicano il numero medio di cicatrici gemma per ogni popolazione (Cell Age). Valori predetti indipendenti sono stati determinati come descritto nella sezione 7 del protocollo con ciascuno dei valori di tasso iniziali illustrati nella Figura 2A (colonne IP) e 2B. Questi valori indipendenti sono stati poi mediati. I valori osservati sono mezzi di tre prove. Le barre di errore indicano la deviazione standard.

Discussione

Questo protocollo combina diversi metodi per attivare risorse e approcci disponibili in Saccharomyces cerevisiae sistema modello da applicare efficacemente allo studio del genoma instabilità durante l'invecchiamento cellulare mitotica. Una vasta gamma di test per quantificare le diverse forme di instabilità del genoma attraverso la selezione fenotipica può essere combinato con l'ordinamento magnetica per studiare i possibili cambiamenti età-specifici in accumulo di particolari forme di mutazioni o riarrangiamenti cromosomici. Mentre gli approcci di sequenziamento dell'intero genoma potrebbero fornire maggiori informazioni sui tipi generali di cambiamenti che si verificano in un genoma con l'età, la possibilità di utilizzare sistemi di selezione fenotipica di ottenere misurazioni dei tassi di mutazione e di isolare preferenzialmente specifici tipi di cambiamenti genetici sono importanti vantaggi per lo studio meccanicistico aspetti di legati all'invecchiamento genoma instabilità. Razionalizzazione della determinazione dell'età cellulare e la possibilità di effettuare misurazioni parallele di physiologimodifiche cal tramite citometria a flusso forniscono mezzi efficaci per correlare l'instabilità del genoma con altri cambiamenti cellulari durante fasce di età specifiche. Determinazione dei potenziali cambiamenti età-dipendenti dei tassi di mutazioni si accumulano richiede: 1) la determinazione accurata dei tassi in popolazioni di cellule giovani, 2) la determinazione precisa dell'età delle cellule, e 3) la capacità di arricchire in modo affidabile sufficientemente grandi popolazioni di cellule madri per misurare riproducibile instabilità del genoma in età avanzata. Questo approccio permette al sistema modello di lievito di contribuire a definire meccanismi alla base di responsabili dei cambiamenti età-dipendente dei tassi e / o frequenze di instabilità del genoma nelle cellule mitoticamente attive. Inoltre, fattori genetici e ambientali possono essere rapidamente valutati per contributi a età-dipendente genoma instabilità. In ultima analisi, queste caratterizzazioni potrebbero portare allo sviluppo di modelli che rappresentano il modo in cui le mutazioni si accumulano durante l'invecchiamento replicativo.

Questo metodo dipende dalla capacità di rilevare mutazioni o altri tipi di instabilità del genoma attraverso la comparsa di fenotipi selezionabili per misurare i tassi di tali eventi. Tuttavia, la creatività nella progettazione di test può permettere molti aspetti del genoma instabilità per essere esaminati. Ad esempio, il URA3 e geni CAN1 possono essere collocati in differenti siti genomici per verificare eventuali influenze della posizione genomica sui risultati. Reversion di specifici alleli del gene non-funzionali alleli di geni funzionali potuto testare particolari processi mutazionali. Inoltre, l'introduzione di molteplici alleli inattivi di un gene o di accompagnamento di un gene con sequenze ripetute potrebbe essere usato per esaminare gli eventi di ricombinazione attraverso il restauro o la perdita di funzione del gene, rispettivamente. Test di fluttuazione sono l'approccio standard per determinare i tassi di questi vari eventi genoma instabilità ^9. Il protocollo è scritto usando lo stimatore mediana Lea-Coulson ben accettato e relativamente semplice per determinare mutatasso zione per renderlo più accessibile ai diversi ricercatori, anche se il metodo MSS-stimatore di massima verosimiglianza è considerato il metodo migliore per determinare i tassi di mutazione ^9. Lo stimatore di massima verosimiglianza-MSS è stato già recensito in dettaglio ^9, e può essere utilizzato come metodo alternativo, ma richiede calcoli più sofisticati. In alternativa, il software gratuito per calcolare i tassi di mutazione con questo metodo è stato messo a disposizione ^22. Ottenere misure riproducibili su tassi di mutazione richiede attenzione ad alcuni aspetti del disegno sperimentale, compreso l'uso di colture replicate sufficienti, inoculando colture a bassa densità sufficiente di cellule iniziali che taglia la popolazione aumenta di adeguati volumi di coltura di 10.000 volte o più, e scegliendo in modo che l'intera popolazione di cellule può essere diffuso su terreno selettivo. Per quest'ultimo punto, una formula precedentemente descritta può essere utilizzata per regolare il tasso di mutazione basata sulla frazione di cultura tested ^9. Variazione del tasso di crescita delle culture può complicare la determinazione di un tasso di mutazione riproducibile, e uno stimatore basato mediana-modificato che può produrre risultati più riproducibili in tali situazioni è stata recentemente descritta ^23.

La possibilità di misurare con precisione l'età delle cellule è un altro fattore che è importante per stabilire se le frequenze genoma instabilità in vecchie cellule sono diversi dai valori attesi a causa del tasso di eventi nelle cellule giovani. Abbiamo trovato WGA colorazione sia preferibile calcofluor colorazione bianca, sia in termini di background e flessibilità, poiché WGA è disponibile coniugato con molecole fluorescenti differenti. Questa flessibilità può offrire maggiori opportunità per la misurazione simultanea di altre caratteristiche cellulari con i reagenti fluorescenti. Il lavoro iniziale per stabilire un rapporto tra l'intensità del segnale per la colorazione WGA e il corrispondente numero di cicatrici gemma su cellule possono poi portare ad una piùrapida determinazione dell'età cellulare attraverso citometria a flusso. Questo approccio consente anche l'uso delle dimensioni delle popolazioni più grandi di quanto sarebbe normalmente esaminati al microscopio per una migliore riproducibilità delle misurazioni. Mentre tutte le determinazioni età potrebbe essere fatto attraverso l'esame microscopico delle cellule, riteniamo che la citometria a flusso approccio facilita screening rapido di fattori che influenzano l'età-dipendente genoma instabilità.

Oltre a misurare l'età delle cellule in modo affidabile, la considerazione deve essere data al numero di divisioni cellulari cellule madri sono autorizzati a sottoporsi con ogni successivo round di crescita e l'ordinamento delle cellule. Uso di un formato popolazione iniziale più piccola o un volume più grande cultura potrebbe consentire a cellule di sottoporsi più divisioni cellulari prima di raggiungere la densità cellulare desiderato. Ad esempio, altri ricercatori hanno usato solo due turni di smistamento per ottenere molto vecchie cellule di lievito ^16, che ha l'ovvio vantaggio di ottenere cellule vecchie con meno experimepassi ntale. Nel valutare se aumentare il volume della cultura per permettere alle cellule di completare più divisioni cellulari prima di ordinare, tenere a mente il limite per il numero totale di cellule che possono essere elaborati in una singola colonna. Utilizzare un volume di grande cultura può richiedere l'uso di più colonne per ordinare una popolazione di cellule. Inoltre, se le cellule subiscono un minor numero di cicli di divisione cellulare tra i punti di tipi / raccolta, poi ci sono più opportunità per osservare le deviazioni dalla frequenze di mutazione attese in momenti distinti durante la durata della vita. Ad esempio, il campionamento solo in anticipo e momenti in ritardo durante la durata della vita può produrre dati che indicano un costante aumento della frequenza di mutazione, ma di campionamento nei momenti intermedi supplementari durante la durata della vita può dimostrare che la frequenza aumenta mutazione rapidamente e poi altipiani. Tuttavia, dal momento che questo protocollo di isolare cellule madri vecchie, vi è la possibilità di ottenere una misura più diretta della variazione dei tassi di mutazione con l'età. Test di fluttuazione potevano be effettuata utilizzando cellule madri di età diverse per determinare se il tasso di mutazione sarà diverso dal tasso ottenuto con cellule giovani. Mentre le culture di questi test di fluttuazione diventerà una miscela di cellule vecchie e giovani man mano che crescono, eventuali deviazioni da tassi ottenuti a partire da cellule giovani potrebbero essere attribuiti all'uso di una popolazione anziana di partenza.

La possibilità di ottenere riproducibile una grande popolazione abbastanza di cellule madri di età compresa tra di misurare con precisione l'instabilità del genoma è fondamentale per il successo di questo approccio. Mentre il protocollo descrive l'uso di un particolare sistema di smistamento magnetico per questo scopo, altri gruppi hanno filtrate cellule di lievito madre con sistemi alternativi ^14,18 (vedi Tabella dei Materiali). Tali sistemi alternativi dovrebbero funzionare anche con questo metodo, anche se alcuni ottimizzazione dei protocolli dei produttori potrebbe essere richiesto. Indipendentemente dal sistema specifico utilizzato, la dimensione della popolazione richieded differisce a seconda della frequenza del tipo di mutazione o genoma riarrangiamento scelti per lo studio. Come minimo, ci deve essere un numero sufficiente di cellule madri per ottenere almeno una colonia mutante per ogni popolazione di calcolare una frequenza di mutazione. In pratica, i risultati possono essere molto variabili se solo zero a cinque colonie mutanti sono attesi dalla dimensione della popolazione, e anche un piccolo aumento della dimensione della popolazione, in modo che 5-10 colonie mutanti sono attesi, può notevolmente migliorare la riproducibilità. Quando biotina etichettare una popolazione di partenza, l'efficienza di recupero per ogni tipo deve essere presa in considerazione per identificare la dimensione della popolazione, necessarie per misurare la frequenza di mutazione in cellule madri vecchie. Con il 90% di recupero di cellule madri dopo ogni sorta, solo il 59% della popolazione originaria sarebbe stata recuperata dopo cinque cicli di crescita e di smistamento. Questo scende a ~ 33% di recupero della popolazione originaria dopo cinque turni di crescita e di smistamento, se solo l'80% delle cellule madri sono etichettati recuperarecato nel corso di ogni sorta. Misurazione e massimizzando il recupero è fondamentale quando si misura eventi a bassa frequenza, dal momento che un 2-3 volte diminuzione della dimensione della popolazione potrebbe facilmente portare a numeri inaffidabili di colonie mutanti per la popolazione.

Ci sono numerose opzioni per espandere o modificare questo protocollo per ottenere una più ampia comprensione del genoma instabilità durante l'invecchiamento cellulare mitotica. Semplici esempi includono analizzare come alterazioni delle funzioni del gene, i cambiamenti dei media, o altre variazioni delle condizioni ambientali alterano l'accumulo di mutazioni con l'età. Tassi di mutazione per i giovani cellule con funzione del gene alterato o nella condizione appropriata sarebbero misurati e utilizzati per determinare se le mutazioni si accumulano in modo diverso di quanto previsto dai valori di tasso e di diverso rispetto a popolazioni di cellule di controllo. Popolazioni cellulari in diversi punti durante l'invecchiamento replicativo potrebbero essere esposti a fattori di stress specifici, come le specie reattive dell'ossigeno o del DNA agenti dannosi. Laesposizione transitoria e mite allo stress ossidativo non ha modificato sostanzialmente la capacità di eseguire cell sorting (figura 3), ma le sollecitazioni più severe può complicare il recupero delle cellule. Esperimenti preliminari sarebbero necessarie per verificare che le cellule madri possono ancora essere recuperati in modo efficiente in seguito a sollecitazioni specifiche. Inoltre, le caratteristiche cellulari di cellule madri isolate potrebbero essere analizzati in dettaglio, compresi i livelli di specie reattive dell'ossigeno, la morfologia mitocondriale e vacuolare, e altre caratteristiche fisiologiche che sono associati con l'invecchiamento ^3. Inoltre, le cellule madri potrebbero essere una popolazione iniziale per un ulteriore trattamento o manipolazione. Dato che le cellule madre e figlia sono fisicamente separati durante la procedura, le cellule figlie sono ancora disponibili per l'analisi. Ad esempio, cambiamenti nelle caratteristiche fisiologiche delle cellule figlie o l'eredità asimmetrica delle macromolecole danneggiate tra lievito madre e cellule figlie ^{24 potrebbe essere paragonato a la tempistica di eventuali cambiamenti interessanti in mutazione frequenze / tariffe. Frequenze di mutazione per le popolazioni di cellule figlia potrebbero essere ottenuti anche per cercare di modellare se vi sia eredità asimmetrica di mutazioni durante l'invecchiamento replicativo. In sintesi, combinando arricchimento delle cellule madri mediante cella magnetico classificare con test di fluttuazione consente i vantaggi della S. sistema modello cerevisiae da applicare in modo efficiente per indagare i meccanismi responsabili per l'accumulo di cambiamenti genetici durante l'invecchiamento cellulare mitotica.}

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335	100 mg
Microsfere Anti-Biotina	Miltenyi Biotec	130-090-485	2 ml MicroBeads coniugate ad anticorpi monoclonali di topo anti-biotina (isotipo: topo IgG1)
Colonne MACS LS	Miltenyi Biotec	130-042-401	25 colonne adatte per separatore QuadroMACS
Separatore QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976	Solo separatore
Kit di partenza QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-091-051	Include: Separatore QuadroMACS (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), Colonne LS (130-042-401), Rack per provette MACS da 15 ml (130-091-052), Un'unità da 2 ml di microsfere MACS. Nota: i sistemi alternativi includono Dynabeads Biotin Binder e MagnaBind Magnetic Beads
BD Falcon Cell Strainer, 40 &; micro; m	BD Bioscienze	352340	40 µ m per l'uso con le provette coniche BD Falcon da 50 ml. 50 pezzi per confezione
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T6146	Polvere, filtrante dopo la dissoluzione importante per rimuovere il particolato Agglutinina
germe di grano Alexa Fluor488	Life Technologies	W11261	Potrebbero essere utilizzati anche coniugati con diversi spettri di eccitazione/emissione
Reagente antisbiadimento ProLong Gold	Life Technologies	P36930	10 ml, potrebbero essere utilizzati anche altri reagenti antisbiadimento

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