Misure calcio citosolico nelle cellule epiteliali renali mediante citometria di flusso

Sommario

Il calcio è coinvolto in numerose vie di segnalazione fisiologici e fisiopatologici. Imaging cellulare dal vivo richiede attrezzature specializzate e può richiedere molto tempo. Un rapido, metodo semplice usando un citometro di flusso per determinare variazioni relative del calcio citosolico nelle cellule epiteliali aderenti portati in sospensione è stata ottimizzata.

Abstract

Una varietà di processi cellulari, sia fisiologici che fisiopatologici, richiedono o sono governati dal calcio, tra cui l'esocitosi, la funzione mitocondriale, la morte cellulare, il metabolismo cellulare e la migrazione cellulare per citarne solo alcuni. Il calcio citosolico viene normalmente mantenuto a basse concentrazioni nanomolari; piuttosto si trova in alte concentrazioni da micromolari a millimolari nel reticolo endoplasmatico, nella matrice mitocondriale e nel compartimento extracellulare. Dopo la stimolazione, un aumento transitorio del calcio citosolico serve a segnalare gli eventi a valle. Il rilevamento dei cambiamenti nel calcio citosolico viene normalmente eseguito utilizzando un imaging di cellule vive impostato con coloranti leganti il calcio che mostrano un aumento dell'intensità della fluorescenza o uno spostamento della lunghezza d'onda di emissione al legame del calcio. Tuttavia, una configurazione di imaging di cellule vive non è liberamente accessibile a tutti i ricercatori. Metodi di rilevazione alternativi sono stati ottimizzati per le cellule immunologiche con citometria a flusso e per le cellule aderenti non immunologiche con un lettore di micropiastre a fluorescenza. Qui, descriviamo un metodo semplice e ottimizzato per rilevare i cambiamenti nelle cellule epiteliali con la citometria a flusso utilizzando un colorante legante il calcio a lunghezza d'onda singola. Le cellule epiteliali del tubulo prossimale renale aderenti, che normalmente sono difficili da caricare con coloranti, sono state caricate con un colorante legante il calcio permeabile alle cellule fluorescenti in presenza di probenecid, portate in sospensione e i segnali di calcio sono stati monitorati prima e dopo l'aggiunta di tapsigargina, tunicamicina e ionomicina.

Introduzione

Il calcio è un importante secondo messaggero responsabile della trasmissione dei fisiologica cellulare e segnali fisiopatologici ^1. Le concentrazioni di calcio citosolico sono tenuti bassi attraverso l'attività di pompe e scambiatori di calcio di calcio. Il / ATPasi del reticolo endoplasmatico calcio sarcoplasmatico (SERCA) riempie il reticolo endoplasmatico (ER) negozio di calcio come parte di un sistema di "perdita della pompa", mentre l'ATPasi della membrana plasmatica di calcio (PMCA) estrude calcio al compartimento extracellulare, sia in maniere ATP-dipendenti ^2. Messaggeri fisiologici, come gli ormoni o neurotrasmettitori, trasmettono i loro segnali attraverso G-recettori accoppiati alle proteine, l'attivazione della fosfolipasi C, che idrolizza fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP2) nella membrana plasmatica per generare diacilglicerolo e inositolo trifosfato (IP3) ^3. Mentre diacilglicerolo rimane nella membrana plasmatica, IP3 diffonde nel citosol e si lega al recettore IP3s (IP3Rs), che sono ligandi attivano i canali del calcio, che si trova nella membrana ER e il calcio viene rilasciato dal negozio ER luminale si conclude con un aumento delle concentrazioni di calcio citosolico ^4. Una via alternativa a calcio per raggiungere il citosol è attraverso i canali del calcio e scambiatori presenti nella membrana plasmatica. Crosstalk tra questi due comparti sono stati descritti: rilascio di calcio di calcio indotto (CICR) in cui il calcio extracellulare induce il rilascio di calcio dai depositi ER ^5, e conservare Entry operato di calcio (Soče), dove lo svuotamento dei depositi ER viene rilevata da STIM e provoca l'apertura di Orai canali del calcio nella membrana plasmatica per promuovere riempimento dei negozi ER ^6.

In condizioni fisiopatologiche, la risposta cellulare di calcio è un aumento di calcio citosolico liberalizzati e in assenza di stimolatori fisiologici ^1. La risposta di calcio può essere effettuata in vari modi: prolungata calciodel segnale, ritardato la rimozione del calcio dal citosol, esaurimento delle riserve di calcio o modifiche localizzate del calcio. Inoltre, i mitocondri assumono un ruolo centrale nel buffer e liberando calcio ^7. Prolungato e / o sovramassimale aumento di calcio citosolico porta alla morte cellulare. In realtà, il calcio è il più delle volte coinvolto nella risposta cellulare e fisiopatologico è un evento chiave in una vasta gamma di malattie, come le malattie neurodegenerative, le malattie cardiache, il cancro, le malattie delle ossa e malattie renali, che sono principalmente associato con la morte delle cellule e la perdita o l'alterazione di organo o tessuto funzione ^8-10. Inoltre, perturbazione dei segnali di calcio è stato collegato a adattamento cellulare e cambiamenti nelle funzioni e risposte cellulari.

Tradizionalmente, segnali di calcio sono misurati con un indicatore di calcio fluorescenti carica negativa che viene caricato in cellule in una cella acetossimetil permeabili (AM) forma estere. Una volta spaccati da Esteras cellularies, gli indicatori fluorescenti rimangono all'interno del compartimento intracellulare e aumentano di intensità di fluorescenza quando il calcio è legato. L'indicatore di calcio più conosciuto e utilizzato è il raziometrico Fura-2 sviluppato da Roger Tsien e colleghi ^11. Indicatori di calcio con differenti affinità per il calcio consentono diverse piscine di calcio da monitorare. Metodi di rilevamento includono l'imaging cellulare dal vivo, lettore di micropiastre a fluorescenza e citometria a flusso. La cinetica relativamente veloce dei segnali di calcio (di solito nel giro di pochi secondi a minuti) rende l'imaging cellulare dal vivo il metodo migliore per ottenere la maggior parte delle informazioni sulle caratteristiche del segnale calcio. A parte la cinetica rapida dei segnali di calcio (nel giro di millisecondi), l'imaging cellulare dal vivo è un metodo migliore per studiare compartimentalizzazione cellulare di segnalazione di calcio all'interno di una singola cella ^12. Le concentrazioni di calcio assoluti possono essere calcolate determinando la fluorescenza minima e massima della ind di calcioicator aggiungendo un chelante del calcio e permeabilizzante cellule, rispettivamente, come descritto da Grynkiewicz et al. ^11.

L'uso di citometria a flusso per misurare segnali di calcio è stato sviluppato nel 1980 in cellule immunologiche dove la possibilità di misurare più parametri, come l'integrità della membrana e la separazione della popolazione cellulare, e il requisito di cellule in sospensione in combinazione con lo sviluppo di singola lunghezza d'onda indicatori di calcio fatto citometria a flusso un metodo ideale e convenientdetection ^13-15. In cellule aderenti, cellule vive fornisce più informazioni sulla segnalazione di calcio, soprattutto la cinetica, ma richiede una configurazione complicata comprendente un microscopio a fluorescenza, un sistema di perfusione, manutenzione dell'ambiente cellulare, come la temperatura, e il software microscopio specializzato per acquisire e analisi dei dati. Metodi alternativi come ad esempio un lettore di micropiastre a fluorescenza o Pharmacolmezzi ogical attraverso l'uso di chelanti del calcio sono incomparabili in termini di informazioni acquisite. Citometria a flusso sta diventando più ampiamente usato per monitorare calcio citosolico in cellule aderenti però, nella maggior parte degli studi, solo punto finale vengono effettuate misurazioni. Utilizzando il metodo sviluppato inizialmente da Gergely et al. In cellule B immunologiche ^16, cambiamenti nella concentrazione di calcio libero citosolico di citometria a flusso con una cinetica in tempo reale e monitorare l'intensità di fluorescenza di singole cellule provenienti da un campione di popolazione sono stati misurati con successo in cellule epiteliali tumorali e cellule staminali tumorali ibridi ^17. Questo metodo è stato ulteriormente adattato per l'uso in cellule epiteliali aderenti, che sono difficili da caricare con indicatori di calcio ^18.

Qui, utilizzando una linea cellulare epiteliale aderente immortalato derivato dal segmento S1 del tubulo prossimale rene di ratto (WKPT-0293 Cl.2) ^19, descriviamo un ottimizzato m semplificatoetodo per la misurazione delle variazioni di concentrazione di calcio citosolico di citometria a flusso. Dal momento che molte cellule epiteliali in possesso di un certo numero di trasportatori organici per i composti anionici, carico di cellule con un indicatore di calcio può rivelarsi una sfida. Per impedire l'efflusso di indicatori di calcio, probenecid, l'inibitore prototipico dei trasportatori di anioni organici e originariamente sviluppato per diminuire l'escrezione renale di penicillina ^20, viene applicata simultaneamente nel mezzo di incubazione. Le cellule sono mantenute in monostrati di indicatore di calcio di carico, portati in segnali di sospensione e di calcio può essere rilevata immediatamente dopo l'aggiunta composto.

Protocollo

1. Preparazione dei reagenti e soluzioni

1. Preparare la soluzione di un sale di Hank modificato bilanciata (HBSS) (in mM: 136,9 NaCl, KCl 5,37, 0,34 Na ₂ HPO _4, 0.44 KH ₂ PO _4, 4.17 _NaHCO3, pH 7,2, senza rosso fenolo). Conservare a 4 ° C.
2. Fai 1,5 M CaCl ₂ e 2 M 4- (2-idrossietil) -1 acido-piperazineethanesulfonic (HEPES) (pH 7.2) soluzione madre con acqua distillata.
3. Preparare una soluzione 250 mM magazzino di probenecid. Per la forma di acido libero (spesso chiamato insolubile in acqua), sciogliere in polvere probenecid in NaOH 1N, riempire a tre quarti del volume finale con acqua distillata e titolare lentamente a pH 7,4 con HC1. Conservare a 4 ° C.
4. Sciogliere membrana permeabile colorante fluorescente calcio vincolante anidra dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione magazzino di 1 mm. Conservare a -20 ° C al buio.
5. Prima di ogni esperimento, appena preparare-probenecid contenente HBSS flusso (PHF) buffer combinando modificato con HBSS (concentrazioni finali) 1.5 mM CaCl _2, HEPES 10 mM, pH 7,2, siero fetale bovino al 5%, 2 mM probenecid, e 5,55 mM glucosio. Riscaldare a 37 ° C.

Cultura 2. Cella

1. Tavola 2.5 x 10 ⁵ cellule renali prossimali tubulari (WKPT-0293 Cl.2) per pozzetto di un piatto 6 pozzetti o 35 millimetri nel terreno di coltura standard e di crescere per 2 giorni che raggiungono una confluenza di circa il 70%.

3. Calcio Dye Loading

1. Per ogni piatto bene o, mescolare 1 ml di terreno di coltura contenente siero fetale bovino 5%, 4 celle mM permeabile calcio colorante vincolante e probenecid mM 2.
2. Sostituire il terreno di coltura con 1 ml di miscela di colorante di caricamento in ciascun pozzetto ed incubare a 37 ° C per 30 minuti in un incubatore umidificato con 5% di CO _2. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento del indicatore fluorescente.

4. Preparazione di CeLLS per Citometria a Flusso

1. Soluzione 0,05% di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico Warm (EDTA) a 37 ° C.
2. Aspirare calcio soluzione colorante di caricamento da ogni pozzetto e aggiungere 1 ml di tripsina, lungo la parete del pozzo.
3. Incubare a 37 ° C fino a quando tutte le celle sono staccati.
4. Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 ml e pellet per centrifugazione in una microcentrifuga a 10.000 g per 1 min.
5. Aspirare accuratamente il sopranatante senza disturbare il pellet.
6. Lavare le cellule con l'aggiunta di 1 ml di tampone PHF e risospendere pipettando su e giù.
7. Agglomerare cellule per centrifugazione a 10.000 g per 1 min.
8. Ripetere i punti da 4.6. e 4.7. altre due volte.
9. Risospendere le cellule in un volume finale di 500 microlitri di buffer PHF e utilizzare le cellule per la sperimentazione entro 1 ora.
10. Opzionali: le cellule di conteggio per determinare la concentrazione cellulare e utilizzare 5 x ^4-01 ottobre x 10 ⁵ cellule per la misurazione.

5. Flusso CytImpostazione ometer

1. Avviare il citometro a flusso, aprire il cassetto fluidica e capovolgere l'interruttore valvola di sfiato per aumentare la pressione d'aria del serbatoio del liquido guaina.
2. "Prime" lo strumento per rimuovere eventuali bolle d'aria che risiede all'interno delle camere d'aria e la camera di flusso.
3. Nel software di citometria a flusso, aperte due finestre dot plot.
   1. Il primo diagramma a punti richiede luce diffusa in avanti (FSC) per il parametro X e laterale della luce diffusa (SSC) per il parametro Y per controllare la qualità delle cellule all'interno del campione attraverso la loro dimensione e la loro granularità, rispettivamente.
   2. Il secondo diagramma a punti misura l'intensità di fluorescenza del colorante di calcio-bound. Selezionare il canale di rilevamento di fluorescenza appropriato per il parametro Y usando una scala logaritmica e il tempo in secondi per il parametro X su una scala lineare.
4. Impostare la portata di 'alto'.

6. Citometria a flusso Measurement

1. Eseguire le misurazioni a temperatura ambiente. In un citometria a flusso provetta (11,5 x 75 mm), aggiungere 480 microlitri di buffer PHF.
2. Aggiungi sospensione cellulare 20 ml e brevemente vortice per mescolare.
3. Spostare il braccio di supporto del tubo di lato e posizionare il tubo campione sul tubo di iniezione del campione fino a quando si forma una tenuta ermetica. Riportare il braccio di supporto del tubo nella posizione originale centrata.
4. Ottimizzare misurazione regolando il canale di fluorescenza tale che l'intensità di fluorescenza media del campione è di circa 10 ² sul asse y. Salvare e utilizzare per gli esperimenti successivi.
5. Per avviare un esperimento, ripetere i passaggi 6,1-6,3.
6. Record di fluorescenza di base per 50 sec.
7. Pausa misurazione, rimuovere la provetta, aggiungere composti di interesse, vortex brevemente e ritornare al tubo di iniezione del campione. Questo passaggio non deve durare più di 15 secondi.
8. Riprendi misurazione e continuare per un totale di 204,8 sec.
9. Utilizzare un i di calcioonophore, come ionomicina (10 mM), e un chelante del calcio, come il glicole etilenico tetraacetico (EGTA), MnCl ₂ o CoCl ₂ (2 mM), per i controlli, rispettivamente positivo e negativo.

Analisi 7. I dati

1. Analizzare i dati utilizzando un software dedicato citometria a flusso per l'analisi offline, come WinMDI (Windows Multiple Document Interface per citometria a flusso), un pacchetto software gratuito sviluppato da Joe Trotter presso l'Istituto Scripps, Citometria a flusso Nucleo strumento.
2. Aprire un diagramma a punti con i parametri SSC e FSC.
3. Selezionare la regione di celle per l'analisi con lo strumento "Regioni" (tasto destro del mouse sopra l'immagine) di escludere le cellule morte o detriti cellulari si trovano in basso a sinistra dall'analisi dei dati (Figura 1).
4. Analisi Quadrant (Figura 2)
   1. Aprire una trama densità con tempo in ascisse e l'intensità di fluorescenza in asse y. Utilizzare tutti gli eventi.
   2. Noiuna e la stessa regione di gating come in 7.3.
   3. Quantificare i dati utilizzando funzione "Quadrant".
   4. Regolare i separatori quadrante in modo che la linea verticale viene posizionato al momento della aggiunta del composto e la linea orizzontale è posta al centro della fluorescenza basale nei controlli. Assicurarsi che il posizionamento dei separatori quadranti è uguale in tutti i campioni.
   5. La percentuale di cellule in ciascun quadrante viene visualizzato in ciascun angolo (Figura 2). Confrontare il quadrante in alto a destra (UR) tra i campioni.
5. Analisi Istogramma (Figura 3)
   1. Aprire i dati di controllo in una finestra istogramma con intensità di fluorescenza sul asse x ed eventi sul asse y. Utilizzare tutti gli eventi.
   2. Per una visione pittorica, aggiungere i dati di test da confrontare con la trama controllo come trame di sovrapposizione (andare in File → Apri File → selezionare File → Overlay).
   3. Per l'analisi quantitativa, unico istogramma vinceredows devono essere utilizzati. Porta la popolazione di cellule con la regione R1 dal punto 7.3.
   4. Nel controllo non trattato, utilizzare la funzione marker ("marker") per contrassegnare l'area di analisi partendo dal punto medio tra il minimo e il massimo di fluorescenza del picco di controllo e termina alla massima intensità di fluorescenza. La percentuale di cellule in questo settore è calcolato.
   5. Recuperare i dati dalla finestra delle statistiche. Ripetere l'operazione per i rimanenti file di dati utilizzando la stessa area contrassegnata per l'analisi.
6. Analisi intensità di fluorescenza (Figura 4)
   1. Aprire un diagramma a punti nel tempo su l'asse x e l'intensità di fluorescenza in asse y. Utilizzare tutti gli eventi.
   2. Attiva "Modalità Kinetics" e "Overlay Kinetics Line". Una linea blu apparirà nella trama punto che rappresenta l'intensità di fluorescenza media.
   3. Quantificare l'afflusso di calcio relativa mediante la creazione di più aree rettangolari. Ogni regione dovrebbe avere awLarghezza della merito "50", che equivale a "10 sec". Definire fino a 15 zone rettangolari.
   4. Recupera quantificazione dalla finestra delle statistiche e copia in un foglio di calcolo.
   5. Utilizzare i dati y-media per l'analisi. Calcolare la media dei R2 a R6, che è equivalente a 20 a 50 sec. Questo è il valore di base.
   6. Scegliere un intervallo di tempo adeguato per l'analisi del flusso di calcio (dipende inizio, durata e intensità).
   7. Calcolare i segnali di calcio di ogni regione all'interno di questo intervallo di tempo rispetto al valore basale, cioè il segnale di fluorescenza prima aggiunta del composto, che è impostato al 100%. Determinare la media e la deviazione standard delle regioni inviare aggiunta del composto; questo è il segnale di calcio medio evocata dal composto.

Risultati

Per aumentare il calcio citosolico, due composti farmacologici sono stati applicati alle cellule renali prossimali tubulari (WKPT-0293 Cl.2) Pellicola colorante legame delle cellule di calcio permeabile, Fluo-3-AM. Campioni di controllo non trattate sono state caricate con calcio legame con colorante in presenza di probenecid e sono stati mescolati, ma senza l'aggiunta di composti. Tapsigargina (TG) è un inibitore classica della pompa SERCA che porta ad una perdita di pronto soccorso e un conseguente aumento di calcio c...

Discussione

Il calcio è un evento chiave in molteplici processi cellulari che agiscono come una seconda molecola di segnalazione messaggero e anche come mezzo per comunicare tra ER e mitocondri. La possibilità di misurare le variazioni delle concentrazioni di calcio citosolico libero è una tecnica utile che può applicarsi a tutti i settori della biologia cellulare. Ci sono vari metodi per rilevare segnali di calcio citosolico. Classicamente, i segnali provenienti da un indicatore di calcio raziometrica, come la Fura-2, sono monitor...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fluo-3, AM	Invitrogen	F-1241	Permeabile alle celle
Probenecid	Sigma-Aldrich	P-8761	Insolubile in acqua, sciogliere in 1 N NaOH
0,05% Tripsina-EDTA (1X)	Invitrogen	25300-062
Ionomicina	Sigma-Aldrich	I9657
Thapsigargin	Tocris Bioscience	1138
Tunicamicina	Sigma-Aldrich	T7765
FACSCalibur Flow Cytometer + Software CELLQuest	Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)	Joe Trotter, The Scripps Institute		Si prega di notare che si tratta di una vecchia applicazione a 16 bit che legge i file conformi a FCS 2.0 ma non riconosce i dati digitali FCS 3.0.
WKPT-0293 Cl.2 linea cellulare del tubulo prossimale del rene di ratto			Biofisica, Case Western Reserve University, Cleveland, OH)

Messa a disposizione dal Dr. Ulrich Hopfer (Dipartimento di Fisiologia &