Articolo metodologico

Killer artificiale cellule presentanti l'antigene (KaAPC) per una efficiente In Vitro L'esaurimento delle Umana antigene-specifiche cellule T

DOI:

10.3791/51859

⸱

11 agosto 2014

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Institute of Cell Engineering, Johns Hopkins University, 2Department of Internal Medicine I, University of Regensburg, 3Department of Rheumatology, Asklepios Medical Center

In questo articolo

Sommario

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Orientamenti sono presentati per la generazione di antigene artificiale assassino cellule presentanti, KaAPC, uno strumento efficace per deplezione in vitro di cellule T antigene-specifiche umani e una soluzione alternativa per immunoterapia cellulare per il trattamento delle malattie autoimmuni mediate da cellule T in un antigene modo specifico senza compromettere il sistema immunitario rimanente.

Abstract

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Attuale trattamento di cellule T malattie autoimmuni mediate si basa principalmente su strategie di immunosoppressione globale, che, a lungo termine, è accompagnato da effetti collaterali negativi, come una ridotta capacità di controllare le infezioni o tumori. Pertanto, nuovi approcci devono essere sviluppati che colpiscono le cellule solo la malattia di mediazione e lasciare il sistema immunitario rimasta intatta. Negli ultimi dieci anni una varietà di strategie di immunoterapia a base di cellule di modulare sono stati sviluppati cellulari mediata risposte immunitarie T. La maggior parte di questi approcci si basano su cellule presentanti l'antigene-tolleranza indurre (APC). Tuttavia, oltre ad essere tecnicamente difficile e ingombrante, tali approcci basati su cellule sono molto sensibili alle risposte delle cellule T citotossici, che limita la loro capacità terapeutica. Qui vi presentiamo un protocollo per la generazione di cellule presentanti l'antigene artificiali non cellulari killer (KaAPC), che consente la deplezione di cellule T patologiche lasciando la risistema immunitario rimanente intatta e funzionale. KaAPC è una soluzione alternativa per l'immunoterapia cellulare che ha il potenziale per il trattamento di malattie autoimmuni e rigetto allogenico regolando indesiderati risposte delle cellule T in modo specifico antigene.

Introduzione

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Negli ultimi due decenni sono stati compiuti molti progressi nella comprensione dei meccanismi patogenetici delle malattie autoimmuni. Tuttavia, i trattamenti più comuni si basano ancora su corticosteroidi e farmaci immunosoppressori, come analoghi delle purine, agenti alchilanti e inibitori della calcineurina 1. L'uso di tali farmaci ha notevolmente migliorato la prognosi dei pazienti, ma il trattamento non fornire una cura della disfunzione immunologica sottostante. Inoltre, i pazienti diventano vulnerabili alle infezioni e allo sviluppo del cancro.

Quindi l'obiettivo finale per il trattamento delle cellule T malattie autoimmuni mediate e rigetto è quello di indirizzare specificamente unica malattia che causa le cellule T, mentre, allo stesso tempo, lasciando il sistema immunitario rimanente intatto e competente a combattere i disturbi immunologici. Utilizzando cellule presentanti l'antigene (APC) come trattamento per sopprimere le risposte delle cellule T periferiche è stato descritto già nel1970 da diversi gruppi. Dal momento che sono stati sviluppati poi molti approcci basati su celle (rivisto in Schütz et al. 2). Strategie che usano-FasL esprimono killer-APC come cellule immunomodulanti hanno mostrato risultati promettenti che indicano potenziale terapeutico per il trattamento di autoimmunità, rigetto e le infezioni croniche. Tuttavia, ci sono delle limitazioni significative con le strategie che utilizzano FasL Killer-APC che hanno in ultima analisi, limitato la loro applicabilità clinica; (I) la generazione o l'isolamento di APC è tempo, lavoro e dispendiosa (ii) pazienti affetti da citopenia causa immunosoppressione fornire quantità limitate e la qualità delle cellule (iii) il rivestimento o trasduzione di APC con apoptosi inducendo segnali quali risultati FasL a altamente fenotipi variabili e (iv) Killer-APC sono sensibili citotossica funzioni effettrici delle cellule T di conseguenza riducendo il loro potenziale terapeutico. Pertanto, è difficile garantire una riproducibile Killer-APC feno definitatipo che può essere utilizzato per la modulazione antigene-specifica delle risposte delle cellule T in vivo.

Sulla base del nostro lavoro precedente con FasL esprimono Killer-APC 3-5 e cellule presentanti l'antigene artificiali (AAPC 6,7) abbiamo sviluppato un approccio basato tallone-(KaAPC) per l'inibizione antigene-specifica o l'eliminazione di cellule auto-reattive T in vitro. KaAPC costituiti da un dimero HLA-A2-Ig (segnale 1) e un anti-Fas mAb (segnale inducendo apoptosi) covalentemente immobilizzato su una superficie di una perlina paramagnetico lattice 4,5 micron. Essi riducono cellule T antigene-specifiche in un Fas / FasL modo mediato da colture di cellule T di molteplici specificità in maniera antigene-specifica e indipendente l'attivazione indotta morte cellulare (AICD) percorso. Dose dipendente apoptosi nelle cellule T bersaglio è indotta rapidamente già dopo 30 min 8.

KaAPC può essere facilmente generata in modo controllato garantire un definito al largo della phenot scaffaleipo e superare la maggior parte delle carenze di strategie di deplezione delle cellule based. Di conseguenza, KaAPC visualizzare un grande potenziale per il trattamento di cellule T malattie autoimmuni mediate e rigetto, avanzando il campo di cellule T specifiche strategie di trattamento.

Protocollo

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1 Generazione di HLA-A2-Ig Based KaAPC

  1. Preparare tampone borato sterile. Fare una soluzione 0,1 M di acido borico in acqua e regolare il pH a 7,0. Filtro sterile (0,22 micron) tampone e conservare a 4 ° C.
  2. Preparare sterile tampone di lavaggio tallone. Utilizzare tampone fosfato salino (PBS) senza magnesio e calcio. Aggiungi siero AB umano per concentrazione finale del 3%. Aggiungi etilendiamminotetraacetico (EDTA) per 2 mM di concentrazione finale. Aggiungi sodio azide (NaN 3) per la concentrazione finale 0,01%. Filtro sterile (0,22 micron) tampone e conservare a 4 ° C.
  3. Trasferire 250 ml di perline epossidici (circa 100 x 10 6 perline) a magazzino in una sterile, con tappo a vite fiala di vetro.
  4. Aggiungere 250 ml di tampone borato.
  5. Mettere fiala di vetro su un magnete e lasciate perline aderire per 2 min; tampone aspirare e rimuovere flaconcino di vetro da magnete.
  6. Lavare perline una volta con 1 ml di tampone borato.
  7. Risospendere le sfere in 550 ml di 0.018 mcg/ Ml HLA-A2-Ig e 3.64 mg / ml di anti-umano CD95 monoclonale (clone CH11) e mescolare delicatamente agitando. (Si prega di consultare la sezione di discussione per ulteriori informazioni.)
  8. Incubare fiala di vetro su una estremità rotatore sopra fine, a 4 ° C per 24 ore.
  9. Spin down perline a 300 xg per 2 minuti.
  10. Posizionare flaconcino di vetro su un magnete per 2 minuti e aspirare la "soluzione di carico KaAPC"; rimuovere fiala di vetro da magnete, aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio tallone e risospendere accuratamente agitando.
  11. Ripetere il punto 1.10 due volte.
  12. Incubare fiala di vetro su un rotore a 4 ° C per 24 ore in 1 ml di tampone di lavaggio tallone. A questo punto, tutti i siti di legame con le proteine ​​residue sarà bloccato da siero AB umano contenute nel tampone di lavaggio tallone.
  13. Spin down perline a 300 xg per 2 minuti.
  14. Luogo ampolla di vetro su una calamita per 2 min e tampone di aspirare tallone di lavaggio; rimuovere fiala di vetro da magnete e sostituire soluzione di 1 ml di PBS.

2 Controllo di qualità, Peptide Loading, Wincenerimento, conservazione e la stabilità di KaAPC

  1. Trasferire 1,5 x 10 5 KaAPC in un tubo FACS e lavare con 1 ml FACS tampone di lavaggio.
  2. Risospendere le sfere in 100 ml FACS tampone di lavaggio e aggiungere 1 ml di anti-topo IgG1 PE (per il rilevamento della parte Fc di HLA-A2-Ig) e 1 ml di anti-topo IgM FITC (clone R6-60.2, per il rilevamento del CD95 mAb anti-umano).
  3. Incubare per 15 min a 4 ° C, lavare con 1 ml FACS tampone di lavaggio, e risospendere in 250 microlitri FACS tampone di lavaggio e leggere macchie mediante citometria a flusso.

figure-protocol-1
Figura 1 QC macchia di un lotto KaAPC realizzata come indicato nella sezione del protocollo. Colorazione è stata eseguita come descritto nella sezione 2 del protocollo HLA-A2-Ig è stato rilevato utilizzando un anti-topo-IgG1 PE mAb, mentre anti-umano-CD95 (anti-Fas) è stata rilevata con un anti-mouse FITC IgM monoclonale (vedi protocollo section 2.2) (linea blu). Grafici nero pieno rappresentano perle vuoti colorati con anti-topo-IgG1 PE mAb o anti-topo-IgM FITC mAb, rispettivamente. I numeri in alto a destra indicano l'intensità di fluorescenza media (MFI). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Per peptide trasferimento di carico 20 x 10 6 KaAPC in un nuovo flacone di vetro sterile, collocare su una calamita per 2 minuti, aspirare PBS e risospendere le perline in 500 microlitri PBS fresco con 5 mcg peptide (Tenete a mente, solo peptidi HLA-A2 ristretti volontà impegnare sul dimero!).
  2. Conservare caricato KaAPC a 4 ° C fino al momento dell'uso, per almeno 3 giorni per consentire sufficiente peptide carico sul dimero HLA-A2-Ig.
  3. Immediatamente prima dell'uso, lavare il peptide caricata KaAPC come indicato in 1.14; ripetere questo passaggio almeno 6x.
    NOTA: Questo è un passo fondamentale per assicurare che il peptide libero ha to essere completamente rimosso per evitare falsi risultati positivi di sterminio; residua peptide libero ha dimostrato di indurre apoptosi in antigene-specifiche colture di cellule T 9. Per escludere un effetto peptide solubile, eseguire campioni di controllo surnatante di peptide caricato e lavato KaAPC (vedi 3.8).
  4. Conte perline utilizzando emocitometro e l'etichetta con la data, il nome del peptide e la concentrazione.
    NOTA: Loaded KaAPC resta funzionale a 4 ° C per almeno un mese. Dopo un mese, ri-caricamento con lo stesso peptide permette KaAPC per essere utilizzato per un massimo di un anno.

3. KaAPC In Vitro Assay Uccidere

  1. Preparare co-coltura. Preparare mezzo completo RPMI supplementato con 3% T fattore di crescita delle cellule (made in laboratorio 6) e il 3% dei donatori di plasma autologo. Se il donatore di plasma autologo non è disponibile, utilizzare siero umano AB inattivato al calore.
  2. Preparare AnnexinV vincolante preparazione del buffer. Sciogliere 8,12 g di cloruro di sodio (NaCl) e 0,12 g calccloruro ium (CaCl 2) in 990 ml di DDH 2 O.Add 10 ml di tampone di 1M HEPES.
  3. Generazione di cellule T antigene-specifiche umani. (Per un protocollo dettagliato consultare una pubblicazione precedente 7 artificiali utilizzando cellule presentanti l'antigene (AAPC)). Assicurarsi che la specificità peptide è almeno> 75% come determinato dal tetramero colorazione.
  4. Per ogni campione incubare 2 x 10 5 cellule T antigene-specifiche / pozzetto (in una piastra inferiore 96 ben rotondo) in 200 ml di mezzo di co-coltura in un rapporto 1: 1 con KaAPC per 48 ore in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2.
  5. Campioni di raccolta e trasferire in una provetta FACS; lavare con 1 ml AnnexinV binding buffer, centrifugare a 300 xg per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere in 100 ml di AnnexinV binding buffer
  6. Campioni macchia con 1 ml AnnexinV FITC e 5 microlitri 7-AAD per 10-15 min a RT, lavare con 1 ml di AnnexinV binding buffer; spin down a 300 xg per 5 minuti, scartare il surnatante und risospendere in 250 microlitri AnnexinV binding buffer
  7. Leggi i campioni immediatamente al citofluorimetro.
  8. Preparare i seguenti campioni per determinare uccisione antigene-specifica da KaAPC: solo le cellule T; Cellule T + solubili anti-CD95; Cellule T + scaricati KaAPC; Cellule T + peptide non-cognate caricato KaAPC; Cellule T + peptide cognate caricato KaAPC; Cellule T + surnatante del peptide cognate caricato KaAPC.

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. Figura 2 KaAPC test uccidendo Peptide caricato KaAPC o sfere di controllo (solo HLA-A2-Ig perline) sono state coltivate per 48 ore in un rapporto 1: 1 con le cellule CMVpp65 specifici T (~ 80%), raccolte e successivamente tinto con AnnexinV e ioduro di propidio (PI) per determinare l'apoptosi mediante citometria di flusso (vedi sezione protocollo 3,3-3,7). "parente" si riferisce a microsfere caricate con CMVpp65 e "non-cognate" di essereAnnunci carichi di Mart-1 peptide. I numeri indicano la percentuale di cellule T vitali nel quadrante in basso a sinistra di ogni trama. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Per eseguire Intersecato-esperimenti, generare cellule T antigene-specifiche delle due specificità diverse.
  2. Ulteriori valutare le capacità di deplezione-antigene-specifiche di KaAPC con una analisi simultanea di eliminazione antigene-specifica delle cellule T nella popolazione di cellule T eterogenea. (Per un protocollo dettagliato si veda Schütz et al. 10).

Risultati

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Le caratteristiche di questo protocollo includono la generazione delimitati di un fenotipo KaAPC che visualizza HLA-A2-Ig (segnale 1) e anti-Fas mAb (segnale di apoptosi) Allo stesso tempo, che in confronto a quelli fondati cellulari non è influenzata dal rivestimento o di efficacia di trasduzione e possono essere facilmente modulata durante la produzione (Figura 1). Inoltre, KaAPC, non sono sensibili alle funzioni effettrici citotossiche delle cellule T e la loro funzionalità non dipende dalla qualità delle cellule presentanti l'antigene autologo pre e post manipolazione in vitro.

KaAPC sono in grado di deplezione delle cellule T antigene-specifiche in vitro quando caricato con peptide cognate, mentre il non-cognate caricato KaAPC non deplezione delle cellule T (Figura 2). Pertanto, KaAPC induce l'apoptosi delle cellule T in modo antigene-specifica. Successivamente, abbiamo utilizzato KaAPC per deplezione selettiva di cellule T antigene-specifiche da una miscela di differenti spe cellule Tcificities, dimostrando che solo citotossicità minimo perdeva in cellule T circostanti (Figura 3). Così, KaAPC rappresentano uno strumento raffinato per deplezione in vitro antigene-specifica delle cellule T antigene-specifiche umani attivati ​​con applicabilità potenziale clinico per il trattamento di malattie autoimmuni e rigetto allogenico.

Discussione

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La fase più critica del protocollo è quello di garantire il corretto rapporto di segnale 1 (peptide MHC) e il segnale 2 (anti-Fas mAb). Abbiamo effettuato esperimenti di titolazione intensivi per definire il rapporto ideale per il segnale 1 e 2; divenne evidente che minime variazioni dovute a differenze nel dimero HLA-A2 Ig o concentrazioni di anti-Fas mAb possono interferire con la funzionalità del KaAPC. Pertanto, la concentrazione di entrambi i segnali deve essere sempre verificata e qualità di entrambe le proteine ​​devono essere frequentemente testato anche se è stato ordinato da una fonte commerciale. Inoltre, le concentrazioni devono sempre essere determinati dallo stesso dosaggio come diversi saggi di rilevamento potrebbero risultare in diverse concentrazioni. Funzionalità del HLA-A2-Ig può essere compromessa a causa di ripiegamento incompleta e / o inefficiente peptide carico. Inoltre le molecole dimero possono aggregare a diversi gradi, che possono influire sulla attività funzionale della proteina. Pertanto, l'actuAl quantità di dimero necessaria per la generazione di un KaAPC funzionale e specifiche possono variare. Inoltre, abbiamo trovato che la gamma ideale per la morte indurre segnale anti-Fas mAb on KaAPC è estremamente stretto. Nelle nostre mani importi superiori 3.64 mcg / ml portare a non specifico uccisione di cellule T positive Fas mentre importi inferiori a 3,64 mg / ml hanno determinato una ridotta attività omicidio-dosi a seconda. Mentre queste condizioni sembrano piuttosto stretto, attenzione a questi dettagli comporterà la generazione di un KaAPC funzionale e specifico.

Mentre l'attuale fenotipo KaAPC è funzionale per la deplezione delle cellule T attivate antigene-specifiche, esperimenti iniziali di targeting di cellule T antigene-specifiche naïve o di riposo dimostrato alcuna significativa induzione di apoptosi antigene-specifica come queste popolazioni hanno ridotto l'espressione Fas. Pertanto, si potrebbe prevedere l'aggiunta di un segnale co-stimolatorio sulla KaAPC per indurre la up-regolazione di Fas su cellule T quiescenti per farli girarein un obiettivo per il KaAPC. Mentre questo è fattibile tutti e tre i segnali dovranno essere accuratamente titolata a garantire un funzionale KaAPC fenotipo.

Regolazione della piattaforma tallone per una matrice biocompatibile e biodegradabile rafforzerà KaAPC di applicabilità vivo. Recentemente, Shen et al. Hanno riportato il successo nell'uso vivo di KaAPC utilizzando perline 5 micron di lattice coniugate ad anti-Fas (clone Jo2) e anti-His / H2-K b -TRP2 11. Siamo stati in grado di dimostrare che il concetto generale di cellule presentanti l'antigene artificiali (AAPC) può essere trasferito con successo da micron dimensionata per particelle di dimensioni 12 nm e che la funzionalità è influenzata dalla geometria della particella 13. Quindi, variando la dimensione e / o forma del futuro KaAPC disegni si potrebbe essere in grado di influire sulla funzionalità in vivo e bio-distribuzione, che potrebbe essere fondamentale per il successo del trattamento di specifiche malattie autoimmuni organo.

2, lo sviluppo di ulteriori HLA di classe I dimero molecole così come la continua identificazione di nuovi antigeni rilevanti autoimmuni aumenterà ulteriormente e ampliare l'applicabilità di KaAPC. Inoltre si potrebbe pensare di utilizzare KaAPC diretta a diversi epitopi di indirizzare antigeni multipli contemporaneamente.

In sintesi, KaAPC rappresentano una tecnologia di piattaforma flessibile per unaspecifica-tigen deplezione delle cellule T. La loro natura "lego-like" permette l'inserimento di nuovi segnali, come i segnali co-stimolatori o inibitori aggiuntive come PD1 o TRAIL su varie matrici, che potrebbe ampliare e migliorare la loro successiva in vitro e in vivo applicabilità. Noi qui presentiamo il protocollo step-by-step per generare KaAPC, l'approccio basato primo tallone per l'eliminazione delle cellule T antigene-specifiche da miscele di cellule T con differenti specificità.

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Figura 3 KaAPC eliminare CTL in modo specifico per l'antigene PKH26-etichettato attivato Fas + CTL effettori-memoria e PKH67-etichettato CMVpp65-specifici CTL dallo stesso donatore sono stati mescolati a un 1:. Rapporto 1 e co-coltura con CMVpp65 KaAPC per 48 h. Colture di controllo sono stati trattati con scarico KaAPC, o 1 mg / mldi solubili anti-Fas-monoclonale (clone CH11). Minima perdita di cellule vitali è stata determinata in colture non trattate miste CTL (T mix). Sono mostrati i dati FACS originali per ogni popolazione CTL del mix T. L'analisi di apoptosi è stata eseguita come precedentemente pubblicato da gating separato su entrambi popolazioni di cellule T 10. I numeri raffigurati nei quadranti superiori di sinistra rappresenta% delle cellule totali. La figura illustra deriva da un esperimento rappresentativo di tre esperimenti indipendenti. Questa ricerca è stata originariamente pubblicata nel sangue. . Schütz, C. et al Killer cellule presentanti l'antigene artificiale: una nuova strategia per eliminare le cellule T specifiche Sangue.. 2008; 111, 3546-52. Copyright della Società Americana di Ematologia. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Dichiarazioni

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CS e MF hanno nulla da rivelare.

Nell'ambito di un accordo di licenza tra NexImmune e l'Università Johns Hopkins, Drs. Schneck e Oelke hanno diritto alle azioni della regalità ricevute dall'Università sulle vendite di prodotti AAPC descritti in questo articolo. Inoltre possiedono NexImmune magazzino, che è soggetta a determinate restrizioni nel quadro della politica University. Dr. Schneck è un membro della società "s Consiglio di Amministrazione e Comitato di Consulenza Scientifica. I termini di questo accordo sono gestite dalla Johns Hopkins University in conformità con il suo conflitto di interessi politiche.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) e KFO 146 (MF), il Dipartimento della Difesa DOD sovvenzione PC 040.972 (MO) e l'Istituto Nazionale della Sanità concede RO1 CA108835 , RO1 Ai44129 (JPS)

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PBSCorning21-040-CV
Siero umano ABbiologiciS40110
EDTASigma/AldrichE5134
Sodio azideSigma/Aldrich71289
M-450 epoxybeadsInvitrogen/Dynal14011
MPC-1 magneteInvitrogen/Dynal12001D
Fiala di vetro con tappo a viteFisher Scientific03-338AA
MACSmix Tube RotatorMiltenyi130-090-753
anti-CD95 (clone CH11)Milliore05-201
HLA-A2-Ig dimeroBD/Pharmingen551263
Cryo-tube 2 mlCorning430488
anti-topo IgG1 PEBD/ Pharmingen559320
anti-topo IgM FITCBD/Pharmingen553408
Cloruro di sodioMerckS271-3
Cloruro di calcioSigma/AldrichC5080
HEPEScellgro/Mediatech25-060-CI
RPMIgibco/life technologies11875-085
96-well Round piastra inferioreFalcon353077
AnnexinV FITCPromoKinePK-CA577-1001-1000
7-AADBD/Pharmingen51-68981E
tubi FACSFalcon352008
Atlanta

Riferimenti

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