Articolo metodologico

Murino Endoscopia per In Vivo Guarigione Imaging Multimodale di Cancerogenesi e valutazione della ferita intestinale e infiammazione

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DOI:

10.3791/51875

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26 agosto 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Department of Pediatric Rheumatology and Immunology, University Children's Hospital Münster

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Piccole tecniche di imaging consentono di animali esami diagnostici seriali e interventi terapeutici in vivo. Recentemente, l'ambito di applicazione è notevolmente ampliato e comprende attualmente la valutazione dello sviluppo del tumore del colon, la guarigione delle ferite e il monitoraggio di infiammazione. Questo protocollo illustra le diverse potenziali applicazioni di endoscopia murino.

Abstract

Modelli murini sono ampiamente utilizzati per studiare la patogenesi delle malattie umane e di valutare le procedure diagnostiche e interventi terapeutici preclinico. Tuttavia, valida valutazione di alterazioni patologiche spesso richiede l'analisi istologica, e quando eseguita ex vivo, richiede la morte dell'animale. Quindi in impostazioni sperimentali convenzionali, intra-individuali esami di follow-up sono raramente possibili. Pertanto, lo sviluppo di endoscopia murino in topi vivi consente agli investigatori per la prima volta sia per visualizzare direttamente la mucosa gastrointestinale e anche ripetere la procedura per monitorare alterazioni. Esistono numerose applicazioni per in vivo murino endoscopia, tra cui lo studio infiammazione intestinale o la guarigione delle ferite, ottenendo biopsie della mucosa più volte, e per amministrare localmente agenti diagnostici o terapeutici che utilizzano cateteri di iniezione in miniatura. Più di recente, l'imaging molecolare ha esteso mo diagnostica per immaginidalities che permettono il rilevamento specifico di molecole bersaglio distinti utilizzando photoprobes specifiche. In conclusione, l'endoscopia murino è emerso come una nuova tecnologia all'avanguardia per la sperimentazione diagnostica imaging in vivo e può avere un impatto significativo sulla ricerca preclinica in vari campi.

Introduzione

Modelli animali hanno notevolmente arricchito la nostra comprensione di numerose patologie intestinali. Il topo di laboratorio (Mus musculus) è emerso come un modello animale privilegiata nella ricerca biomedica per la sua abbondante informazione genetica e genomica ed è prontamente disponibile in transgenici e knockout ceppi. Oltre a migliorare la comprensione della malattia patogenesi, modelli animali sono soprattutto utilizzati per testare farmaci candidati, nonché interventi diagnostici o terapeutici preclinici. Tuttavia, nonostante la varietà di modelli murini che mimano la malattia umana, molte opzioni diagnostiche e interventistiche che vengono abitualmente utilizzati nella cura del paziente non sono disponibili per i topi. Di conseguenza, le strategie di sorveglianza per monitorare il decorso della malattia murina o l'effetto di interventi terapeutici sono spesso limitati a osservazioni indirette o postare analisi mortem. Mentre esistono procedure non invasive per i topi di controllo vitalità come indici di attività della malattia, quantification di perdita di peso o di guadagno, sangue, urine e feci le analisi, queste sono solo indicatori indiretti e sono influenzati dalla variabilità inter-individuale. Inoltre, post mortem analisi impedire osservazioni longitudinali in momenti ripetitivi. Tecniche di imaging sofisticate per monitorare l'attività della malattia nei topi è stato introdotto solo di recente 1,2. Sebbene queste tecniche di imaging consentono di analisi ripetitive, essi forniscono solo una visione descrittiva e spesso impreciso sul budello, non attivare la visualizzazione della mucosa diretta o consentire interventi diagnostici o terapeutici, come l'acquisizione biopsia o l'applicazione topica e intramucoso di farmaci candidati.

Recentemente, i sistemi endoscopici ad alta risoluzione per l'utilizzo in topi vivi sono stati sviluppati 3,4. Per la prima volta queste tecniche endoscopiche permettono la visualizzazione diretta delle patologie endoluminali malattie del colon, come la guarigione della ferita o l'infiammazione intestinale fornendo objstato cace, in tempo reale, consentendo studi longitudinali dello stesso animale in momenti ripetitivi. Oltre a permettere biopsie utilizzate in un individuo topo, sistemi endoscopici possono anche essere usati per influenzare terapeuticamente un tumore distinto o infiammazione localizzata permettendo applicazione diretta di una sostanza per l'area di interesse. Inoltre, come sostanze terapeutiche e di controllo possono essere consegnati direttamente alla zona di interesse, questo può essere eseguito nello stesso topo, escluse variabilità inter-individuale. Questi sistemi sono ora impiegati per la valutazione di infiammazione del colon, la guarigione delle ferite, biopsie epatiche laparoscopiche e induzione ortotopico di tumori epatici 8 e lo sviluppo del tumore utilizzando diversi sistemi di punteggio, come l'indice endoscopico murino di colite gravità (MEICS) 5-7. MEICS compone di cinque parametri per valutare l'infiammazione: ispessimento della parete del colon, i cambiamenti del pattern vascolare, presenza di fibrina, granularità dei MucosAl di superficie, consistenza e sgabello.

In questo protocollo si descrive l'uso di endoscopia rigida in modelli murini di guarigione della ferita intestinale, infiammazione e cancro del colon. In primo luogo, dimostriamo la valutazione endoscopica di guarigione della ferita e l'infiammazione del colon, nonché la valutazione longitudinale di attività colite e lo studio di cancerogenesi nel colon murino. Oltre l'uso descrittivo di endoscopia murino, forniamo istruzioni dettagliate sull'uso di strumentazione endoscopica per ottenere biopsie, e l'applicazione topica e intramucoso delle diverse componenti di interesse (ad esempio, farmaci candidati o cellule tumorali). Infine, dimostriamo l'uso di murino endoscopia fluorescenza, che si avvale di sofisticate tecniche di imaging molecolare, nella cornice dei tumori del colon-retto.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) in base alla legge sulla protezione degli animali tedesca.

1. Materiali e setup sperimentale

  1. Cura degli animali
    1. Utilizzare femminile o topi maschi di qualsiasi ceppo di peso da 20 a 25 g ed ospitarli in base alla legislazione locale la cura degli animali.
    2. Alimentare i topi con chow speciale per roditori e applicare chow senza erba medica almeno tre giorni prima di fluorescenza esami per ridurre al minimo endoluminale auto-fluorescenza.
    3. Fornire autoclavato bere acqua ad libitum.
  2. Induzione di colite acuta indotta da DSS
    1. Preparare un 3% (w / v) destrano solfato di sodio (DSS, peso molecolare: 36,000-50,000 Da) soluzione sciogliendo 3 g di DSS in 100 ml di acqua in autoclave. Offrire questa soluzione come l'acqua potabile in esclusiva ai topi ad libitum e calcolare 5 ml di soluzione al DSS-mouse / giorno. Alimentazione control topi con acqua in autoclave senza DSS ad libitum 9.
  3. Induzione del cancro del colon-retto
    1. Sciogliere azoxymethane mutagene (AOM) (ATTENZIONE! Può provocare il cancro e danni genetici!) In soluzione salina isotonica sterile per ottenere una concentrazione finale di 1 mg / ml. Applicare una dose singola di 10 mg per kg di peso corporeo AOM intra-peritoneally utilizzando una siringa da 1 ml (30 G) 10.
    2. Topi Sfide (esclusi i topi di controllo) con cicli ripetitivi del 3% (w / v) DSS dal giorno 0 a 7, da 14 a 21 giorni, giorno 28 al 35 e al giorno 42-49 per indurre infiammatoria guidato cancerogenesi del colon-retto. Alimentare i topi con acqua autoclave solo tra queste sfide (vedi Figura 4A per un calendario dettagliato). Alimentare topi di controllo con acqua autoclave tutto l'esperimento.
  4. Preparazione di fluorescenza endoscopia (FE)
    1. Utilizzare fluoresceina-Isothiocyanat (FITC) - destrano (peso molecolare 70.000 Da, FITC: Glucosio = 1: 250) per detection di adenoma del colon dal miglioramento visivo di displasia associata pattern vascolare.
    2. Somministrare 60 mg di FITC-destrano coniugato diluito in 100 ml di PBS per via endovenosa 5 minuti prima dell'esame endoscopico fluorescenza.
  5. Anestesia
    1. Fornire alimentazione isoflurano continua per l'anestesia (1,5 LO 2 / min; 1,5-2% vol isoflurano [2-cloro-2-(difluorometossi) -1,1,1-trifluoro-etano]). Utilizzare speciali apparecchiature per l'anestesia veterinario con una maschera facciale per controllare strettamente l'anestesia.
  6. Preparazione del clistere
    1. Instillare 2 ml di liquido clistere (contenuto: disodico hydrogenphosphate 1,5% (w / v) e sodio diidrogeno 11% (w / v)), nel colon, se significativo carico fecale si sospetta che possa oscurare la vista.

2 Attrezzatura tecnica

  1. Utilizzare una workstation endoscopica veterinario che è stato sviluppato e approvato per l'uso di piccoli animali endoscopia. Collegare il workstation ad una telecamera, una fonte di luce allo xeno, una pompa ad aria e ad un monitor PC convenzionale per la luce bianca endoscopia. Quindi collegare la fotocamera e il telescopio rigido in miniatura (diametro esterno 1,9 millimetri, 10 cm di lunghezza; Figura 5).
  2. Utilizzare fodero endoscopio con canale di lavoro (Figura 5D) per l'applicazione di forcipe di biopsia o tubo di iniezione. Utilizzare la guaina, senza canale di lavoro per la colonscopia diagnostica.
  3. Configurare le impostazioni della fonte di luce per fluorescenza endoscopia per eccitare traccianti utilizzati (ad esempio, 490 nm per destrano FITC-coniugato). Inoltre, l'integrazione di un filtro passa-banda adeguata tra il telescopio e la fotocamera (ad esempio, 525 nm per destrano FITC-coniugato).
  4. Inserire Pinza per biopsia flessibili (3 Charr., 28 cm) attraverso il canale di lavoro dell'endoscopio per ottenere biopsie.
  5. Introdurre il tubo flessibile di iniezione (0,96 millimetri) attraverso il canale di lavoro per uso topico, intramucoso o endoluminale unamministrazione di agenti diagnostici o terapeutici.
  6. Utilizzare un lettino riscaldante con una temperatura di 42 ° C. Questo impedisce topi diventare ipotermico durante l'esame.

3. anestesia degli animali

  1. Posizionare il mouse in un piccolo ma tenuta scatola e amministrare isoflurano (100% (v / v), 5 vol%, 3 L / min). Attendere fino a quando il mouse perde conoscenza.
  2. Trasferire il mouse sul tavolo esame per l'endoscopia. Continuare isoflurano inalazione tramite maschera facciale con una dose di 100% v / v, 1,5 vol%, 1,5 L / min. Applicare sempre unguento occhio per prevenire la secchezza oculare mentre sotto anestesia.
  3. Valutare l'efficacia dell'anestesia controllando i riflessi. Controllare il 'giro intorno riflesso': se sufficientemente anestetizzato, un mouse posa sulla sua schiena non dovrebbe girare intorno. Controllare le 'punte riflesso': quando l'anestesia è sufficiente, morbido pizzicando tra le dita dei piedi dell'animale non dovrebbe comportare la revoca delle gambe (fase ditolleranza chirurgica).

4. colonscopia

  1. Posare topo anestetizzato incline / sulla sua schiena sul lettino.
  2. Somministrare 2 ml di clistere con cannula abbottonato nel colon, se significativo carico fecale si sospetta che possa oscurare la vista. Attendere che i topi a defecare dopo somministrazione del clistere. Inserire con molta attenzione l'endoscopio per evitare la perforazione.
  3. Aprire entrambe le valvole della guaina con uno di loro essendo collegato alla pompa dell'aria. Sigillare l'altra valvola con il dito indice per erogare aria. Gonfiare colon con aria, lentamente e con attenzione, soprattutto in caso di biopsia o iniezione.
  4. Anticipo endoscopio solo per quanto riguarda il diritto di flessione del colon per evitare la perforazione (4-5 cm dall'ano).
  5. Colonscopia diagnostica
    1. Esaminare la mucosa di alterazioni infiammatorie o neoplastiche mentre si tira indietro l'endoscopio. Tirare indietro lentamente per valutare l'intera circonferenza del viscere. Valutare pa intraluminalethologies utilizzando adeguati sistemi di punteggio definiti come richiesto.
    2. Per garantire la posizione endoscopica identica per l'acquisizione di immagini durante visualizzazioni ripetitive di aree ferita, notare la distanza tra l'ano murino e la lesione della mucosa. Inoltre, utilizzare la punta della pinza biopsia come distanziatore per raggiungere la distanza identica tra l'endoscopio e la zona della ferita durante l'acquisizione dell'immagine. La dimensione della ferita è legata alla dimensione della guaina endoscopio, che include 3 mm.
      NOTA: Posizionare endoscopio in posizione identica rispetto ottica con la documentazione degli esami precedenti foto. Lesioni Misura nello stesso angolo e la distanza per ogni follow-up esame endoscopico.
  6. Procedura di biopsia
    1. Prendete biopsie con l'aiuto di due investigatori. Introdurre la pinza biopsia con attenzione attraverso il canale di lavoro fino a che la punta della pinza è visibile sul monitor alla seconda investigatore. Pinze Aprire e richiudere con cura ad unperforazione vuoto.
    2. Spostare forcipe al sito di patologia.
  7. Procedura di iniezione
    1. Eseguire la procedura di iniezione con l'aiuto di due investigatori. Pre-fill tubo flessibile di iniezione (0,96 millimetri) completamente con l'agente da somministrare. Inserire il tubo attraverso il canale di lavoro fino a quando la cannula (30 G) è visibile sul monitor alla seconda investigatore. Preparare la multa siringa e amministrare delicatamente l'importo richiesto di agente diagnostico o terapeutico. Volumi di iniezione deve essere al massimo di 50 microlitri.
    2. Inserire l'ago nel submocosa con un angolo di 15-30 gradi. Faccia lo smusso nella direzione della mucosa. La mucosa mostra un caratteristico segno di sollevamento dopo l'iniezione di successo.
  8. Fluorescenza endoscopia (FE)
    1. Somministrare 60 mg di FITC-destrano coniugato diluito in 100 ml di PBS per via endovenosa prima della fluorescenza esame endoscopico.
    2. Controllare il punto di tempo ottimale tra l'iniezione diil tuo fluorescente tracciante marcato e la procedura di imaging che dipende tracciante farmacologia. Configurare le impostazioni di sistema del filtro passa-banda in accordo alla lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione del tracciante utilizzato. Eseguire fluorescenza endoscopia per non specifici traccianti del volume di sangue (per esempio, FITC) immediatamente dopo l'iniezione endovenosa del colorante fluorescente per valutare il pattern vascolare della superficie mucosa.
    3. Consideriamo l'imaging diverse ore dopo l'applicazione tracciante nel caso di traccianti mirati o "sonde intelligenti" per offrire un bersaglio migliore per background-rapporto.
    4. Eseguire fotografie e di video-documentazione dei risultati.

5. post-colonscopia

  1. Separare il mouse in una gabbia vuota e adagiarla su un tovagliolo di carta per proteggere il mouse dalla aspirazione della cucciolata. Scaldare il mouse con una lampada a luci rosse per prevenire l'ipotermia. Osservare il mouse e non lasciare incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficientecoscienza per mantenere decubito sternale. Una volta completamente cosciente, posizionare il mouse torna alla rispettiva gabbia.
  2. Al termine dell'esperimento, posto topo in un piccolo ma ermetica scatola e amministrare CO 2 (100% (v / v), 100 vol%, 3 L / min). Attendere fino a quando il mouse perde la completa coscienza e smette di respirare. Topo spedizione da frattura del collo. Eseguire laparotomia addominale e espiantare il colon. Aprire il colon longitudinalmente e lavarlo per un'ulteriore valutazione istologica o molecolare.

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Risultati

Nel monitoraggio in vivo di intestinale guarigione delle ferite
Durante l'endoscopia di routine, le ferite della mucosa sono state indotte meccanicamente da pinze in miniatura biopsia con un diametro di 3 francese (pari a 1 mm; Figura 1A). Successivamente, la guarigione delle ferite è stata monitorata mediante esami endoscopici quotidiani e quantificato dalla misura della ferita residua utilizzando software di editing di immagini, ad esempio, ImageJ

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Discussione

Epiteliale guarigione delle ferite è un processo continuo. Esfoliazione fisiologico continuo delle cellule superficiali all'interno della mucosa gastrointestinale si verifica che richiedono la rigenerazione frequente delle cellule epiteliali 16. Di conseguenza, la guarigione della ferita ha un enorme impatto su diverse patologie tra cui le ulcere gastrointestinali e perdita anastomotica 17 18. La valutazione di sfondo molecolare così come potenziali farmaci candidati per stimolare la guarigione...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Sonja Dufentester e Elke Weber per l'assistenza tecnica di esperti. Ringraziamo Faekah Gohar per la correzione delle bozze del manoscritto e Stefan Brückner per il supporto dell'informatica medica. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione interdisciplinare dal Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A94). D. Bettenworth è stato sostenuto da una borsa di ricerca presso la Facoltà di Medicina, Westfälische Wilhelms-Universität Münster. M. Brückner è stato sostenuto da un "Gerok" posizione di rotazione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1009B8). Ringraziamo Heike Blum per l'illustrazione del cartone animato del mouse.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti
Dieta senza erba medicaHarlan Laboritories, Madison, USA2014
Azoxymethane (AOM)Sigma-Aldrich, Deisenhofen, GermaniaA5486
Unguento per gli occhi BepanthenBayer, Leverkusen, Germania80469764
Destrano solfato di sodio (DSS)TdB Consulatancy, Uppsala, SveziaDB001
EosinSigma-Aldrich, Deisenhofen, GermaniaE 4382
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Sigma-Aldrich, Deisenhofen, GermaniaE 9884
Falcon Tube 50 mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgio352070
Florene 100 V/VAbbott, Wiesbaden, GermaniaB506
EmatossilinaSigma-Aldrich, Deisenhofen, GermaniaHHS32-1L
Isopentano (2-metilbutano)Sigma-Aldrich, Deisenhofen, GermaniaM32631-1L
Blu di metileneMerck, Darmstadt, Germania1159430025
Composto O.C.T. Tissue Tek                                                                 Sakura, Zoeterwonde, Paesi Bassi4583
Omnican F - canulaBraun, Melsungen, Germania9161502
Soluzione salina tamponata con fosfato, PBSLonza, Verviers, Belgio4629
Cloruro di sodio 0,9%Braun, Melsungen, Germania12211095/05/0411
Dieta standardAltromin, Lage, Germania1320
Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Paesi Bassi4566
Vitro Coagulazione                                                                                                                            R. Langenbrinck, Teningen, Germania04-0002 
Attrezzatura
AIDA ControlKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germania20 096020
Filtro passa-bandaSemrock, Rochester, USAHC 716/40
Filtro passa-bandaSemrock, Rochester, USAHC 809/81
Pinza per biopsia, 3 Fr., 28 cmKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germania61071ZJ
Dell MonitorDell, Francoforte sul Meno, GermaniaU2412Mb
, 9 Fr.KarlStorz - Endoskope, Tuttlingen, Germania61029D
Guaina da visita, 9 Fr.KarlStorz - Endoskope, Tuttlingen, Germania61029C
Cavo luce in fibra ottica, 3.5 mmKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germania69495NL
Blu fluoresceina Sistema di filtraggioKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germania20100032
Filtro barriera alla fluoresceinaKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germania20100033
Interruttore a pedaleKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germania20010430
Telescopio HOPKINS, 1,9 mm, Lunghezza 10 cmKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germania1830231
SCB D-light P Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germania20 133720
SCB tricam SL IIKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germania20 2230 20
Set di tubi strumenti VETPUMP IIKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germania69811
Tricam PDD PALKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germania20221037
UniVet PortaGroppler Medizintechnik, Deggendorf, GermaniaBKGM 0451
Vetpump 2Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germania69321620
Guaina da visita

Riferimenti

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