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Articolo metodologico

Rapida genotipizzazione degli animali Seguito da Stabilire colture primarie di neuroni del cervello

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⸱

DOI:

10.3791/51879

⸱

29 gennaio 2015

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Psychiatry, University of Iowa Carver College of Medicine, 3EZ BioResearch LLC

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Descriviamo le procedure per l'etichettatura e la genotipizzazione topi appena nati e di generare colture neuronali primarie da loro. La genotipizzazione è rapido, efficiente ed affidabile, e consente l'estrazione automatica acidonucleico. Ciò è particolarmente utile per i mouse neonatale letali e le loro culture, che richiedono la preventiva realizzazione di genotipizzazione.

Abstract

Analisi ad alta risoluzione della morfologia e funzione dei neuroni di mammifero richiede spesso la genotipizzazione dei singoli animali seguita dall'analisi di colture primarie di neuroni. Descriviamo una serie di procedure per: etichettatura topi appena nati per essere sottoposti a genotipizzazione, rapida genotipizzazione, e stabilire le culture a bassa densità di neuroni del cervello di questi topi. Topi individuali sono etichettati da tatuaggio, che permette l'identificazione a lungo termine della durata in età adulta. La genotipizzazione del protocollo descritto è veloce ed efficiente, e consente l'estrazione automatica di acidi nucleici con buona affidabilità. Ciò è utile in circostanze in cui il tempo sufficiente per la genotipizzazione convenzionale non è disponibile, per esempio, in topi che soffrono di letalità neonatale. Colture neuronali primarie sono generati a bassa densità, che permette esperimenti di imaging ad alta risoluzione spaziale. Questo metodo di coltura richiede la preparazione di strati di alimentazione gliali prima placcatura neuronale. Il pROTOCOLLO è applicata nella sua interezza ad un modello murino della distonia disturbo del movimento DYT1 (AE-torsinA topi knock-in), e colture neuronali sono preparati dal ippocampo, corteccia cerebrale e striato di questi topi. Questo protocollo può essere applicato a topi con altre mutazioni genetiche, nonché di altre specie animali. Inoltre, i singoli componenti del protocollo possono essere utilizzati per isolati sotto-progetti. Così questo protocollo avrà applicazioni larghe, non solo nel campo delle neuroscienze, ma anche in altri settori delle scienze biologiche e mediche.

Introduzione

Modelli di roditori di malattie genetiche sono dimostrati utili per stabilire le funzioni fisiologiche di proteine ​​normali e acidi nucleici, così come le conseguenze fisiopatologiche di difetti di questi. Gli esempi includono topi deficienti per proteine ​​coinvolte in funzioni cellulari chiave, così come i modelli murini di malattie come il morbo di Alzheimer. Tuttavia, alcune manipolazioni genetiche possono portare a letalità neonatale poco o pochi giorni dopo la nascita. In questi casi, colture primarie sono uno strumento importante perché le cellule vive sono disponibili presso i cuccioli embrionali o neonatali prima della morte, possono essere mantenute per almeno un paio di settimane in vitro, e in questo periodo precoce dello sviluppo neuronale può essere seguito da esperimenti biochimici, funzionali e morfologiche. Per le colture primarie, può essere utile al piatto i neuroni a bassa densità; ciò rende possibile visualizzare il somata individuale, dendriti, alberi assonale e nervo Termisegnali ad alta risoluzione spaziale. Tuttavia, la sopravvivenza e la differenziazione dei neuroni a bassa densità richiede tipicamente che sono piastrate su uno strato alimentatore gliali, co-coltura con cellule gliali in assenza di contatto fisico con loro, o coltivati ​​in terreno condizionato dalla glia 1.

La creazione di colture neuronali bassa densità su strati di alimentazione gliali può dipendere genotipizzazione veloce e affidabile anticipo - entro poche ore a differenza di alcuni giorni. La velocità è particolarmente importante quando il genotipo neuronale deve essere abbinato a quello di uno strato alimentatore gliali preparato. Come esempio più pratico, può essere necessario decidere quali cuccioli di genotipo che da utilizzare nelle culture generano, per ottimizzare l'efficienza di un esperimento.

Qui mostriamo il protocollo di lavoro che è stato usato per un veloce, semplificato e affidabile genotipizzazione del mouse in precedenti pubblicazioni 2-6. Mouse e codeun kit disponibile in commercio vengono utilizzati. Questo protocollo comprende un'unica fase di estrazione degli acidi nucleici dal tessuto, e non richiede né una purificazione passo-acido nucleico, né l'uso di un tampone di terminazione ('fermata soluzione'). L'affidabilità di questo metodo genotipizzazione è illustrato presentando i risultati di una serie di prove in cui le differenze sono introdotte rispetto alla quantità iniziale di campioni, l'età degli animali e la lunghezza degli ampliconi PCR. Questo kit offre i vantaggi di estrazione e affidabilità automatizzato.

Per motivi di essere completa, l'uso di tatuaggi per l'identificazione a lungo termine dei topi genotipizzati è anche dimostrato. Il tatuaggio viene ottenuto applicando inchiostro tatuaggio al derma della pelle (sotto l'epidermide) 7. Una procedura è descritta per tatuaggi i cuscinetti delle zampe di topi neonati o di 1 giorno, anche se tatuaggi possono essere applicati ad altre parti del corpo, come code e dei piedi, e Animals di tutte le età. Inoltre, sarà dimostrato procedure per la placcatura e coltivando neuroni di topo a bassa densità, basato sulla preparazione ottimale di diversi tipi di strati di alimentazione gliali 2,8.

Usiamo un modello genetico del mouse della malattia neurologica ereditaria DYT1 distonia - una malattia autosomica dominante movimento causata da una mutazione nel gene TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. La proteina codificata, torsinA, appartiene alle "ATPases associati alle diverse attività cellulari" (AAA +) famiglia di proteine, i cui membri generalmente eseguire funzioni chaperone-like, che assiste in: proteine ​​unfolding, proteina-complesso smontaggio, il traffico di membrana, e la fusione delle vescicole 10-13. I risultati mutazione in un in-frame delezione di un codone dell'acido glutammico, e possono portare alla manifestazione di 'insorgenza precoce generalizzata isolato distonia' 14,15. Tuttavia, il percorsomeccanismi ophysiological responsabili di questo disturbo rimangono poco conosciuti. In un modello di topo knock-in, l'allele mutante è TOR1A tm2Wtd, citato qui di seguito come TOR1A AE. Eterozigoti AE-torsinA knock-nei topi sono pazienti umani vitali e geneticamente mimici con DYT1 distonia, mentre omozigote knock-in topi muoiono dopo la nascita 16,17, con la latenza di morte post-natale colpiti da background genetico 18. La morte precoce di omozigoti topi knock-in richiede che sia la genotipizzazione degli animali e la creazione di colture neuronali sono concluse rapidamente. Come altro esempio di genotipizzazione, Tfap2a (fattore di trascrizione AP-2α, attivando legame con le proteine ​​2α enhancer) sarà utilizzato. La proteina codificata da questo gene è importante nella regolazione più processi cellulari, quali la proliferazione, la differenziazione, la sopravvivenza e apoptosi 19.

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Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sugli animali eseguiti in questo studio sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale della University of Iowa.

Identificazione 1. a lungo termine di topi mediante tatuaggio dei cuscinetti delle zampe

  1. Immobilizzare una zampa con il pad della zampa (superficie plantare) rivolta verso lo sperimentatore. Tenere la zampa con il pollice e il dito indice. Fare attenzione a non schiacciare la zampa.
    NOTA: l'immobilizzazione Stable è importante garantire che il pigmento tatuaggio è posizionato nel derma del pad zampa, e quindi è permanente 7.
  2. Tampone il pad zampa con il 70% di etanolo su una garza o un tampone.
  3. Applicare l'olio della pelle ad un applicatore con punta di cotone, e premere delicatamente la punta contro la superficie del pad zampa più volte. Utilizzare solo una piccola quantità di olio di pelle; quando presente in grande quantità, impedisce il pigmento tatuaggio di raggiungere la pelle.
  4. Immergere le punte degli aghi per tatuaggio nell'inchiostro tatuaggio appena primaal tatuaggio. Utilizzare pulita, asettica e aghi tatuaggi appuntiti, per diminuire il dolore e la possibilità di infezione, e anche per aumentare l'efficienza tatuaggi.
  5. Mentre la superficie pad zampa è coperto con l'olio della pelle, premere punte degli aghi tatuaggio verticale e leggermente contro la pelle nel centro del pad zampa, e iniettare l'inchiostro più volte. Vedere tabella dei materiali / Attrezzature per informazioni sul sistema tatuaggio elettrico.
  6. Spray 70% di etanolo in una garza, premere delicatamente contro la zampa per rimuovere il pigmento tatuaggio in più sulla superficie della pelle, e controllare la qualità del tatuaggio. Controllare che la metà del pad zampa ha una, macchia rotonda scura che si differenzia dal normale pigmentazione della pelle. Se il tatuaggio non è scuro o abbastanza grande per una facile visualizzazione, ripetere i passaggi precedenti tatuaggi.

2. Mice genotipizzazione Newborn Utilizzando una veloce Kit PCR Genotipizzazione

  1. Disinfettare l'estremità distale di una coda di topo con il 70% di etanolo, tagliare 5 mm o meno della codapunta e trasferirlo ad un tubo di una striscia 8 tubo del tipo usato per la PCR. Utilizzare una lama di rasoio un-utilizzato per ogni cucciolo di evitare la contaminazione incrociata tra i campioni. In alternativa, utilizzare un paio di forbici, ma in questo caso, con attenzione e rimuovere completamente il tessuto rimanente sulle lame utilizzando 70% di etanolo. Verificare la presenza di sanguinamento. Se si verifica sanguinamento, applicare pressione alla porzione di taglio della coda con una garza fino sanguinamento si è fermato.
  2. Aggiungere 200 ml di DNA Extraction Solution ad ogni provetta PCR contenente un esemplare. Vedere tabella dei materiali / Attrezzature per la sua composizione e le informazioni sul kit.
  3. Posizionare la striscia tubo in un termociclatore PCR, e inizia l'estrazione del DNA utilizzando il seguente programma: 1 ciclo a 55 ° C per 10 min, 1 ciclo a 95 ° C per 10 min, e mantenimento a 4 ° C.
    NOTA: Questo è lo stesso termociclatore PCR che viene poi utilizzato per la PCR.
  4. Dopo l'estrazione del DNA, rimuovere la striscia tubo dal cycler una termicand capovolgere 5 volte.
  5. Trasferire 4 ml di soluzione (estratto di DNA) di ciascun campione di una non-utilizzato tube di una striscia a 8-tube, e mescolare con: 10 ml di 2X PCR Ready Mix II, 2 ml di misto in avanti e indietro primer (consigliato a 0,5 m; vedi tabella dei materiali / attrezzature per le sequenze), e 4 ml di priva di nucleasi H 2 O, per ogni campione. Spin brevemente (ad esempio, 3 sec) utilizzando una centrifuga da tavolo. Tenere le provette su ghiaccio in ogni momento tranne durante la manipolazione.
  6. Effettuare cicli termici. Vedere Tabella dei materiali / attrezzature per il programma termico.
  7. Rileva i prodotti di DNA amplificati. Caricare la soluzione totale reazione della PCR (20 microlitri) direttamente in un pozzetto di un gel di agarosio. Caricare i marcatori di peso molecolare in un pozzo separato. Applicare un campo elettrico.
  8. Acquisire le immagini di fluorescenza di bande sotto la luce ultravioletta.

3. Cultura primario di topo cervello Neurons su Glial Feeder livello

NOTA: Le procedure per la dissezione del cervello e la dissociazione delle cellule (3.1) sono comuni a tutte le procedure successive. Le procedure per le culture del mouse gliali (3.2), culture di ratto gliali (3.3), e colture neuronali di topo (3.4) sono descritti separatamente in seguito.

  1. Cervello Dissection e Cellular Dissocaiation
    1. Sacrifica un mouse o piccoli dei ratti per decapitazione, rimuovere rapidamente il cervello, e metterlo nella soluzione Hanks '(vedi Tabella 1 per la composizione) + 20% di siero fetale bovino (FBS) in un piatto 35 mm (tenuti in ghiaccio).
    2. Tagliare il cervello attraverso la linea mediana in due emisferi. Rimuovere la regione di interesse (ad esempio, corteccia cerebrale, striato e nell'ippocampo) da ciascun emisfero del cervello. Rimuovere le meningi e dei grandi vasi sanguigni dalla superficie. Tagliare la regione del cervello in 4-10 fette sottili con una lama chirurgica.
    3. Sciacquare le fettine di cervello in un tubo di centrifugazione 15 ml, una volta wit'soluzione + 20% FBS, poi 3 volte con il Hanks' h Hanks soluzione (cioè, senza siero) (tutti a 4 ° C). Per lavare, aggiungere la soluzione 5-10 ml, lasciare che il cervello fette depositano sul fondo della provetta, aspirare la soluzione dall'alto, e aggiungere una soluzione fresca. Terminare la procedura di lavaggio aspirando la soluzione.
    4. Filtrare 2 ml della soluzione di digestione-tripsina contenente (vedi Tabella 1 per la composizione) usando una siringa 3 ml e un filtro a siringa da 0,2 micron, e aggiungere il filtrato direttamente nel tubo contenente le fette di cervello. Lasciate che la tripsinizzazione proseguire per 13 minuti a temperatura ambiente.
    5. Neutralizzare la soluzione tripsina prima aspirando la maggior parte di esso e poi aggiungendo 7-10 ml di soluzione di Hanks '+ 20% FBS (4 ° C).
    6. Risciacquare le fette di cervello, due volte con Hanks 'soluzione + 20% FBS, e quindi tre volte con il Hanks' soluzione (ovvero senza siero) (tutti a 4 ° C). Terminare la procedura di lavaggio aspirando il solution.
    7. Filtrare 2 ml della soluzione di dissociazione (vedi Tabella 1 per la composizione) usando una siringa 3 ml e un filtro a siringa da 0,2 micron, e aggiungere il filtrato direttamente al tubo con le fette di cervello.
    8. Meccanicamente dissociare le cellule triturando delicatamente 10-20 volte, fino pezzi di tessuto visibili scompaiono. Utilizzare un cotton-collegato, incendio lucidato pipetta Pasteur e evitare di fare bolle durante la triturazione.
    9. Attendere 3 minuti per i piccoli pezzi di stabilirsi.
    10. Trasferire la maggior parte della soluzione (~ 1,5 ml, lasciando qualche soluzione in basso) ad un tubo 15 ml centrifugazione contenente soluzione FBS 3 ml di soluzione Hanks '+ 20% (4 ° C), utilizzando il cotone collegato, antincendio lucidato pipetta Pasteur. Non trasferire tutta la soluzione per l'inserimento di sedimenti sul fondo si traduce tipicamente in un deterioramento della cultura.
    11. Centrifugare per 13 min a ~ 185 g (~ 1.100 rpm) a 4 ° C.
    12. Aspirare il surnatante con delicatezza,aggiungere 1 ml di pre-riscaldato placcatura medio (37 ° C) al pellet e risospendere esso pipettando delicatamente più volte utilizzando il cotone collegato, incendio lucidato pipetta Pasteur.
      NOTA: Tre diversi tipi di placcatura media sono utilizzati per scopi culturali diversi: placcatura medio-1 per le cellule gliali del mouse, placcatura medio-2 per i neuroni di topo, e placcatura medio-3 per i neuroni di ratto e cellule gliali (vedi Tabella 1 per composizioni) .
    13. Estrarre 10 ml di sospensione cellulare, mescolare con 10 ml di 0,4% trypan soluzione blu, e misurare la densità di cellule vive, utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.
  2. Culture del mouse gliali
    1. Lavare i coprioggetti per aiutare a stabilire colture sane di cellule di topo.
      1. Immergere vetrini (tondo, diametro 12 mm) nel 70% di acido nitrico in una capsula di Petri di vetro. Proteggere dalla luce utilizzando un foglio di alluminio, e posizionarlo su un orbitale shaker O / N.
      2. Sciacquare il coversli vetrops nella capsula Petri almeno tre volte con acqua distillata. Immergerle in acqua distillata. Porre la capsula in un orbitale shaker O / N.
      3. Asciugare i coprioggetti su un Whatman 150 millimetri carta da filtro nella cappa di sicurezza biologica.
      4. Autoclave i coprioggetti.
      5. Posizionare i coprioggetti in 24 ben piatto cultura.
    2. Label e genotipo topi neonati secondo i punti 1 e 2.
    3. Ottenere le cellule cerebrali dai cuccioli di topo, secondo step 3.1.
      NOTA: L'uso della corteccia cerebrale è tipico per preparare lo strato alimentatore gliali mouse. Tuttavia, altre regioni del cervello, come l'ippocampo e striato, lavoreranno dopo una corretta regolazione della densità delle cellule a causa di diversi numeri e dei rendimenti delle cellule provenienti da diverse regioni.
    4. Aggiungere ~ 4 ml di pre-riscaldato placcatura medio-1 alla sospensione cellulare finale (~ 1 ml). Per pre-riscaldamento coltura, posizionare la soluzione nell'incubatrice coltura (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, perconsentono i valori di temperatura e di pH per stabilizzare.
    5. Trasferire la sospensione cellulare a un pallone di coltura T25 non patinata, con il cotone collegato, incendio lucidato pipetta Pasteur. Porre il pallone nell'incubatrice cultura.
    6. A 1 giorno vitro (DIV), lavare le cellule in coltura nel pallone T25 due volte con placcatura medio-1 (4 ° C). Porre il pallone nuovamente dentro l'incubatrice. Eseguire risciacquo aspirando il mezzo all'interno del pallone completamente con una pipetta Pasteur, aggiungendo ~ 5 ml di mezzo fresco e inclinando leggermente il pallone più volte in un movimento vorticoso.
    7. A 6-9 DIV, (vale a dire, un giorno prima tripsinizzazione e placcatura su vetrini, in fasi 3.2.8-3.2.13), posto a 100 ml di materiale di rivestimento con proteine ​​della matrice extracellulare (vedi Tabella dei materiali / Attrezzature per commenti su il materiale di rivestimento) sui vetrini in un piatto cultura, e posizionare il piatto cultura nell'incubatrice cultura.
    8. A 7-10 DIV, quando le cellule sono 20-40% confluenti (spazialmente continuo), li trypsinize.
      1. Risciacquare il pallone volta, aspirando tutta la soluzione nel matraccio e aggiungendo ~ 13 ml di soluzione di Hanks '(4 ° C), inclinare leggermente il pallone più volte in un moto vorticoso, e aspirare completamente la soluzione.
      2. Aggiungere 40 ml di soluzione di DNasi (concentrazione finale, 750 unità / ml) a 4 ml soluzione tripsina-EDTA, passare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron, e aggiungere il filtrato direttamente alle cellule nel matraccio.
      3. Sia la tripsinizzazione procedere per 13 min a 37 ° C in incubatore.
      4. Neutralizzare la soluzione tripsina aggiungendo 2 ml di 100% FBS (4 ° C) al pallone.
      5. Trasferire le cellule trypsinized ad un tubo 15 ml centrifugazione utilizzando un 5- 10 ml pipetta, aggiungere ~ 4 ml di soluzione di Hanks '+ 20% FBS (4 ° C), centrifugare a ~ 185 ge 4 ° C per 13 min , e aspirare il surnatante.
    9. Risospendere il pellet in 1 ml di pre-warmed placcatura medio-1.
    10. Misurare la densità delle cellule secondo la fase 3.1.13.
    11. Aspirare il materiale di rivestimento completamente dalle vetrini, e piastra ~ 50 ml di cellule gliali risospese su vetrini.
      NOTA: Queste cellule stabiliranno strato alimentatore gliali.
    12. Posizionare il piatto cultura con coprioggetto nell'incubatrice.
    13. 20-60 minuti più tardi, aggiungere 1 ml di pre-riscaldato placcatura medio-1 ad ogni bene, e mettere il piatto posteriore nell'incubatrice. Nota: Mentre viene aggiunto il mezzo di placcatura, sarà utile utilizzare un'altra pipetta per premere verso il basso la periferia del vetrino (dove non ci sono cellule piastrate), in modo che il coprioggetto non galleggiare nel mezzo.
    14. A 1 DIV dello strato alimentatore gliali (cioè sul vetrino di vetro), sostituire il mezzo con 1 ml di pre-riscaldato placcatura medio-1, aspirando tutta la soluzione in un pozzo e poi riempire con terreno fresco.
    15. A 2-3 DIV dello strato alimentatore gliali quando il cells sono 80-100% confluenti, aggiungere inibitore mitotico (10 ml di una miscela di 5-fluoro-2'-deossiuridina + uridina; concentrazioni finali di 81,2 e 204,8 mM, rispettivamente) in ciascun pozzetto, per inibire la replicazione del DNA e quindi sopprimere la proliferazione cellule gliali.
    16. A 7-9 DIV, quando le cellule sono 90-100% confluenti (1-2 hr prima placcatura neuroni sullo strato alimentatore gliali), sostituire il terreno di coltura con pre-riscaldato placcatura medio-2 (37 ° C).
      NOTA: I neuroni saranno placcato lo stesso giorno, con passo 3.4.
  3. Culture Rat gliali
    1. Coat un pallone di coltura T25 con lo stesso materiale di rivestimento.
      NOTA: Questo è necessario per la successiva rimozione delle cellule non aderenti al punto 3.3.5.
      1. Aggiungere ml 2,0 del materiale di rivestimento nel pallone, e mettere il pallone in incubatrice cultura.
      2. Dopo 2-3 ore, aspirare il materiale di rivestimento completamente, in modo che il pavimento del pallone diventa secca.
    2. Ottenere le celluledai cuccioli di ratto, in base al punto 3.1.
      NOTA: La regione CA3-CA1 dell'ippocampo viene usato per preparare lo strato alimentatore gliali di ratto. Tuttavia, altre regioni del cervello, come la corteccia cerebrale e striato, lavoreranno dopo aggiustamento per differenze di densità cellulari dovuti a diversi numeri e rese di cellule provenienti da diverse regioni.
    3. Aggiungere ~ 4 ml di pre-riscaldato placcatura medio 3 alla sospensione cellulare finale (~ 1 ml).
    4. Trasferire la sospensione cellulare nel pallone cultura T25 rivestito, utilizzando il cotone collegato, incendio lucidato pipetta Pasteur. Porre il pallone in incubatrice cultura (5% di CO 2 -95% O 2, 37 ° C).
    5. A 2-3 DIV, quando le cellule sono 20-40% confluenti, rimuovere non aderente o debolmente cellule aderenti, chiudendo il coperchio a tenuta, agitando vigorosamente ~ 10 volte, aspirando la soluzione, e aggiungendo 4-5 ml di placcatura medio-3 (a 4 ° C). Ripetere questa procedura una volta. Esaminare le cellule coltivate in tutto l'intero piano pallone (ad esempio,con microscopio a contrasto di fase) per confermare che quelle che sembrano neuronale (cioè, quelli per cui il bordo esterno del corpo cellulare appare fase luminoso) vengono completamente rimosso. Ripetere la procedura con la frequenza necessaria per eliminare queste cellule, e quindi riportare il pallone al incubatrice.
      NOTA: La forza e il numero totale di "shakes" necessarie possono differire tra i singoli sperimentatori. La cosa importante è non mantenere il numero totale di frullati ad un numero fisso, ma per confermare che le cellule neuronali-simili sono eliminati.
    6. A 6-8 DIV, quando le cellule sono 90-100% confluenti, il passaggio delle cellule gliali di loro trypsinizing come al punto 3.2.8.
    7. Dopo centrifugazione, risospendere il pellet in 1 ml di placcatura medio-3 (4 ° C), aggiungere 10 ml di placcatura medio-3 (4 ° C), trasferire le cellule trypsinized a un pallone T75 un-rivestito, e cultura l'incubatore.
      NOTA: le cellule gliali di ratto saranno diversi passaggi due volte; in contrasto con le cellule gliali del mouse are diversi passaggi solo una volta perché diventano malsano dopo più passaggi. Cellule Rat gliali saranno diversi passaggi in fiasche T75 non rivestiti con qualsiasi materiale di rivestimento. Il rivestimento permette alle cellule di ratto gliali a crescere troppo in fretta e producono molte cellule ciliate (putativi cellule ependimali), che deteriorano la condizione cultura neuronale tardi.
    8. A 17-19 DIV della cultura gliali in una beuta (cioè, 11 giorni dopo passaging e un giorno prima tripsinizzazione e placcatura su coprioggetto da gradini 3.3.9-3.3.14), posizionare 100 ml di materiale di rivestimento su vetrini lavate ( tondo, diametro 12 mm) in un piatto di cultura, e posizionare il piatto cultura nell'incubatrice cultura.
      NOTA: Per le culture gliali di ratto, la differenza non è stata notata nei risultati della coltura, con o senza lavare i coprioggetti.
    9. A 18-20 DIV della cultura gliali in un pallone (cioè 12 giorni dopo passaging), preparare lo strato alimentatore gliali dalle trypsinizing cellule coltivate, secondo step 3.2.8.
    10. Durante la centrifugazione, aspirare il materiale di rivestimento completamente dalle vetrini.
    11. Dopo centrifugazione, risospendere il pellet in 1 ml di placcatura medio-3 (4 ° C), e misurare la densità cellulare, secondo la fase 3.1.13.
    12. Regolare la densità gliali a 10 4 vivo cellule / ml, e piastra 100 microlitri della sospensione cellulare gliale sui vetrini rivestiti.
      NOTA: Queste cellule stabiliranno strato alimentatore gliali.
    13. Posizionare il piatto cultura con lamelle in incubatore per 20-60 min.
    14. Aggiungere 1 ml di placcatura medio-3 (4 ° C) per ciascun bene, e mettere il piatto posteriore nell'incubatrice.
    15. A 3-4 DIV dello strato alimentatore gliali, quando le cellule sul vetrino sono 40-80% confluenti, aggiungere 1 ml di mezzo di crescita pre-riscaldato (vedi Tabella 1 per la composizione) che contiene citosina β-D-arabinofuranoside ( AraC, concentrazione finale di 4 micron) per arrestare la proliferazione gliale cellule. Piastra neurones a 7-9 DIV dello strato alimentatore gliali quando le cellule sono 60-80% confluenti, usando passo 3.4.
  4. Culture del mouse neuronali
    1. Label e genotipo topi neonati secondo i punti 1 e 2.
    2. Utilizzare i cuccioli di topo per passo 3.1.
    3. Regolare la densità della sospensione live-cell a ~ 2,0 x 10 5 cellule / ml utilizzando preriscaldata placcatura medio-2 per la placcatura sulle cellule gliali del mouse, o mediante placcatura medio-3 per la placcatura sulle cellule gliali di ratto.
    4. Piastra le cellule sullo strato alimentatore gliali, aggiungendo delicatamente la sospensione cellulare al mezzo di coltura di ogni pozzetto. Nota: Il volume della sospensione cellulare da aggiungere sarà determinato dal numero di celle di destinazione in una cultura ben. Ad esempio, piastra ~ 60 ml di sospensione cellulare per raggiungere 12.000 cellule / pozzetto.
    5. Si noti che nessuna modifica soluzione sono necessari dopo che i neuroni sono placcati. Fare attenzione per evitare l'evaporazione della soluzione dai pozzetti nel corso della coltura, da umidificazione o all'internof incubatore cultura.

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Risultati

Come esempio di applicazione di questo protocollo, risultati rappresentativi sono mostrati per etichettare topi tatuaggi, genotipizzazione affidabile in varie condizioni sperimentali, e stabilendo colture neuronali primarie su strati di alimentazione gliali.

Tatuaggio

Cuccioli appena nati sono stati etichettati sui cuscinetti delle zampe utilizzando un sistema tatuaggi ('Newborn' in Figura 1). Le etichette sono rimasti chiarament...

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Discussione

Il protocollo presentato qui comprende procedure per tatuaggi per etichettare / individuare i topi, per la genotipizzazione topi da punte di coda, e per la coltura neuroni del cervello del mouse a bassa densità. In un giro di esperimenti usando 6-8 cuccioli, queste procedure richiedono tipicamente ~ 0,5 ore, ~ 4 ore e ~ 2 ore, rispettivamente, per un totale di 6-7 ore. Questo rende pratico per un singolo sperimentatore per completare tutte le procedure necessarie dal momento della nascita i cuccioli 'del fasciame di...

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Dichiarazioni

L'autore (Zhengmin Huang) è il presidente di EZ BioResearch LLC che produce i reagenti descritti in questo articolo.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano i ricercatori dell'Università dell'Iowa, i dottori Luis Tecedor, Ines Martins e Beverly Davidson per le istruzioni e i commenti utili riguardanti le colture striatali, e i dottori Kara Gordon, Nicole Bode e Pedro Gonzalez-Alegre per l'assistenza e le discussioni sulla genotipizzazione. Ringraziamo anche il Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) per gli utili commenti riguardanti il tatuaggio, e il Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) per gli utili commenti riguardanti la cultura del topo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'American Heart Association, del Dipartimento della Difesa (premio Peer Reviewed Medical Research Program W81XWH-14-1-0301), della Dystonia Medical Research Foundation, della Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, della National Science Foundation e della Whitehall Foundation (NCH).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
REAGENTI - Macchina per
DetergenteIdentificazione e marcatura degli animali Systems, Inc.NMCR3Viene utilizzato per pulire gli aghi e il supporto dopo il tatuaggio.
Agente essiccante a macchinaSistemi di identificazione e marcatura degli animali, Inc.NDAR4Viene utilizzato per asciugare gli aghi e il supporto dopo la pulizia.
Neonato Tatuaggio Pigmento NeroAnimale Identificazione E Sistemi Di Marcatura, Inc.NBP01
Applicatore per la preparazione della pelleSistemi di identificazione e marcatura degli animali, Inc.NSPA1Q-tip.
Soluzione per la preparazione della pelleAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSP01Questo reagente rilascia un sottile strato di olio che migliora l'efficienza del tatuaggio e previene lo sbiadimento del tatuaggio, (informazioni dal venditore): 1) impedendo che la pelle non tatuata venga macchiata temporaneamente, consentendo così di valutare facilmente la qualità di un tatuaggio del cuscinetto della zampa prima che il cucciolo venga restituito alla sua gabbia di casa - la superficie della pelle macchiata può essere confusa con la pelle tatuata, 2) riducendo il danno alla pelle durante il tatuaggio... Ammorbidire la pelle e lubrificare l'ago aiuterà l'ago a penetrare nella pelle senza causare danni alla pelle e 3) impedirà all'ossigeno molecolare di entrare nella pelle, riducendo così le risposte infiammatorie alle specie reattive dell'ossigeno che possono essere generate.
REAGENTI - genotipizzazione
Kit di genotipizzazione EZ Fast Tissue/Tail PCR (formato provetta a strisce)EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-100Nella soluzione 2X PCR Ready Mix è incluso un colorante rosso di caricamento per l'elettroforesi.
Soluzione di lisi tissutale AEZ BioResearch LLCG2001-100Preparare la soluzione di estrazione del DNA mescolando 20 e micro; l di soluzione di lisi tissutale A e 180 µ l di soluzione di lisi tissutale B per campione.
Soluzione di lisi tissutale BEZ BioResearch LLCG2001-100Preparare la soluzione di estrazione del DNA mescolando 20 & micro; l di soluzione di lisi tissutale A e 180 µ l di soluzione di lisi tissutale B per campione.
Acido acetico, glacialeVWRBDH 3092
Agarosio grado ottimizzato, grado di biologia molecolarerpiA20090-500 Utilizziamo gel di agarosio al 2% in tampone TAE contenente il colorante gel SYBR Safe DNA (diluito 10.000 volte) o bromuro di etidio (0,5 & micro; g/ml di volume del gel).
Bromuro di etidioSigma-AldrichE7637-1G
Acido etilendiammina tetraacetico, sale disodico diidrato (EDTA)FisherBP120-500
Punte per pipette filtrate, senza aerosol, 0,1-10 e micro; lDot Scientific IncUG104-96RS Utilizzare puntali per pipette sterili e privi di DNA, RNasi e DNasi. Per tutte le fasi che coinvolgono il DNA, utilizzare puntali per pipette filtrati per evitare la contaminazione incrociata.
Punte per pipette filtrate, punte per filtri Premium Fit, 0,5-20 e micro; lDot Scientific IncUG2020-RSUtilizzare puntali per pipette sterili e privi di DNA, RNasi e DNasi. Per tutte le fasi che coinvolgono il DNA, utilizzare puntali per pipette filtrati per evitare la contaminazione incrociata.
Puntali per pipette filtrati, puntali filtranti Premium Fit, 1-200 &; lDot Scientific IncUG2812-RSUtilizzare puntali per pipette sterili e privi di DNA, RNasi e DNasi. Per tutte le fasi che coinvolgono il DNA, utilizzare puntali per pipette filtrati per evitare la contaminazione incrociata.
Marcatore di peso molecolare, EZ DNA Even Ladders 100 bpEZ BioResearch LLCL1001Utilizziamo uno di questi tre marcatori di peso molecolare.
Marcatore di peso molecolare, EZ DNA Even Ladders 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
Marcatore di peso molecolare, TrackIt, 100 bp DNA LadderGIBCO-Invitrogen10488-058
Provette per PCR, 8 strisce di provette con tappi superiori a cupola fissati singolarmente, naturale, 0,2 ml USA Scientific1402-2900Utilizzare provette sterili e prive di DNA, RNasi e DNasi. Una striscia da 8 provette è facile da maneggiare e da raggruppare i campioni rispetto ai singoli tubi.
Provette per PCR, Ultraflux Individual rpi145660Utilizzare provette sterili e prive di DNA, RNasi e DNasi.
Provetta per microcentrifuga Seal-Rite da 0,5 ml, naturaleUSA Scientific1605-0000Utilizzare provette sterili e prive di DNA, RNasi e DNasi.
SYBR Safe DNA gel stainin * 10.000x concentrazione in DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris baserpiT60040-1000
Primer per amplificare il gene Tor1a in Δ Topi knock-in E-torsinA Questi primer sono stati utilizzati a una concentrazione finale di 1,0 ng/µ l (~0,16 µ M) (riferimento 2).
Primer per l'amplificazione del gene Tfap2a in topi wild-type:5'-GAA, AGG, TGT, AGG, CAG, AAG, TTT, GTC, AGG, GC-3' (avanti), 5'-CGT, GTG, GCT, GTT, GGG, GTT, GCT, GAG, GTA-3' (inverso) per l'amplicone da 498 bp, 5'-CAC, CCT, ATC, AGG, GGA, GGA, CAA, CTT, TCG-3' (in avanti), 5'-AGA, CAC, TCG, GGC, TTT, GAT, GAT, CAT, TC-3' (inverso) per l'amplicone da 983 bp, e 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (avanti), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (retro) per l'amplicone da 1990 bp. Questi primer vengono utilizzati a 0,5 µM.
REAGENTI - colture
5-Fluoro-2′-deossiuridinaSigma-AldrichF0503-100MGVedere la sezione commenti di uridina per ulteriori informazioni.
Integratore B-27GIBCO-Invitrogen17504-044
Piastre per colture cellulari 35 x 10 mm,353001falco
tissutale, T25, trattato per colture tissutali, collo inclinato, tappo a tappo, 25 cm2 Area di crescita, 70 mldi 353082
BD falconFiasche per colture cellulari, T75, trattate per coltura tissutale, collo inclinato, tappo ventilato, 75 cm2 Area di crescita, 250 mlBD falcon353136
tubo conico, polipropilene, 15 mlBD falcon352095
Countess (contatore del numero di cellule) vetrini per cameraGIBCO-InvitrogenC10312
Citosina β-D-Arabinofuranoside cloridrato (Ara-C cloridrato)Sigma-AldrichC6645-100mg
D-(+)-Glucosio (Destrosio) anidro, SigmaUltra, 99,5% (GC)Sigma-AldrichG7528-250G
Piatto, vetro Petri 100 x 15 mmPyrex3160-101
Acqua distillataGIBCO-Invitrogen15230-147
DNasi Tipo IISigma-AldrichD4527-200KULa soluzione madre è preparata a 1.500 unità/20 μ l = 75.000 unità/ml in acqua distillata.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alto glucosio, GlutaMAX, piruvatoGIBCO-Invitrogen10569-010,
, 250 ml, membrana diametro 50 mm, 0,2 e micro; m Dimensione dei poriNalgene568-0020
Unità filtrante PES veloce, 500 ml, membrana diametro 90 mm, 0,2 & micro; m Dimensione dei poriNalgene569-0020
Siero fetale bovino (FBS)GIBCO-Invitrogen26140-079
Vetrino coprioggetti, 12 mm rotondo, spessore 0,09– 0,12 mm, n. 0Carolina633017
GlutaMAX-IGIBCO-Invitrogen35050-061
Sali bilanciati di HanksSigma-AldrichH2387-10X
HEPES, ≥ 99,5% (titolazione)Sigma-AldrichH3375-250G
Acido cloridrico, 37%, reagente A.C.S.Sigma-Aldrich258148-100 ML
InsulinaSigma-AldrichI5500-250 mg
Solfato di magnesio eptaidrato, MgSO4•( 7H2O), BioUltra, ≥ 99,5% (Fluka)Sigma-Aldrich63138-250G
Soluzione di matrice di membrana basamentale Matrigel, senza rosso fenoloBD Biosciences356237Questo è il materiale di rivestimento per vetrini coprioggetti e fiasche. 1) Per prepararlo, scongelare la soluzione di matrice di membrana basale Matrigel su ghiaccio, che di solito richiede ~ 1 giorno. Utilizzando una pipetta preraffreddata, aliquotare la soluzione scongelata in palloni di T25 preraffreddati su ghiaccio e conservare i palloni a -20 °C. Per preparare la soluzione di Matrigel funzionante, scongelare il Matrigel aliquotato in un pallone su ghiaccio, diluire 50 volte aggiungendo una soluzione MEM preraffreddata e mantenere la soluzione diluita a 4 °C. È importante pre-raffreddare tutti i materiali di coltura e i terreni che entrano in contatto con Matrigel, tranne durante e dopo il rivestimento dei vetrini, per evitare che si formi prematuramente un gel. 2) Per rivestire i vetrini coprioggetti o i palloni di coltura con Matrigel, applicare la soluzione Matrigel sulla superficie. Prima di placcare le celle, è importante asciugare completamente la superficie. A questo scopo, potrebbe essere utile aspirare Matrigel durante la centrifugazione cellulare immediatamente prima di placcare le cellule e lasciare abbastanza tempo per l'essiccazione.
Terreno minimo essenziale (MEM)GIBCO-Invitrogen51200-038
Estensore di siero MITO+, 5 mldi piastre multipozzetto BD Biosciences355006
, piastra a 24 pozzetti trattata con coltura tissutaleBD falcon353047
piastre multipozzetto, piastra a 6 pozzetti trattata con coltura tissutaleBD falcon353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquidoGIBCO-Invitrogen10888-022
Acido nitricoVWRbdh 3044
NS (integratore neuronale) 21 preparato in laboratorioFonte: referenza 69
pipette Pasteur, 5 ¾ ”  Fisher13-678-6AUsa questo tappo in cotone 5 ¾ ” Pipetta Pasteur per triturazione cellulare. Lucidare preventivamente la punta a fuoco per levigare la superficie di taglio e ridurre il diametro interno al 50-80% dell'originale. Una punta troppo piccola distruggerà le cellule e ridurrà la vitalità cellulare, ma una punta troppo grande diminuirà l'efficienza della triturazione.
Pipette Pasteur, 9"  Fisher13-678-6B
Cloruro di potassio (KCl), SigmaUltra, ≥ 99,0%Sigma-AldrichP9333-500G
, 2 mlBD falcon357507
Pipetta sierologica, 5 ml BD falcon357543
Pipetta sierologica, 10 mlBD falcon357551
Pipetta sierologica, 25 mlBD falcon357525
Pipetta sierologica, 50 ml BD falcon357550
Bicarbonato di sodio (NaHCO3, carbonato acido di sodio), SigmaUltra, ≥ 99,5%Sigma-AldrichS6297-250G
Cloruro di sodio (NaCl), SigmaUltra, ≥ 99,5%Sigma-AldrichS7653-250G
Idrossido di sodio (NaOH), pellet, 99,998% di metalli in tracceSigma-Aldrich480878-250G
Fosfato di sodio bibasico eptaidrato (Na2HPO4•( 7H2O)), ≥ 99,99%, AldrichSigma-Aldrich431478-250G
Saccarosio, SigmaUltra, ≥ 99,5% (GC)Sigma-AldrichS7903-250G
Filtro per siringa, sterile, 0,2 & micro; mCorning431219
Siringa, 3 mlfalcon309585
Transferrina, Holo, plasma bovinoCalbiochem616420
Trypan Blue color, 0,4%GIBCO-InvitrogenT10282Questo viene utilizzato per contare le cellule vive/morte. Rinnovare una vecchia soluzione di blu di tripano se viene riutilizzata molte volte (ad es più volte alla settimana per diverse settimane), perché formerà precipitati e risulterà in letture errate della densità cellulare.
Tripsina, tipo XISigma-AldrichT1005-5G
Soluzione di tripsina-EDTA, 0,25% GIBCO-Invitrogen25200-056
UridinaSigma-AldrichU3003-5GLa soluzione madre è preparata a 50 mg di 5-fluoro-2'-deossiuridina e 125 mg di uridina in 25 ml di DMEM (8,12 e 20,48 mM, rispettivamente).
REAGENTI - immunocitochimica
Anticorpo, coniglio policlonale anti-MAP2Merck MilliporeAB5622
Anticorpo, topo monoclonale anti-GFAPcocktail Merck MilliporeNE1015
ATTREZZATURA - tatuaggio
AIMSAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NEO– 9Questo sistema di tatuaggio per neonati è un sistema elettrico che funziona spostando rapidamente gli aghi per tatuaggi a 1 o 3 punti verticalmente nella pelle. Attiva la macchinetta per tatuaggi una volta per circa 0,5 secondi, mentre le punte dell'ago per tatuaggi vengono mantenute perpendicolari alla superficie della pelle. Preferiamo il tatuaggio a tre aghi per massimizzare l'area tatuata, ma il tatuaggio a un ago è efficace su aree più strette, ad esempio le dita dei piedi, o se è necessario un controllo meccanico fine, ad es quando vengono tatuati i numeri. Due cicli di tatuaggio alla velocità più bassa (impostando "1" su 3 passaggi) sono in genere sufficienti per produrre un tatuaggio visibile e duraturo dei cuscinetti delle zampe.
ATTREZZATURA - genotipizzazione
Sistema di elettroforesi, orizzontale, Wide Mini– Sottocella GTBIO– RAD170– 4405I parametri tipici dell'elettroforesi sono l'intensità del campo elettrico a 6 V/cm e la durata di 25 minuti per un gel di 10 cm.
FluorChem 8800ProteinSimpleFluorChem 8800
PCR, MJ Mini TermociclatoreBIO-RADPTC-1148EDULe nostre reazioni PCR per il gene Tor1a in Δ I topi knock-in E-torsinA sono i seguenti: 1 ciclo di denaturazione a 94 ° C per 3 min, 35 cicli di denaturazione a 94 ° C per 30 sec, ricottura a 58 ° C per 30 sec, estensione a 72 ° C per 2 min. Segue l'estensione finale a 72 ° C per 10 min, e tenendo premuto a 4 °C.
Alimentazione, PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
ATTREZZATURA - coltura
Contatore di cellule automatizzato, CountessGIBCO-InvitrogenC10310Questo contatore di cellule automatizzato misura separatamente la densità delle cellule vive e morte (non colorate e colorate con blu di tripano, rispettivamente). È importante conoscere l'intervallo ottimale di misure di densità: il contatore che utilizziamo ha la massima precisione nell'intervallo da 1 x 105 a 4 x 106 cellule/ml. Se i valori di densità delle celle misurati non rientrano nell'intervallo consigliato, regolare il volume di risospensione in modo appropriato.
Cabina di sicurezza biologica, Classe II, Tipo A2NUAIRENU-425-400Questa cappa viene utilizzata per tutte le procedure di coltura cellulare, ad eccezione della dissezione cerebrale.
CO2 Incubatore, AutoFlow, controllo dell'umidità Camicia d'acquaNUAIRENU-4850
Banco pulito orizzontaleNUAIRENU-201-330Questo banco pulito viene utilizzato per la dissezione cerebrale (passaggi 3.1.1 e 3.1.2 di "Dissezione cerebrale e dissociazione cellulare)".
Orbit LS Agitatore a bassa velocitàLabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Centrifuga SuperspeedFisher46910 (centrifuga)/46922 (rotore)
tatuaggi 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CC-3' (avanti) e 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (riferimento 18).cellulari fiasche per colture cellulari trattato con coltura unità filtrante Fast PES da 500 mlPipetta sierologica BD cellulare

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